Orientador: Ivan de Godoy Maia / Resumo: Laccases are p-diphenol-O2-oxidoreductases encoded by multigene families widely distributed throughout the plant kingdom. They exhibit important roles in the oxidation of monolignols during lignin biosynthesis and are reported to be functionally involved in plant development, tolerance and response to stress. Apart from plants, laccases can be also found in bacteria, fungi and insects. Here, a genome-wide survey of the eucalyptus genome revealed the presence of 88 putative laccases genes. However, after meticulous analyzes using different approaches, the redundant sequences were discarded and 54 laccases genes (referred as EgLAC) were retrieved. These genes were phylogenetically distributed in six different subgroups. Based on RNA-Seq data, distinct organ/tissue expression patterns of the identified EgLAC genes were ascertained. The vast majority showed organ/tissue-enriched expression, while certain genes exhibited no detectable expression. RT-qPCR analyzes confirmed the organ/tissue expression patterns of a representative set of genes such as, for example, the rootspecific expression of EgLAC52 and the root and leaf preferential expressions of genes EgLAC4 and EgLAC32. Further expression profiling of selected EgLAC genes in response to oxidative and osmotic stresses revealed differences in their relative expression, with some genes being stress-induced. These results suggest that certain laccases might be implicated in abiotic stress responses. / Mestre

O exoesqueleto (ou cutícula) é um dos responsáveis pelo sucesso evolutivo dos insetos, não só pela proteção e suporte que lhes confere, mas também pela interface que representa entre o animal e o meio ambiente. A construção do exoesqueleto do inseto adulto envolve um processo de diferenciação denominado tanning, caracterizado pela melanização e pela esclerotização. Às enzimas lacases classicamente tem sido atribuído um papel fundamental no tanning cuticular, em particular na esclerotização. O presente trabalho consiste no estudo da função e regulação do gene Amlac 2 codificador da Lacase 2 de Apis mellifera, no âmbito da relação entre a expressão deste gene e a morfogênese do tegumento (cutícula e epiderme) do adulto. Através de RT-PCR semi-quantitativa, a abundância de transcritos foi contrastada entre diferentes estágios da ontogênese e entre distintas regiões do corpo (tórax, asas e abdome). A transcrição se acentua logo após a apólise pupal-imaginal, e se mantém alta durante todo o desenvolvimento do adulto farato. Embora haja um padrão de expressão comum entre as três regiões do corpo estudadas, nota-se um relativo atraso do início da transcrição desse gene no tegumento abdominal. Este resultado é consistente com o menor grau de esclerotização da cutícula do abdome em comparação com a do tórax e das asas. Uma análise comparativa entre abelhas operárias, zangões e rainhas revelou ainda padrões casta e sexo-específicos de diferenciação do tegumento adulto. Experimentos de silenciamento gênico pós-transcricional resultaram no comprometimento da melanização e da esclerotização cuticulares e não conclusão do ciclo de muda, efeitos que influenciaram drasticamente a viabilidade dos adultos. Análises histológicas do tegumento de abelhas submetidas ao silenciamento de Amlac 2 revelaram ainda má formação da cutícula, com alterações principalmente em sua espessura e arquitetura. Tais resultados evidenciam uma importante contribuição da enzima Lacase 2 na diferenciação do exoesqueleto adulto de Apis mellifera, fenômeno esse fundamental na ontogênese plena da abelha. Experimentos de ligadura abdominal em pupas iniciais, procedimento que impede o fluxo de hormônios ecdisteróides provenientes das glândulas protorácicas para o abdome, resultaram em inibição do aumento do título de ecdisteróides, repressão temporária da transcrição do gene Amlac 2 e bloqueio do processo de diferenciação cuticular. Tais efeitos sugerem fortemente que esses hormônios controlam a expressão do gene Amlac 2, por sua vez envolvido no processo de maturação da cutícula. Ainda, a detecção inesperada de quantidades crescentes de ecdisteróides no abdome de pupas, após o terceiro dia de ligadura, nos levou a propor um novo modelo endócrino para o desenvolvimento do adulto de Apis mellifera. / The evolutionary success of the insects is to a large extent due to the structural and mechanical properties of the integument, which is made up of an outer cuticle layer and the subjacent epidermis. As an effective interface between the insect soft body and the environment, the integument performs all the functions of a skin and of an exoskeleton. It not only supports the insect, but gives it its shape, means of locomotion, and provides protection against desiccation, besides being involved in defense strategies towards predators and pathogenic agents. Building and maturation of the adult exoskeleton include complex biochemical pathways where the enzymes Laccases (E.C. 1.10.3.2) may have a key role. Laccases have been characterized mainly in fungi and bacteria. In insects, the function of these enzymes has been linked to cuticle tanning (pigmentation and sclerotization) and stabilization of the protein-based exoskeleton. It was our aim to identify and investigate the function and regulation of the gene, Amlac 2, which encodes the enzyme Laccase 2 in the honeybee, Apis mellifera. Semi-quantitative RT-PCR analyses evidenced that Amlac 2 is highly expressed in the integument of pharate adults in correlation with cuticle pigmentation and sclerotization. Transcription increases in thoracic, abdominal and wing integuments immediately after pupal-imaginal apolysis, and remains abundant all through pharate adult development. Consistent with the different degree of sclerotization in cuticle areas recovering distinct body parts, the increase in the levels of Amlac2 transcripts occurs later in abdominal than in thoracic and wing integuments. A comparative approach using honeybee workers, queens and drones also revealed caste and sex-specific patterns of adult integument differentiation. Post-transcriptional Amlac2 gene silencing resulted in abnormalities in cuticle structure, melanization and sclerotization, as revealed by histological analyses, and drastically affected the adult molt. Such results clearly indicate a critical role of Laccase 2 in the differentiation of the adult exoskeleton in the honeybee. Experiments using a ligature to prevent the increase in ecdysteroid titer in abdomen resulted in inhibition of Amlac 2 transcription and severely impaired cuticular differentiation. These results strongly indicate that Amlac 2 expression is controlled by ecdysteroids, and has a crucial role in the differentiation and maturation of the adult cuticle. Moreover, a radioimmunoassay using hemolymph from ligated abdomens suggested the existence of an alternative source of ecdysteroids, in addition to prothoracic glands, thus leading us to propose a new endocrine model for differentiation of the adult honeybee.

Submitted by Mariana de Lara Campos Arcuri null (mariana.arcuri@aluno.ibb.unesp.br) on 2017-07-24T23:48:37Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final Ficha Catalográfica.pdf: 1462289 bytes, checksum: 6374b4edc59dd6c0ef4dab57c0176073 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-07-26T16:41:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 arcuri_mlc_me_bot.pdf: 1462289 bytes, checksum: 6374b4edc59dd6c0ef4dab57c0176073 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-26T16:41:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arcuri_mlc_me_bot.pdf: 1462289 bytes, checksum: 6374b4edc59dd6c0ef4dab57c0176073 (MD5) Previous issue date: 2017-05-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / As lacases, p-diphenol-O2-oxidoredutases, são enzimas que desempenham papel fundamental na oxidação de monolignóis durante a biossíntese de lignina, estando, portanto, associadas a processos de crescimento e tolerância a alguns tipos de estresses abióticos. As lacases podem ser encontradas em bactérias, fungos, plantas e insetos. Estudos apontam que as lacases vegetais apresentam comportamento similar às de origem fúngica, atuando de formar complementar à rota de lignificação, em resposta ao estresse oxidativo, promovendo a detoxificação celular. As lacases são geralmente codificadas por famílias multigênicas. Através de análises in silico no genoma de eucalipto, o presente estudo identificou 54 genes codificadores de lacases (denominados EgLAC) que, filogeneticamente, se distribuem em seis diferentes subgrupos. Com base em dados de RNA-Seq, padrões distintos de expressão das lacases identificadas foram observados, sendo algumas enriquecidas em um dado órgão/tecido e outras com expressão não detectável pelo método. Análises de RT–qPCR de alguns genes selecionados com base em um banco de sequências expressas confirmaram, por exemplo, a expressão raiz-específica do gene EgLAC52 bem como as expressões preferenciais em raiz e folha dos genes EgLAC4 e EgLAC32, respetivamente. Em paralelo, a expressão de alguns destes genes em reposta a estresses foi investigado, e alterações na expressão relativa em resposta aos estresses oxidativo e osmótico foram constatadas, sugerindo a participação destas lacases em respostas a estresses abióticos. / Laccases are p-diphenol-O2-oxidoreductases encoded by multigene families widely distributed throughout the plant kingdom. They exhibit important roles in the oxidation of monolignols during lignin biosynthesis and are reported to be functionally involved in plant development, tolerance and response to stress. Apart from plants, laccases can be also found in bacteria, fungi and insects. Here, a genome-wide survey of the eucalyptus genome revealed the presence of 88 putative laccases genes. However, after meticulous analyzes using different approaches, the redundant sequences were discarded and 54 laccases genes (referred as EgLAC) were retrieved. These genes were phylogenetically distributed in six different subgroups. Based on RNA-Seq data, distinct organ/tissue expression patterns of the identified EgLAC genes were ascertained. The vast majority showed organ/tissue-enriched expression, while certain genes exhibited no detectable expression. RT-qPCR analyzes confirmed the organ/tissue expression patterns of a representative set of genes such as, for example, the rootspecific expression of EgLAC52 and the root and leaf preferential expressions of genes EgLAC4 and EgLAC32. Further expression profiling of selected EgLAC genes in response to oxidative and osmotic stresses revealed differences in their relative expression, with some genes being stress-induced. These results suggest that certain laccases might be implicated in abiotic stress responses.

O exoesqueleto (ou cutícula) é um dos responsáveis pelo sucesso evolutivo dos insetos, não só pela proteção e suporte que lhes confere, mas também pela interface que representa entre o animal e o meio ambiente. A construção do exoesqueleto do inseto adulto envolve um processo de diferenciação denominado tanning, caracterizado pela melanização e pela esclerotização. Às enzimas lacases classicamente tem sido atribuído um papel fundamental no tanning cuticular, em particular na esclerotização. O presente trabalho consiste no estudo da função e regulação do gene Amlac 2 codificador da Lacase 2 de Apis mellifera, no âmbito da relação entre a expressão deste gene e a morfogênese do tegumento (cutícula e epiderme) do adulto. Através de RT-PCR semi-quantitativa, a abundância de transcritos foi contrastada entre diferentes estágios da ontogênese e entre distintas regiões do corpo (tórax, asas e abdome). A transcrição se acentua logo após a apólise pupal-imaginal, e se mantém alta durante todo o desenvolvimento do adulto farato. Embora haja um padrão de expressão comum entre as três regiões do corpo estudadas, nota-se um relativo atraso do início da transcrição desse gene no tegumento abdominal. Este resultado é consistente com o menor grau de esclerotização da cutícula do abdome em comparação com a do tórax e das asas. Uma análise comparativa entre abelhas operárias, zangões e rainhas revelou ainda padrões casta e sexo-específicos de diferenciação do tegumento adulto. Experimentos de silenciamento gênico pós-transcricional resultaram no comprometimento da melanização e da esclerotização cuticulares e não conclusão do ciclo de muda, efeitos que influenciaram drasticamente a viabilidade dos adultos. Análises histológicas do tegumento de abelhas submetidas ao silenciamento de Amlac 2 revelaram ainda má formação da cutícula, com alterações principalmente em sua espessura e arquitetura. Tais resultados evidenciam uma importante contribuição da enzima Lacase 2 na diferenciação do exoesqueleto adulto de Apis mellifera, fenômeno esse fundamental na ontogênese plena da abelha. Experimentos de ligadura abdominal em pupas iniciais, procedimento que impede o fluxo de hormônios ecdisteróides provenientes das glândulas protorácicas para o abdome, resultaram em inibição do aumento do título de ecdisteróides, repressão temporária da transcrição do gene Amlac 2 e bloqueio do processo de diferenciação cuticular. Tais efeitos sugerem fortemente que esses hormônios controlam a expressão do gene Amlac 2, por sua vez envolvido no processo de maturação da cutícula. Ainda, a detecção inesperada de quantidades crescentes de ecdisteróides no abdome de pupas, após o terceiro dia de ligadura, nos levou a propor um novo modelo endócrino para o desenvolvimento do adulto de Apis mellifera. / The evolutionary success of the insects is to a large extent due to the structural and mechanical properties of the integument, which is made up of an outer cuticle layer and the subjacent epidermis. As an effective interface between the insect soft body and the environment, the integument performs all the functions of a skin and of an exoskeleton. It not only supports the insect, but gives it its shape, means of locomotion, and provides protection against desiccation, besides being involved in defense strategies towards predators and pathogenic agents. Building and maturation of the adult exoskeleton include complex biochemical pathways where the enzymes Laccases (E.C. 1.10.3.2) may have a key role. Laccases have been characterized mainly in fungi and bacteria. In insects, the function of these enzymes has been linked to cuticle tanning (pigmentation and sclerotization) and stabilization of the protein-based exoskeleton. It was our aim to identify and investigate the function and regulation of the gene, Amlac 2, which encodes the enzyme Laccase 2 in the honeybee, Apis mellifera. Semi-quantitative RT-PCR analyses evidenced that Amlac 2 is highly expressed in the integument of pharate adults in correlation with cuticle pigmentation and sclerotization. Transcription increases in thoracic, abdominal and wing integuments immediately after pupal-imaginal apolysis, and remains abundant all through pharate adult development. Consistent with the different degree of sclerotization in cuticle areas recovering distinct body parts, the increase in the levels of Amlac2 transcripts occurs later in abdominal than in thoracic and wing integuments. A comparative approach using honeybee workers, queens and drones also revealed caste and sex-specific patterns of adult integument differentiation. Post-transcriptional Amlac2 gene silencing resulted in abnormalities in cuticle structure, melanization and sclerotization, as revealed by histological analyses, and drastically affected the adult molt. Such results clearly indicate a critical role of Laccase 2 in the differentiation of the adult exoskeleton in the honeybee. Experiments using a ligature to prevent the increase in ecdysteroid titer in abdomen resulted in inhibition of Amlac 2 transcription and severely impaired cuticular differentiation. These results strongly indicate that Amlac 2 expression is controlled by ecdysteroids, and has a crucial role in the differentiation and maturation of the adult cuticle. Moreover, a radioimmunoassay using hemolymph from ligated abdomens suggested the existence of an alternative source of ecdysteroids, in addition to prothoracic glands, thus leading us to propose a new endocrine model for differentiation of the adult honeybee.

Três resíduos vegetais da agroindústria do dendê foram usados como substrato para o cultivo de distintas linhagens de fungos da podridão-branca (basidiomicetos). Foram avaliados o crescimento e produção de enzimas lignocelulolíticas por fermentação em estado sólido e submerso. Os extratos enzimáticos obtidos das fermentações foram utilizados no processo de hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar e cacho vazio do dendê previamente pré-tratados. Um total de 54 linhagens de macrofungos foram cultivadas em três formulações de biomassa de dendê em placas Petri, onde foram escolhidas 5 linhagens com crescimento mais rápido e denso. Estas cinco linhagens de macrofungos foram cultivadas em fermentação em estado sólido e avaliados pelas atividades enzimáticas dos extratos obtidos. Nestes extratos, houve predominância das atividades de lacase, peroxidase, manganês peroxidase e protease. Das cinco linhagens foram selecionadas três linhagens com predominância nas atividades oxidativas nos cultivos em fermentação em estado sólido, para serem avaliadas em fermentação submersa (monocultivos) usando meio sintético suplementado com biomassa vegetal do dendê. As atividades enzimáticas das três espécies de basidiomicetos foram comparadas com cinco linhagens fúngicas usadas frequentemente na literatura. Houve diferenças significativas em função das atividades oxidativas (lacase e peroxidases) e hidrolíticas (FPase e β-glicosidases) entre as linhagens testadas. Estas diferenças foram usadas para estabelecer subgrupos, os quais foram avaliados através da interação em placa e cocultivos em fermentação submersa. As atividades enzimáticas dos extratos obtidos de monocultivos e cocultivos apresentaram diferenças com interações predominantemente positivas entre os três basidiomicetos e T. reesei ATCC® 60787. Os monocultivos e cocultivos foram comparados em função da liberação de glicose após da hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por autohidrólise. As hidrólises enzimáticas aplicando os extratos dos cocultivos obtiveram rendimento 44,7% superior quando comparadas com os monocultivos. Foi feita uma análise de misturas simplex lattice, usando como componentes os extratos dos monocultivos para a obtenção de um coquetel enzimático a fim de otimizar a liberação de glicose do bagaço de cana pré-tratado. Os resultados demostraram que os extratos com maiores atividades hidrolíticas estão correlacionadas com a maior liberação de glicose, e que os extratos com enzimas oxidativas podem melhorar o rendimento, tendo assim uma mistura ou coquetel caracterizado com enzimas hidrolíticas e oxidativas com potencial para obtenção de açúcares. Finalmente, este coquetel foi utilizado na hidrólise de cacho vazio de dendê pré-tratado fisicamente, biologicamente e biológica-físicamente (combinado) obtendo um rendimento máximo de 11,8 g.L-1 de glicose a partir de biomassa vegetal de dendê quando pré-tratada biológicafisicamente, o que correspondeu entre 40 - 60% do rendimento do rendimento obtido quando empregadas as enzimas comerciais Cellic® Ctec3 e Cellic® Ctec2. / Three vegetable residues from the palm oil industry were used as substrate for cultivation of different white rot fungi strains (basidiomycetes). The growth and production of lignocellulolytic enzymes were evaluated by solid and submerged fermentation. The enzymatic extracts obtained from fermentations were used in enzymatic hydrolysis process of pretreated sugarcane bagasse and oil palm empty bunch. Fifty-four macrofungal strains were cultivated in three formulations of oil palm biomass on Petri dishes, where 5 strains with faster and dense growth were chosen. These five macrofungal strains were cultivated in solid state fermentation and evaluated by the enzymatic activities of the extracts obtained. In these extracts, activities of laccase, peroxidase, manganese peroxidase and protease were found to be predominant. Three of the five strains were selected with predominance in oxidative activities on solid state fermentation cultures to be evaluated in submerged fermentation (monocultures) using synthetic medium supplemented with oil palm biomass. The enzymatic activities of the three basidiomycetes srtains were compared with five fungal strains frequently used in the literature. There were significant differences in function of the oxidative activities (laccase and peroxidases) and hydrolytic activities (PFase and β-glucosidases) among the tested strains. These differences were used to establish subgroups which were evaluated through the interaction in plates and cocultures in submerged fermentation. The enzymatic activities of the extracts obtained from monocultures and cocultures presented differences, with predominantly positive interactions between the three basidiomycetes and T. reesei ATCC® 60787. Monocultures and cocultures were compared as a function of the glucose release after the enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse pretreated by autohydrolysis. The enzymatic hydrolysis of the coculture extracts obtained higher percentages (maximum value 44.7%) when compared to monocultures. An analysis of simplex lattice mixtures was made using the monoculture extracts as components to obtain an enzymatic cocktail in order to optimize the glucose release of the pretreated sugarcane bagasse. The results showed that extracts with higher hydrolytic activities are correlated with the higher glucose release and extracts with oxidative enzymes can improve the sugar yield, thus having a mixture or cocktail characterized by hydrolytic and oxidative enzymes with the potential to obtain sugars. Finally, this cocktail was used in the hydrolysis of untreated, physically, biologically and biologically-physically (combined) pretreated oil palm empty bunch, obtaining a maximum yield of 11.8 gL-1 of glucose in the biomass of palm oil when pretreated biological-physically, which corresponded between 40-60% of the yield of the commercial enzymes Cellic® Ctec3 and Cellic® Ctec2.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-26Bitstream added on 2014-06-13T19:09:12Z : No. of bitstreams: 1 covizzi_lg_me_sjrp.pdf: 1482206 bytes, checksum: 2f1c1f77dc261f160aba2bc3a1d1ffea (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O uso de células microbianas imobilizadas para aumentar a produção de metabólitos fúngicos em processos fermentativos tem mostrado altos rendimentos. Nesse trabalho foi avaliado pela primeira vez, a imobilização de células do Botryosphaeria rhodina, um fungo ligninolitico produtor constitutivo de lacases. Três suportes foram avaliados: Fibra Acrílica Fina (FAF); Espuma de Poliuretano Expandido (EPE); Espuma de Poliuretano Fibroso (EPF). O EPF foi o melhor suporte por ter mostrado uma imobilização mais homogenia das células. Um planejamento fatorial foi desenvolvido para otimizar a produção de lacases por células livres, na presença de álcool veratrílico (AV). A análise da superfície de resposta mostrou que 18mM como a melhor concentração de AV para a produção de lacases, usando-se 3 mL de homogeinato de células como inóculo (DOλ400nm 0.4-0.6) para 25 mL de meio de cultura em frascos de 125mL, a 180 rmp, durante 126 horas a 28ºC. O perfil de crescimento do fungo, associado a produção de lacase foram comparados na presença e na ausência de AV, usando-se células livres e células imobilizadas do B. rhodina. A imobilização aumentou aproximadamente 3 vezes a produção de lacases e manteve estável o nível de produção durante 6 reciclos. A imobilização de células do B. rhodina mostrou-se útil uma vez que economizou 72horas para atingir a maior produção de lacase, quando comparada com células livres e também aumentou a tolerância do fungo a concentrações mais altas de AV (500mM) / The use of microbial immobilized cells to increase the production of fungal metabolites in fermentation processes has showed higher yields. This work evaluated by the first time, the immobilization of Botryosphaeria rhodina cells, a ligninolytic fungus that produces laccase. Three carriers were evaluated: acrylic fine fiber (FAF), expanded polyurethane foam (EPE), and fiber polyurethane foam (EPF). The EPF was the best carrier because showed a homogeneous immobilization cells. A factorial design was developed in order to optimize the laccase production by free cells in the presence of the laccase inducer veratryl alcohol (VA). The analysis by response surface answer showed 18 mM as the best VA concentration to produce laccase using 3 mL of a cell homogenate (ODλ400nm 0.4-0.6) as inoculum, to 25 mL of culture medium in shaked flasks (125 mL) at 180 rpm, during 126 hours at 28 °C. A growth profile for laccase and fungal biomass production were compared with and without VA using free and immobilized cells of B. rhodina. The cell immobilization increased approximately 3 folds the laccase production and maintained it stable during 6 consecutive recycles. The cell immobilization of B. rhodina showed to be useful once saved 72 hours to achieve the higher laccase production when compared to the one with free cells, and also increased the fungal cell tolerance at higher VA concentrations (500 mM)