Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 75-88. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

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Des observations préliminaires ont montré que l’auto-assemblage d’un peptide issu de l’hydrolyse trypsique de la β-lactoglobuline (β-lg f1-8) modifiait la composition de mélanges de protéines de lactosérum, particulièrement en α-lactalbumine (α-la) soluble. Le but du présent travail était de démontrer l’occurrence d’interactions entre le peptide β-lg f1-8 et l’α-la. L’étude de l’auto-assemblage du peptide β-lg f1-8 en présence d’α-la à 25 et 55 °C a permis d’observer que l’ajout d’α-la à un hydrolysat trypsique permettait de retarder la floculation du peptide à 55 °C. La mise en contact d’α-la avec le peptide β-lg f1-8 a permis de modifier le profil de solubilité de la protéine à différents pH, mais pas son profil de dénaturation thermique obtenu par calorimétrie différentielle à balayage (DSC). Ces observations suggèrent que le peptide β-lg f1-8 interagit avec l’α-la par le biais d’interactions hydrophobes et qu’il pourrait être utilisé dans le développement de nouvelles stratégies de fractionnement de mélanges protéiques. / Preliminary observations showed that the self-assembly capacity of a β-lactoglobulin peptide obtained from trypsin hydrolysis (β-lg f1-8) could modify the composition of whey protein mixtures, mainly by reducing the amount of soluble α-lactalbumin (α-la). The goal of this study was to demonstrate the occurrence of interactions between β-lg f1-8 peptide and α-la. A study of the peptide self-assembly process in presence of α-la at 25 and 55 °C showed that the addition of α-la to the original tryptic hydrolysate delays the flocculation of peptide β-lg f1-8 at 55 °C. Adding β-lg f1-8 peptide to α-la modified the solubility profile of the protein at various pH, but its thermal unfolding profile obtained by differential scanning calorimetry (DSC) remained unchanged. All of these observations suggest that the peptide β-lg f1-8 can interact with the α-la via hydrophobic interactions and could be used for developing new strategies for the fractionation of protein mixtures.

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Ce mémoire de thèse est consacré au fractionnement des protéines du lait par filtration dynamique. Un procédé en cascade a été proposé pour séparer les protéines du lait en trois fractions principales : les caséines, l'α-Lactalbumine et la β-Lactoglobuline. La première étape du procédé consiste en une microfiltration du lait afin de séparer les caséines des protéines du lactosérum. Une comparaison entre les performances des deux modules de filtration dynamique : le module Multi Shaft Disk (MSD) et le module à disque rotatif, a été effectuée. Nous avons obtenu les meilleurs résultats avec le prototype MSD, fournissant des flux de perméat élevés, ainsi que une très bonne transmission de protéines solubles et une rétention élevée des micelles de caséines. La deuxième étape du procédé est la séparation d'α-Lactalbumine de la β-Lactoglobuline, par ultrafiltration. Le prototype à disque rotatif muni d'un disque à ailettes tournant à 2000 tr.min-1 a été utilisé. Nous avons obtenu des transmissions de protéines et des sélectivités constantes lors de la concentration du lactosérum. Ceci constitue un avantage des systèmes dynamiques, car en filtration tangentielle les transmissions de protéines et les sélectivités diminuent avec la concentration. Les sélectivités obtenues en filtration dynamique, sans modification de pH ni de la force ionique, sont de l'ordre de grandeur de celles obtenues en filtration tangentielle après optimisation du pH et de la force ionique.

La vitamine C est un antioxydant connu et elle est utilisée comme supplément alimentaire et agent de conservation. Le déshydroascorbate (DHA) est une forme oxydée de la vitamine C. Chez l'humain, la plupart du DHA formé est rapidement retransformé en vitamine C par différentes voies enzymatiques. Toutefois, la dégradation du DHA mène à la formation de produits carbonylés réactifs (C=0) qui sont à leur tour impliqués dans la formation de produits de glycation avancée (AGE), entre autres en situation de stress oxydatif ou lors du vieillissement. De plus, dans les cas d’urémie chronique, l’élimination des produits carbonylés réactifs est diminuée. Récemment, notre laboratoire a démontré qu’un produit de dégradation du DHA modifiait le groupement thiol du glutathion. Cela suggère que les produits carbonylés réactifs pourraient également modifier les thiols d'autres peptides et protéines. L’objectif de cette étude est de caractériser les changements engendrés par les produits de dégradation du DHA sur différents peptides et protéines en utilisant des méthodes de spectrométrie de masse combinée avec la chromatographie liquide. Afin de mieux comprendre les modifications engendrées par le DHA, nous avons utilisé la chaîne ? de l’insuline, qui possède un nombre limité de sites cibles potentiels. En incubant la chaîne ? de l’insuline avec le DHA, nous avons observé des adduits de 130 Da sur les cystéines ayant un thiol libre par analyse aux spectromètres de masse. Des études cinétiques montrent que la modification par le DHA est plus efficace à pH 2,0 qu’à pH 7,0, car l'association des thiols libres en disulfure est facilitée à pH neutre comparativement à pH acide. Nous avons ensuite confirmé le phénomène sur des protéines entières, plus précisément l’?-lactalbumine et la ?-lactoglobuline qui présentent une plus grande complexité que la chaîne ? de l'insuline et qui pourraient être une des cibles physiologiques du DHA. Dans l’ensemble, nos résultats indiquent que les produits carbonylés réactifs provenant de la dégradation du DHA sont capables de modifier les thiols de protéines complexes. En perspective, il serait intéressant d’identifier l'impact physiologique d'une telle modification dans l’homéostasie cellulaire, plus particulièrement dans les dérèglements dus au stress oxydatif. [symboles non conformes]

Orientador: Cesar Costapinto Santana / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-27T02:38:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Veredas_Vinicius_M.pdf: 4752847 bytes, checksum: f01c509a2798835914e0489d2f75baac (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: O crescente interesse e aplicações dos produtos biotecnológicos vem aumentando o desenvolvimento de novos processos de recuperação e purificação de proteínas. O soro de leite bovino, obtido da manufatura da caseína para a produção de queijo, é em sua maioria descartado em mananciais de água, causando sérios problemas ambientais devido a sua alta demanda biológica de oxigênio (DBO). As proteínas presentes no lactosoro apresentam um excelente valor nutritivo e farmacológico, porém, o seu uso no enriquecimento de produtos alimentícios é limitado devido a baixa concentração destas proteínas. As principais proteínas do lactosoro são: ~-Iactoglobulinas, a-Iactalbumina, albuminas de soro bovino, imunoglobulinas, lactoperoxidase, lactoferrina, lisozima e outras proteínas de menor proporção, que apresentam um alto valor agregado. A a-Iactalbumina atua no organismo estimulando os agentes do sistema imunológico por proporcionar a elevação de glutationa em vários órgãos e no sangue, resultando em benefícios para pacientes portadores de doenças degenerativas como os males de Parkinson e Alzheimer, câncer e AIDS. Neste trabalho foi estudado o processo de separação da a-Iactalbumina, através de técnicas cromatográficas empregando a metodologia de leito fixo e expandido. O leito expandido possibilita a redução nos custos do processo de purificação, eliminando etapas de separação necessárias quando o extrato apresenta material em suspensão, que é o caso dos lactosoros. Nos ensaios realizados foram estudados as melhores condições de adsorção da a-Iactalbumina visando a sua purificação empregando adsorventes de troca iônica e de interação hidrofóbica. Também foram realizados ensaios em sistemas de tanque agitados para a determinação das isotermas e cinéticas de adsorção. Neste trabalho obteve-se a a-Iactalbumina com uma pureza acima de 80% e apresentando um fator de purificação de 5 vezes utilizando as resinas de interação hidrofóbica com única etapa de purificação / Abstract: The interest and applications of biotechnology products has been increasing the development of new recovery and purification processes for proteins. The bovine milk serum, obtained from casein manufacture for cheese production, is mostly rejected into watercourse, causing problems to the environment due to its high biological oxygen demand (BOD). The proteins of milk serum have excellent nutritious and pharmaceutical value, h oweve r, its application for protein enrichment of food products is limited due to its low content in the milk serum. The main proteins of milk serum are: ~-Iactoglobulins, a-Iactalbumine, bovine serum albumine, immunoglobulins, lactoperoxidase, lactoferrin, lisozime and other lower content proteins which have a high aggregate value. The a-Iactalbumine acts in the human organism by stimulating the agents of the immunologycal system due to increasing on glutathione levei in several organs and blood, resulting in benefits for patients of some diseases like Parkinson and Alzheimer's iII, cancer and AIDS. It was studied in this work the separation processes of a-Iactalbumine, by chromatographic techniques making use of fixed and expanded bed methods. The expanded bed enables cost reduction on purification process by reducing separation steps used for removing suspended solids, as in case of milk serum extracts. In our experiments were studied the adsorption conditions of alactalbumine aiming at its purification by using ionic exchange and hydrophobic interaction adsorbents. Other experiments were accomplished at stirred tank systems for the determination of isotherms and adsorption kinetics. It was obtained, in this work, an a-Iactalbumine purity higher than 80%, with a five fold purification factor by using the hydrophobic interaction resins in a single purification ste / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

De nombreuses études ex vivo et in vivo ont montré que certaines protéines du lactosérum (β-lactoglobuline, α-lactalbumine et lactoferrine) et que des ingrédients à base de protéines du lactosérum (WPC, WPI) peuvent influencer la réponse immunitaire. Plusieurs études ex vivo ont aussi montré que des hydrolysats enzymatiques des protéines du lactosérum possèdent une activité immunomodulante, suggérant ainsi la libération de peptides bioactifs. Dans cette étude, des peptides issus de la β-lactoglobuline (β-Lg) et de l'α-lactalbumine (α-La) ont été sélectionnés sur la base de leurs propriétés physico-chimiques, puis préparés par synthèse chimique. Les propriétés immunomodulantes de ces peptides ont ensuite été évaluées ex vivo, en mesurant leurs effets à différentes concentrations (10-2000 ug.mL⁻¹) sur la prolifération de splénocytes murins, en absence et en présence d'un mitogène (Concanavaline A). L'effet sur la sécrétion des cytokines (IL-4, IL-2, IL-10 et IFN-γ) de certains peptides (β-Lg f 15-20, f55-60, fl 39-148) a aussi été étudié, avec et sans ConA. Les résultats ont montré que le peptide β-Lg 178-83 ne possède aucun effet sur la prolifération des cellules, alors que d'autres peptides (β-Lg fl 5-20, f55-60, f84-91, f92-105, H39-148, fl42-148 et α-La 10-16) stimulent plus ou moins fortement la prolifération des splénocytes. Trois peptides ont montré un effet inhibiteur sur la croissance des cellules: le β-Lg fl-8 semble affecter l'intégrité des cellules à fortes concentrations, alors que l'effet inhibiteur des peptides β-Lg f"102-105 et α-La f 104-108 semble plutôt associé à leur faible solubilité à fortes concentrations, ce qui affecterait la croissance des cellules. L'étude des corrélations entre les caractéristiques physico-chimiques et les propriétés immunostimulantes des peptides a suggéré que la charge positive, l'hydrophobicité et la taille des peptides pourraient jouer un rôle important dans leurs propriétés immunomodulantes. Le dosage des cytokines a révélé un effet différent de chacun des peptides étudié sur la sécrétion cytokinique, suggérant un mode d'action différent de ces derniers sur la stimulation de la prolifération des splénocytes. Ces résultats suggèrent donc que certains peptides trouvés dans la séquence primaire des protéines majeures du lactosérum posséderaient un effet sur la réponse immunitaire spécifique.

L'assemblage des protéines est une problématique fondamentale d'intérêt pour différents secteurs (alimentaire, médical, pharmaceutique, etc.). La compréhension des mécanismes à l'origine des interactions initiales et des assemblages protéiques offre la possibilité de contrôler et d'orienter le processus de formation ainsi que la nature et les propriétés fonctionnelles des structures supramoléculaires résultantes. L'objectif de la thèse était d'acquérir de nouvelles connaissances à différentes échelles d'étude sur les mécanismes d'assemblages protéiques et les structures supramoléculaires dans un mélange protéique binaire incluant deux protéines globulaires de charge globale opposée à pH neutre : le lysozyme (LYS) et l'alpha-lactalbumine (alpha-LA). L'utilisation de techniques de fluorescence a permis de caractériser l'interaction moléculaire et la formation d'hétérodimères entre ces deux protéines aussi bien avec les formes chargée (holo alpha-LA) et déplétée (apo alpha-LA) en calcium de l'alpha-LA. La formation de ces hétérodimères s'effectue par la mise en œuvre d'interactions électrostatiques. Les propriétés d'assemblage de ces hétérodimères sont différentes et intimement liées à la stabilité de l'alpha-LA. Les hétérodimères LYS – holo alpha-LA ne semblent pas former de structures supramoléculaires, alors que les hétérodimères LYS – apo alpha-LA s'assemblent en agrégats ou en structures sphériques selon la conformation de l'apo alpha-LA. Une conformation de type « molten globule » de l'apo alpha-LA favorise la formation de microsphères. Ces dernières sont constituées de LYS et d'apo alpha-LA en quantité équimolaire qui sont parfaitement co-localisés au sein de la microstructure. Ce travail souligne le rôle clé joué par la conformation et la flexibilité des protéines dans la formation et l'orientation des assemblages entre protéines alimentaires.