University, Diss., 2001--Saarbrücken.

Universiẗat, Diss., 2004--Bonn.

Universiẗat, Diss., 2004--Bielefeld.

Techn. Hochsch., Diss., 2005--Aachen.

Techn. Universiẗat, Diss., 2006--Darmstadt.

Die mangelnde Wasserlöslichkeit von Wirkstoffen ist eines der größten Probleme in der pharmazeutischen Medikamentenentwicklung, welches durch das Scheitern zahlloser vielversprechender Leitstrukturen immense Kosten verursacht. Es wird eine Methode vorgestellt, um spezifische Löslichkeitsvermittler für schwerlösliche, niedermolekulare Verbindungen zu entwickeln. Dafür wurden Partner für die nichtkovalente Bindung von Wirkstoffen aus Peptidbibliotheken identifiziert. Als Testsubstanzen wurden Sensibilisatoren für die photodynamische Krebstherapie gewählt. Über die Fluoreszenz der Photosensibilisatoren konnte die Anreicherung an Polymerpartikeln verfolgt werden, deren Peptidsequenzen eine hohe Affinität zu den Wirkstoffen besaßen. Positive Treffer wurden isoliert und deren Aminosäuresequenz mittels Tandem-Massenspektrometrie bestimmt. Diese Informationen wurden verwendet, um Löslichkeitsvermittler für die Sensibilisatoren zu synthetisieren. Dafür wurden die Sequenzen an einen hydrophilen Polyethylenoxid-Block (PEO) konjugiert, wobei das Peptidsegment die Bindung des Gastmoleküls vermittelt, während der Polymerblock die Wasserlöslichkeit des Komplexes garantiert. Mit diesen Konjugaten wurden die Sensibilisatoren erfolgreich in wässrige Lösung gebracht. Die Eigenschaften der Solubilisatoren bezüglich Beladungsgrad, Aggregation und Freisetzung der Gastmoleküle wurde untersucht, sowie die Aktivität der solubilisierten Sensibilisatoren bezüglich der Erzeugung von Singulett-Sauerstoff. Die Anpassung der Screening-Bedingungen, der Konjugat-Architektur und den Einbau eines schaltbaren Bausteins erlaubte die zusätzlich Feinjustierung. Durch einen Vergleich der verschiedenen Sensibilisatoren wurde die Sensibilität der Methode für strukturelle Unterschiede der Testsubstanzen und die Spezifität der gewonnenen Solubilisatoren für ihr Zielmolekül überprüft. Zuletzt wurden die Aufnahme und der Aufnahmemechanismus der solubilisierten Sensibilisatoren in Krebszellen studiert. / Insufficient water solubility of small molecule compounds is one of the major issues in pharmaceutical drug development causing tremendous costs due to failure of numerous high potential lead structures. Herein, a generic method to develop specific solubilizers for insoluble, small molecules is presented. Suitable binding partners for a set of sensitizers for photodynamic cancer therapy (m THPC, Pheophorbide A und Chlorin E6) were selected from a split&mix peptide library. The enrichment of sensitizer molecules at high affinity peptide sequences was followed by monitoring their intrinsic fluorescence via fluorescence microscopy. Positive hits were isolated and amino acid sequences were identified by tandem mass spectrometry (MALDI-Tof-MS/MS). The information gained about the requirement for non-covalent binding on a molecular level was used to synthesize specific solubilizers for small molecule drug entities. Therefore, identified peptide sequences were conjugated to a polyethylene oxide block to obtain water solubility, whereas peptide segments provide non-covalent binding of drug molecules. Insoluble photosensitizers were successfully rendered water soluble by peptide-PEO conjugates. Key parameters like drug payload capacity, aggregation behavior and guest molecule release, as well as activity regarding singlet oxygen generation, were studied. By adaptation and variation of screening conditions, conjugate architecture and incorporation of a switchable building block, properties of conjugate solubilizers were fine-tuned further. To evaluate screening sensitivity towards structural aspects of screened small molecules and specify of resulting solubilizers, screening results of different sensitizers and peptide-PEO solubilizers performance were compared. Finally, cellular uptake of solubilized photosensitizer in cancer cells and uptake pathways was studied in vitro using confocal laser-scanning microscopy and fluorescence lifetime imaging.

Ziel der Dissertation „Oktapeptide als neue Organokatalysatoren zur Hydrolyse von Phosphaten und Estern“ war es neue Oktapeptide zu finden, die die Fähigkeit besitzen Phosphate und Ester zu Hydrolysieren. In der Natur ist bei den Katalysereaktionen die Sekundärstruktur von entscheidender Bedeutung. Aus diesem Grunde wurde im Rahmen dieser Arbeit zunächst ein Modellsystem entwickelt, mit dem gezeigt werden konnte, dass es möglich ist mit einfachen Bausteinen wie Diaminobutan und dem in der Gruppe von Schmuck entwickelten Guanidiniocarbonylpyrrol ein Molekül zu entwickeln, welches eine stabile intramolekulare Schleife in polaren Lösungsmitteln ausbildet. Aufgrund der geringen Größe des Moleküls, konnte kein β-Faltblatt gebildet werden. Dennoch konnte mit Hilfe der NMR-Spektroskopie gezeigt werden, dass in dem polaren Lösungsmittel Methanol eine stabile Schleifenbildung mit einer intramolekularen Komplexierung stattfindet. Nach erfolgreicher Synthese des oben beschriebenen Testsystems wurde als nächster Schritt eine kombinatorische Organokatalysatorbibliothek mit 625 Mitgliedern aufgebaut. Die Struktur der Peptide kann man in drei Teile untergliedern. Der erste Teil ist die feste Phase, das Amino-TentaGel, an das nacheinander die einzelnen Aminosäuren gekuppelt wurden. An Stelle der Butylgruppe als Schleifenelement wurde Aib-D-Pro als β-Turn Element eingesetzt. Den dritten Teil bilden die bei der Synthese der Oktapeptide eingesetzten Aminosäuren AA1, AA3, AA6, AA8, die ein β-Faltblatt ausbilden sollten. Die kombinatorische Synthese der Bibliothek erfolgte nach der „Split and Mix“ Methode. Zum Unterscheiden der einzelnen Mitglieder untereinander, wurde die feste Phase zusammen mit einem Radiofrequenzchip in IRORI MikroKans gegeben. Durch die unterschiedlichen Aminosäuren ist die Bibliothek für die Katalyse in polaren Lösungsmitteln wie Wasser konzipiert worden. Als exemplarische Katalysereaktionen wurden dabei zwei Hydrolysereaktionen (Phosphatspaltung und Esterspaltung) ausgesucht. Zunächst wurde für beide Reaktionen ein Screening mit unterschiedlichen Bedingungen durchgeführt. Dabei hat sich gezeigt, dass bei der Phosphatspaltung nur dann die Reaktion katalysiert wurde, wenn das künstliche Argininanalogon, welches in unserer Arbeitsgruppe synthetisiert wurde, vorhanden war. Der beste Katalysator hat die Reaktion 175-mal schneller katalysiert als die unkatalysierte Reaktion. Bei dem Screening der Esterspaltung hat sich herausgestellt, dass die Aminosäure Histidin essentiell für die katalytische Aktivität ist. Der beste Katalysator bei der Esterspaltung hat die Hydrolyse des Esters 345-mal schneller katalysiert als die unkatalysierte Reaktion. Bei beiden Reaktionen hat sich gezeigt, dass die Sequenz der Katalysatoren sehr wichtig für die Katalyse ist. So verringert z.B. bei der Esterhydrolyse der Austausch zweier Aminosäuren eine Verringerung der Aktivität von dem Faktor 294 auf den Beschleunigungsfaktor 35. Auch konnten beide Katalysereaktionen in wässrigem gepufferten Lösung durchgeführt werden. Damit ist es möglich gewesen neue Oktapeptide für die Katalyse von Phosphat- und Esterspaltung zu finden und diese erfolgreich im Screening als auch in Lösung zu untersuchen. / The main focus of the thesis “Octapeptides as new organocatalysts for hydrolysis of phosphates and esters” was to find new octapeptides with the ability to hydrolyse phosphates and esters. In nature the secondary structure is essential for catalytic reactions. For this reason a model system was developed. With simple devices like diaminobutyl and guanidiniocarbonylpyrrol developed in the group of Schmuck a molecule should be build up, which could form a stable intramolecular loop in polar solvents. Due to the small size of the molecule no β-sheet could be formed. Nevertheless it could be demonstrated with the help of the NMR spectroscopy that in the polar solvent methanol a stable loop formation with an intramolekular complexation took place. After successfully producing and testing of the above test system the next step was to synthesize a combinatorial library with 625 organocatalysts members. The structure of the peptides can be broken down into three parts. The first part is the solid phase, the amino-TentaGel. To this the amino acids where coupled. Instead of a butyl group the literature known β-turn element Aib-D-Pro was used. Third part of the octapeptides was the varying amino acids in the position AA1, AA3, AA6 and AA8. Between amino acid AA1 and AA3 and AA6 and AA8 a glycine was used. These amino acids should build a β-sheet. The combinatorial synthesis of the library took place after the “split and mix” method.[90-93] To distinguish the individual members the resin was put in the IRORI MikroKans and a radio frequency chip was added to the resin. Due to the different amino acids the members of the library were designed for use in polar solvents as water. Two hydrolysis reactions were used as exemplary catalysis reactions. For both reactions a screening followed by catalysis in solution were performed under different conditions. Thereby it was found that for the cleavage of phosphate the artificial arginine analogue is essential for the catalysis. The best found catalyst for this reaction catalysed the reaction 175-times faster than without catalyst. For the screening of ester cleavage it was found that the amino acid histidine is essential for the catalytic activity. For that it is not surprising that the best catalyst has four histidine and catalysed the reaction 345-times faster compared with the uncatalysed reaction. For both reactions it could be shown that the sequence of the amino acids is of great importance for the catalytic activity. So for example reduced the exchange of two amino acids the activity from the accelerating factor 294 to 35 for the ester cleavage. Also one aim of these thesis was to carry out the hydrolysis under aqueous conditions and this was possible. All reactions were carried out in water with buffer. So it was possible to synthesis new octapeptides which show catalytic activity for the hydrolysis of phosphates and esters and to investigate this octapeptides successfully in the screening as well as in solution.

Ziel der Dissertation „Entwicklung von Cysteinproteaseinhibitoren – ein klassischer und ein kombinatorischer Ansatz zur Inhibitoroptimierung“ war die Optimierung von neuen Inhibitoren von Falcipain-2 und Rhodesain als neue potentielle Wirkstoffe gegen Malaria bzw. die Schlafkrankheit über zwei verschiedene Methoden. Es handelt sich hierbei um einen klassischen und einen kombinatorischen Ansatz. Der klassische Ansatz basiert auf einer Struktur, deren Aktivität per Zufall entdeckt wurde. In Screenings von synthetisierten Strukturanaloga, gestützt durch virtuelle Docking-Experimente am aktiven Zentrum der Cysteinproteasen, wurden Struktur-Aktivitäts-Beziehungen erarbeitet. Bei der kombinatorischen Methode wurde zunächst ein peptidischer Inhibitor entworfen, der durch Festphasensynthese an einem geeigneten Harz synthetisiert wurde. Durch den kombinatorischen Einsatz von Aminosäuren konnte auf diese Weise unter enormer Zeitersparnis eine Bibliothek von 150 Inhibitoren synthetisiert werden. In einem Screening dieser harzgebundenen Inhibitoren wurden anschließend die potentesten Inhibitoren identifiziert. Die Aktivität der gefundenen Inhibitoren aus beiden Ansätzen an den protozoischen Erregern wurde durch in-vitro-Experimente an Plasmodien und Trypanosomen untersucht. Beim klassischen Ansatz wurde eine neue Substanzklasse entwickelt, die sehr gute Hemmeigenschaften an beiden Cysteinproteasen mit IC50-Werten im niedrigen mikromolaren Bereich zeigten. Außerdem besaßen sie eine hohe in-vitro-Aktivität gegenüber den Erregern im gleichen Konzentrationsbereich. Einige der Inhibitoren zeigten keine Zytotoxizität an Makrophagen. Aus dem klassischen Ansatz konnten also hochaktive Substanzen mit geringer Zytotoxizität entwickelt werden, deren Einsatz als Wirkstoffe gegen Malaria oder der Schlafkrankheit denkbar ist. Für den kombinatorischen Ansatz wurde zur Inhibitoroptimierung eine Screeningmethode für Falcipain-2 und Rhodesain direkt an einem geeigneten Harz zur Festphasensynthese entwickelt. Neu bei dieser Screeningmethode war es, dass erstmals ein quantitatives Screening einer Inhibitorbibliothek möglich sein sollte, und nicht nur die besten Inhibitoren identifiziert werden können. Aus den Ergebnissen der Festphasenscreenings an beiden Proteasen wurden 14 besonders interessante Inhibitoren der Bibliothek ausgewählt und synthetisiert. Diese Verbindungsklasse zeigte ebenfalls sehr gute Ergebnisse an den isolierten Enzymen, in den mikrobiologischen Tests an den Erregern jedoch fielen alle Ergebnisse vergleichsweise schlechter aus. Die schlechte Löslichkeit, die Bioverfügbarkeit und der Metabolismus durch den Erreger der peptidischen Inhibitoren schienen von großer Bedeutung zu sein. Der bearbeitete kombinatorische Ansatz lieferte eine neuartige Screeningmethode, die auch auf andere Targets anwendbar ist. / The main goal of the thesis “Development of cysteine protease inhibitors – a classical and a combinatorial approach for inhibitor optimization” was the optimization of new inhibitors of falcipain-2 and rhodesain as new potential agents against malaria and the sleeping sickness by two different methods. That was a classical and a combinatorial method. The classical approach is based on a compound with a high activity against falcipain-2 which was discovered by chance. The structure-reactivity relations were to be developed in screenings of analogous compounds and by computational docking experiments in the active site of the cysteine proteases. The combinatorial method was a completely different procedure. Initially a peptidic inhibitor had to be designed that could be introduced via solid phase synthesis on a suitable resin. By the combinatorial variation of amino acids 150 inhibitors could be obtained in a very short time. In a screening of these resin-bound compounds the active members of the library were identified. The antiplasmodial and antitrypanosomal activity of the inhibitors of both approaches were determined by biological in vitro investigations with the protozoic pathogens. The classical approach resulted in substances that showed excellent inhibitory properties of both cysteine proteases with IC50 values in the lower micromolar range. Additionally, they have a high in-vitro activity against the pathogens in the same concentration region. Some of the inhibitors showed no cytotoxicity on macrophages. From the classical approach we derived highly active substances with little cytotoxicity which are promising agents against malaria or the sleeping sickness. For the combinatorial approach, first a new screening method for falcipain-2 and rhodesain performed directly on a resin for solid phase synthesis was developed. Advantages of this new screening method are that it is possible to screen the library quantitatively. The results of the solid phase screenings with both proteases led to the choice of 14 notably interesting inhibitors and their synthesis. All results from the microbiological tests with the pathogens were worse compared to the results from the assays with the isolated enzymes. The bad solubility, the bioavailability and the metabolism by the pathogen played a role in inhibition. Compounds In summary a new screening method was developed and applied. The general method can be used for other investigations in the future. This enzyme assay can be used for other targets as well.

The main focus of this thesis was the synthesis and analysis of multifunctional oligopeptides. The study of their non-covalent interactions with various counterparts revealed interesting new results, leading to both methodological and application related progress. The first project of this thesis concentrated on the in-depth analysis of the peptide receptor CBS-Lys-Lys-Phe-NH2 to acquire a better understanding of its binding mode upon complexation with a substrate. In this context it was possible to develop—in cooperation with the group of Prof. Sebastian Schlücker—a direct and label free spectroscopic detection of immobilized compounds which are often found in combinatorial libraries. This new screening method utilizes the advantages of the surface enhanced Raman spectroscopy and allowed for the first time a surface mapping of a single polystyrene bead for the identification of peptides in femtomolar concentrations. Hence, this method allows a very fast and sensitive detection of resin bound compounds. The development of this promising new approach set the starting point for future experiments to enable on-bead library screenings and to investigate the complex formation of immobilized compounds. After the comprehensive analysis of the basic structural features of small peptide receptors in the first part of this thesis, the second big block focused on its in vitro evaluation using biological relevant targets. Therefore, several different modifications of the initial peptide structures were synthesized. These modifications provided a molecular toolkit for the tailor made synthesis of structures individually designed for the respective target. The first tests addressed the interaction with Alzheimer’s related amyloid fibrils. During these experiments, the successful SPPS syntheses of tri- and tetravalent systems were achieved. The comparison of the multivalent form with the corresponding monovalent version was then under special investigations. These concentrated mainly on the interaction with various bacteria strains, as well as with different parasites. To localize the compounds within the organisms, the synthesis of fluorescence labelled versions was achieved. In addition, several compounds were tested by the Institute for Molecular Infection Biology of the University of Würzburg for their antibacterial activity. This thorough evaluation of the biological activity generated precious information about the influence of small structural changes in the peptide receptors. Especially the distinct influence of the multivalency effect and the acquired synthetic skills led to the development of an advanced non-covalent recognition event, as described in the final project of this thesis. The last part of this thesis discussed the development of a novel inhibitor for the serine protease beta-tryptase based on a tailor-made surface recognition event. It was possible to study and analyze the complex interaction with the unique structure of tryptase, that features a tetrameric frame and four catalytic cleavage sites buried deep inside of the hollow structure. However, the point of attack were not the four binding pockets, as mostly described in the literature, but rather the acidic areas around the cleavage sites and at the two circular openings. These should attract peptides with basic residues, which then can block the accessibility to the active sites. A combinatorial library of 216 tetravalent peptide compounds was synthesized to find the best structural composition for the non-covalent inhibition of beta-tryptase. For the screening of the library a new on-bead assay was applied. With this method a simultaneous readout of the total inhibition of all library members was possible, thus allowing a fast and direct investigation of the still resin bound inhibitors. Several additional experiments in solution unveiled the kinetics of the inhibition process. In conclusion, both mono- and multivalent inhibitors interact in a non-destructive and reversible way with the tryptase. / Der Hauptfokus dieser Arbeit lag in der Synthese und Analyse multifunktionaler Oligopeptide. Die Untersuchung ihrer nicht-kovalenten Wechselwirkungen mit verschiedenen Strukturen resultierte sowohl in interessanten methodischen als auch anwendungsbezogenen Fortschritten. Das erste Projekt dieser Dissertation konzentrierte sich auf die detaillierte Analyse des Peptid-Rezeptors CBS-Lys-Lys-Phe-NH2, um ein besseres Verständnis seines Bindungsverhaltens während einer Substratkomplexierung zu erhalten. In diesem Zusammenhang gelang in Kooperation mit der Gruppe von Prof. Sebastian Schlücker, die Entwicklung einer direkten und markierungsfreien spektroskopischen Methode zur Detektion festphasengebundener Substanzen, wie man sie z.B. oft in kombinatorischen Molekülbibliotheken findet. Diese neuartige Screeningmethode bedient sich der Vorteile der Oberflächen-verstärkten Raman-Streuung (SERS) und ermöglichte erstmals das Scannen der Oberfläche eines einzelnen Harz-Kügelchens und damit die Identifizierung von Peptiden in femtomolaren Konzentrationen. Zusammenfassend erlaubt diese neue Methode eine schnelle und hoch sensitive Detektion harzgebundener Substanzen. Die Entwicklung dieses viel versprechenden Ansatzes bildet die Basis möglicher zukünftiger Entwicklungen für das direkte und schnelle Screening von kombinatorischen Bibliotheken sowie für die detaillierte Untersuchung der Komplexbildung von immobilisierten Verbindungen. Nach der ausführlichen Analyse der grundlegenden strukturellen Eigenschaften kleiner Peptidrezeptoren im ersten Teil dieser Dissertation schloss sich im zweiten großen Block dessen in vitro Evaluierung mit Hilfe verschiedener biologisch relevanter Zielstrukturen an. Dazu wurden einige strukturell verwandte Versionen der ursprünglichen Rezeptoren synthetisiert. Dies ermöglichte die Zusammenstellung eines variablen molekularen Baukasten zur zielgerichteten Synthese von Strukturen, die individuell für ausgesuchte Ziele entworfen werden konnten. Die ersten Tests betrachteten die Wechselwirkung mit Amyloid-Fibrillen, die im Zusammenhang mit der Alzheimer-Krankheit stehen. Während dieser Arbeiten wurden erste tri- und tetravalente Rezeptorsysteme mit Hilfe der Festphasenchemie synthetisiert. In diesem Zusammenhang war insbesondere der Vergleich der multivalenten Systemen mit den entsprechenden monovalenten Peptiden von Interesse. Die Untersuchungen konzentrierten sich hauptsächlich auf die Interaktion mit verschiedenen Bakterienarten, sowie unterschiedlichen Parasiten. Um die Verbindungen in den Organismen zu lokalisieren wurden spezielle Fluoreszenz-markierte Versionen der Peptide synthetisiert. Zusätzlich wurden einige Verbindung vom Institut für Molekulare Infektionsbiologie der Universität Würzburg auf ihre antibakterielle Aktivität untersucht. Mit dieser detaillierten Evaluierung der biologischen Aktivität konnten somit wertvolle Informationen über den Einfluss kleiner struktureller Änderungen in den Peptidrezeptoren gewonnen werden. Insbesondere der ausgeprägte Einfluss des multivalenten Effektes und die angeeigneten synthetischen Fertigkeiten führten zur Entwicklung und Untersuchung eines komplexeren Bindungsereignisses. Der letzte Abschnitt dieser Dissertation beschreibt die Entwicklung eines neues Inhibitors der Serinprotease beta-Tryptase, welche eine tetramere Struktur aufweist, in der die vier aktiven Zentren sich im Inneren eines zentralen Hohlraumes befinden. In diesem Zusammenhang gelang es die zur Inhibierung notwendige Komplexbildung, die auf einem speziell zugeschnittenen Oberflächenerkennungsprozess basiert, zu studieren und analysieren. Die Angriffspunkte waren jedoch nicht die üblicherweise in der Literatur beschriebenen aktiven Zentren, sondern Anhäufungen negativ geladener Aminosäure-Reste, die in der Umgebung der aktiven Zentren sowie in den beiden Eingangsbereichen zum zentralen Hohlraum zu finden sind. Diese sollten in der Lage sein positiv geladene Aminosäurereste anzuziehen und dazu führen, dass ein entsprechend voluminöses Peptid die Zugänglichkeit zu den aktiven Zentren einschränkt. Daraufhin wurde eine kombinatorische Bibliothek bestehend aus 216 Verbindungen synthetisiert. Es war das Ziel, die beste strukturelle Zusammensetzung zu finden, die eine effiziente nicht-kovalente Inhibierung der Tryptase ermöglicht. Verschiedene zusätzliche Experimente in Lösung halfen bei der Aufklärung der kinetischen Beschreibung des Hemmprozesses. Zusammenfassend lässt sich die Wechselwirkung zwischen der Tryptase und den sowohl mono- als auch multivalenten Inhibitoren als nicht-destruktiv und gleichzeitig reversibel beschreiben.

Velleman beweist die Konsistenz der Existenz vereinfachte Gap 2 Moraste (ein Begriff gleichwertig zu den ursprünglichen Morasten, geschafft von Jensen). Wir haben einen noch einfachen Begriff des vereinfachten Morastes in der Dissertation vorgeschlagen, Details aufgefüllt und wesentlich auch einen verschiedenen Beweis des Satzes erfunden und zwar in beide Stufe des Forcingverfahrens. Wir benötigen auch keine Squarefunktionereihenfolge (die ganz Kohärenzvoraussetzung fehlt aber ist linear und konfinal) sondern ein ``erratendes'' Verfahren für Sequenze, das nicht fest ist und nicht die ganze Kohärenzbedigung erfüllt wie bei Velleman. Wir hoffen, wir haben so eingelegt die Basis für einen zukunftigen Beweis des allgemeines Falls n in ZFC. / Velleman proved the consistency of the existence of simplified gap 2 morasses (equivalent to the concrete morasses defined by Jensen) using a two stage forcing. We give an essentially different proof of the same result and fill up some details from Velleman's paper which were not clear or imcomplete. In fact the proof uses a simpler definition of simplified gap 2 morasses. We have also eliminated the use of square-like sequences in the second stage, employing a ``guessing'' procedure for sequences which are not fixed and do not satisfy full coherence requirement. With these steps we hope to have laid the foundation for a future proof of gap n morasses in ZFC.