Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-07-26T17:19:21Z No. of bitstreams: 1 elisangela_m_santos_ioc_bp_0050_2011.pdf: 758127 bytes, checksum: fbb2b054e3450c2d88a88136ab8e9a93 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-26T17:19:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 elisangela_m_santos_ioc_bp_0050_2011.pdf: 758127 bytes, checksum: fbb2b054e3450c2d88a88136ab8e9a93 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / As leishmanioses formam um grupo de doenças que afetam 350 milhões de pessoas atualmente, atingindo 88 países em todo o mundo com uma estimativa de 1-2 milhões de novos casos por ano. O desfecho da infecção causada por Leishmania depende tanto de fatores do patógeno como do hospedeiro, embora a virulência de Leishmania possa ser modulada por fatores ambientais e genéticos relacionados aos hospedeiros mamíferos e vetores, os determinantes moleculares são elementos-chave no estabelecimento da infecção, ou seja, são os fatores que determinam a virulência. A KMP-11 é uma glicoproteína que está presente em todos os cinetoplastideos. O presente estudo avaliou a expressão do gene de KMP-11 de L. amazonensis ao nível de RNA e ao nível de proteína, durante passagens sucessivas de promastigotas de fase estacionária através de cultivo in vitro, investigando se há associação entre a sua expressão e a virulência dos parasitos. A avaliação da virulência dos parasitos mantidos em cultura foi realizada através do acompanhamento da evolução da infecção experimental murina (modelo in vivo) durante um período de dez semanas, juntamente com a observação do surgimento de ulceração. A quantificação da carga parasitária foi realizada nos linfonodos drenantes das lesões, através da através da técnica de diluição limitante A avaliação também foi realizada pela infecção de macrófagos murinos (modelo in vitro). Os resultados de medição de pata foram analisados pelo teste não paramétrico ANOVA 2 fatores, seguido do pós-teste de Bonferroni. Além disso, foi realizada a determinação da proporção de metacíclicas nos promastigotas de fase estacionária mantidos em cultura, através da técnica de lise pelo complemento. Nossos resultados mostraram que há um decréscimo da virulência dos promastigotas de fase estacionária ao longo do número de passagens, pois os camundongos infectados com as passagens iniciais desenvolveram lesões maiores do que aqueles com os promastigotas mantidos em cultura por mais tempo. Quanto ao surgimento de ulcerações, na 10a semana pós-infecção, todos os animais infectados com promastigotas de 1a passagem apresentavam lesões ulceradas, enquanto que nenhum dos camundongos infectados com promastigotas de 20a passagem apresentava lesão ulcerada. Na infecção in vitro, a carga parasitária nos macrófagos testados diminuiu em função do número das subculturas, o que foi demonstrado através do decréscimo da porcentagem média de macrófagos infectados e pela quantidade média de amastigotas a cada 100 macrófagos infectados. A quantificação da carga parasitária foi realizada nos linfonodos drenantes da lesão dos camundongos infectados, confirmando a diminuição da virulência dos promastigotas. A quantificação da proporção de promastigotas metacíclicas demonstrou que a porcentagem diminui ao longo do tempo de subcultivo. A avaliação da expressão de KMP-11 na superfície de promastigotas por citometria de fluxo demonstrou um decréscimo na expressão da proteína proporcional ao número de subculturas. Verificou-se, portanto, uma associação entre a expressão da proteína KMP-11 e a virulência de promastigotas de L. amazonensis. Os resultados dos ensaios de PCR em tempo real demonstraram que não há diferença estatisticamente significativa na quantidade de transcritos do gene da proteína KMP-11 entre as passagens analisadas. Entretanto, a perda da virulência associada com a diminuição da expressão da proteína KMP-11 indica que esta molécula possua uma função na infectividade dos promastigotas de Leishmania amazonensis, atuando possivelmente como um fator de virulência. / The leishmaniases are a group of diseases that currently, affects 350 million people reaching 88 countries throughout world with an estimated incidence of 1-2 million new cases per year. The outcome of the infection caused by Leishmania depends on factors from the pathogen and from the host. Although Leishmania virulence can be modulated by environmental and genetic factors related to mammalian hosts and vectors, molecular determinants are key elements in the establishment of infection and for the determination, of virulence. KMP-11 is a glycoprotein which is present in all kinetoplastids. This study evaluated the gene expression of KMP-11 in L. amazonensis at RNA level and at protein level, during successive passages of in vitro culture, investigating a possible correlation between KMP-11 expression and virulence of parasites. The evaluation of the virulence of cultured parasites was performed by monitoring of the progression of the lesions in experimental murine infection (in vivo model) during ten weeks, along with the emergence of cutaneous ulcers. The quantification of parasite load was performed on draining lymph nodes using the limiting dilution analysis. The assessment of parasite virulence was also performed by the infection of murine macrophages (in vitro model). The paw measurement results were analyzed by nonparametric test ANOVA 2 way, followed by Bonferroni post-test. Furthermore, the metacyclic promastigotes proportion in stationary growth phase from cultures with different numbers of passages was evaluated by complement lysis. Our results showed a decrease in promastigotes of stationary phase virulence that correlated with the increase of the number of passages, as mice infected with the early passages developed larger lesions than those infected with promastigotes cultured for longer periods and higher numbers of passages. Concerning the development of ulcers, at 10th week post-infection, all animals infected with promastigotes of first passage presented ulcerated lesions, whereas none of the mice infected mice with promastigotes of the 20th passage showed an ulcerated lesion. Analyzing the in vitro infection, the parasite burden in macrophages decreased with the number of subcultures, as demonstrated by the decrease in the percentage of infected macrophages and in the number of amastigotes per 100 infected macrophages. The quantification of parasites in draining lymph nodes of the infected mice confirmed the decrease in the virulence of promastigotes from cultures with more passages. The estimation of the metacyclic promastigote proportions showed that the percentages decline through the time of subculture. The evaluation of KMP-11 expression on the surface of promastigotes by flow cytometry showed a decrease in protein expression proportional to the number of subcultures. Therefore, there was an association between the expression of KMP-11 protein and the virulence of L. amazonensis promastigotes. The results of real-time PCR assays showed that there is no statistically significant difference in the amount of gene transcripts of KMP-11 protein in the analyzed passages. However, the loss of virulence associated with decreased protein expression of KMP-11 indicates that this molecule may have a role in promastigotes infectivity of Leishmania amazonensis, possibly acting as a virulence factor.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-09-19T13:39:08Z No. of bitstreams: 1 renato_s_junior_ioc_bp_0048_2011.pdf: 2131023 bytes, checksum: c67826382b4b8b6c00b329a3f8c712d2 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-19T13:39:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 renato_s_junior_ioc_bp_0048_2011.pdf: 2131023 bytes, checksum: c67826382b4b8b6c00b329a3f8c712d2 (MD5) Previous issue date: 2011 / Universidade Federal Fluminense. Centro de Estudos Gerais. Instituto de Biologia. Niteroi, RJ, Brasil / A família Trypanosomatidae inclui parasitas de uma grande variedade de vertebrados, invertebrados (principalmente insetos), plantas e algumas espécies de protozoários, sendo, depois do nematóides, os de maior distribuição de hospedeiros na natureza. No presente trabalho, um novo isolado foi obtido por coprocultivo de trato intestinal de Leptoglossus stigma Herb, 1784 (Hemiptera, Coreidae), capturado no município de Itaguaí/RJ. O isolado original e três clones (obtidos por citometria de fluxo) foram depositados na "Coleção de Flagelados do Laboratório de Transmissores de Leishmanioses." Um clone foi caracterizado por diversas abordagens em comparação com espécies de referência de diferentes gêneros. Foi analisado o crescimento em meio de cultivo em intervalos de 24 h, entre 48-144 h, a diferenciação celular e a morfometria dos principais estágios evolutivos encontrados. A análise de isoenzimas foi realizada utilizando-se os seguintes sistemas: GPI, PGM, 6PGDH, HK, ACON, MPI, FUM, IDH, MDH e ACON. RAPD-PCR foi realizado utilizando-se 6 iniciadores, conjuntamente com outros tripanosomatídeos. Os dados destas análises foram processados numericamente e submetidos à análise computacional utilizando-se o coeficiente de associação Jaccard e o algoritmo de agrupamento UPGMA. Realizou-se seqüenciamento do amplicon do gene de SSU rRNA e o fragmento analisado foi alinhado com vinte e uma seqüencias depositadas no GenBank, gerando uma árvore filogenética resultante do pareamento. O conjunto de resultados deste trabalho sugere que a amostra obtida constitui nova espécie, pertencendo a um novo gênero, nomeada Vickermania itaguaiensis. / The Trypanosomatidae family includes parasites of a wide variety of vertebrates, invertebrates (mainly insects), plants and some species of protozoa, and after the nematodes, the highest distribution of hosts in nature. In this study, an isolate was obtained by coproculture from Leptoglossus stigma Herb, 1784 (Hemiptera, Coreidae) intestinal tract, captured in the city of Itaguaí/RJ. The original isolate and clones (obtained by flow cytometry) were deposited in the "Coleção de Flagelados do Laboratório de Transmissores de Leishmaniose". One clone was characterized by several approaches in comparison with the reference species of different genus. Growth was analyzed in culture medium at 24 h intervals between 48-144 h, cell differentiation and morphometric parameters of the main evolutionary stages matches. The isoenzyme analysis was performed using the following systems: GPI, PGM, 6PGDH, HK, ACON, MPI, FUM, IDH, MDH and ACON. RAPD-PCR was performed using 6 primers, together with other trypanosomatids. The analysis of these data were numerically processed and submitted to computer analysis using the Jaccard association coefficient and UPGMA clustering algorithm. We carried out sequencing of the amplicon from SSU rRNA gene and the fragment analyzed was aligned with twenty-one sequences deposited in GenBank, generating a phylogenetic tree resulting from the pairing. The result set of this work suggests that the sample obtained represents a new species belonging to a new genus, named Vickermania itaguaiensis.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-09-28T14:29:18Z No. of bitstreams: 1 juliana_h_s_barros_ipec_pesquisaclinicadi_0006_2009.pdf: 1430332 bytes, checksum: 636da38d82df84b03291443dfdf250b2 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-28T14:29:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 juliana_h_s_barros_ipec_pesquisaclinicadi_0006_2009.pdf: 1430332 bytes, checksum: 636da38d82df84b03291443dfdf250b2 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os morcegos são mamíferos pertencentes à ordem dos Quirópteros. São animais que possuem hábitos alimentares bastante diversificados, apresentando espécies importantes no equilíbrio e diversidade biológica das espécies vegetais, como também atuantes na transmissão de doenças para o homem e para os animais. No município do Rio de Janei- ro, pouco se conhece sobre a ocorrência de tripanosomatídeos, nem tampouco sobre a possibilidade da participação desses animais no ciclo de transmissão de certos tripano- somas. Este trabalho objetivou avaliar, por hemocultura, a infecção natural por flagela- dos tripanosomatídeos em morcegos capturados em diferentes municípios do Estado do Rio de Janeiro e caracterizar os isolados obtidos quanto à sensibilidade ao sistema com- plemento; potencial infectivo para macrófagos murinos “in vitro”; potencial infectivo para Triatoma infestans e análise do perfil isoenzimático (MLEE). Durante o estudo, flagelados tripanosomatídeos foram encontrados em 29 (30,2%) dos 96 morcegos avali- ados, dos quais 28 possuíam hábitos hematófagos (D. rotundus) e 1 hábito insetívoro (Lonchorhina aurita), capturados em diferentes municípios do estado do Rio de Janeiro. Das amostras isoladas, 12 foram selecionadas para estudos de caracterização, todas, apresentando padrões biológicos semelhantes, todas sendo sensíveis ao sistema com- plemento, apresentando 100% de lise das formas epimastigotas; não foram capazes de infectar macrófagos murinos “in vitro” nem tampouco puderam infectar e colonizar glândulas salivares, hemolinfa e o trato intestinal de Triatoma infestans. Na análise iso- enzimática, avaliado por 9 loci, três zimodemas foram observados, todos, diferentes das amostras de referências Trypanosoma cruzi, Trypansoma rangeli e Trypanosoma des- terrrensis, empregadas nesta análise. Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que flagelados do gênero Trypanosoma podem ser isolados de morcegos com diferentes hábitos alimentares no estado do Rio de Janeiro e embora nenhuma amostra tenha sido identificada como Trypanosoma cruzi, Trypanosoma rangeli ou Trypanosoma dester- rensis, observou-se três padrões fenotípicos distintos entre as doze amostras estudadas. Espera-se, dessa forma, contribuir para as ações de vigilância a partir do conhecimento das espécies de tripanosomatideos circulantes em morcegos do Estado do Rio de Janei- ro. / Bats are mammals belonging to the order Chiroptera. These animals have very different alimentary habits, several species being important in the balance and biological diver- sity of plant species, as well as being active in the transmission of diseases to man and to animals. In the state of Rio de Janeiro, little is known about the occurrence of try- panosomatids, neither the possibility of participation of these animals in the cycle of transmission of certain trypanosomes. This study aimed at the evaluation of the natural infection by flagellates trypanosomatids in bats captured in different municipalities in the state of Rio de Janeiro, by blood culture, and characterizing the obtained isolates in relation to their sensitivity to the complement system; their infecting potential to in vitro murine macrophages; their infecting potencial to Triatoma infestans and the analysis of the isoenzymatic profile (MLEE). During the study, flagellated tripanosomatids were identified in 29 (30,2%) of the 96 specimens examined, being 28 of the samples origi- nated from bats of hematophagous habits (Desmdus rotundus) and 1 insectivorous habit (Lonchorhina aurita), caught in different municipalities of the state of Rio de Janeiro. From the isolated samples, 12 were selected for studies of characterization, all present- ing similar biological standards, all were sensitive to complement, presenting 100% lysis of epimastigote forms; they neither were capable of infecting murine macrophages in vitro neither being able to infect and colonize salivary glands, hemolymph and the intestinal tract of Triatoma infestans. In isoenzyme analyses, assessed for 9 loci, three zimodemes were observed, all different of the samples of reference Trypanosoma cruzi, Trypansoma rangeli and Trypanosoma desterrrensis, used in this study. The results of this study showed that flagellates of the genus Trypanosoma can be isolated from bats with different alimentary habits in the state of Rio de Janeiro and although no samples was identified as Trypanosoma cruzi, Trypanosoma rangeli or Trypanosoma desterren- sis, three distinct phenotypic pattern among the twelve samples were observed. It is ex- pected that these results contribute to the surveillance activities towards the knowledge of the occurrence of trypanosomatids in bats in the state of Rio de Janeiro.