Le fer ajouté dans des systèmes complexes tels que les aliments induit divers problèmes comme l'oxydation des lipides ou la précipitation d'autres composés présents dans la matrice. Il s'en suit une diminution de sa biodisponibilité et des défauts de goût. L'utilisation de chélates de fer, comme le bisglycinate de fer ou l'EDTA de fer, constitue une voie intéressante : le fer ainsi protégé n'interagirait pas avec la matrice alimentaire. La stabilité des chélates de fer (bisglycinate de fer et NaFe EDTA), supposés peu réactif pour l'initiation de peroxydation, a été attestée sur des modèles d'émulsions huile dans eau stabilisées par du caséinate de sodium ou de la β lactoglobuline. Dans un second temps, le travail a consisté à vérifier la faible influence de ces complexes sur la nature de l'interface huile/eau (étude de la tension et de la rhéologie interfaciales). La stabilité du bisglycinate de fer en solution aqueuse et en présence de β lactoglobuline a également été évaluée en fonction du pH (pH 2, 3,5 et 6,5) par rayons X. Il a ainsi été montré que la nature des protéines formant l'interface huile/eau et le type de sels de fer jouent un rôle crucial sur la stabilité oxydative des émulsions enrichies en fer. L'affinité des protéines de lait pour les ions fer libres est le premier facteur qui contrôle la peroxydation des matières grasses par l'absence de transfert à l'interface huile/eau. La capacité du complexe bisglycinate à retenir les ions fer et donc à limiter la présence d'ions fer libres (ferriques ou ferreux) apparaît comme le second facteur principal à contrôler. La compétition pour les ions fer entre les groupes fonctionnels des protéines et les contre ions de chélates (glycinate ou EDTA) gouverne ainsi l'état d'oxydation du système dans des conditions acide/base proche de la neutralité. En milieu acide, l'oxydation est principalement gouvernée par l'instabilité du complexe bisglycinate de fer et par conséquent la lente libération fer ionique dans la phase aqueuse. Pour résumer, si le complexe de fer n'est pas déstabilisé et que la protéine à l'interface huile/eau ne présente pas de groupe fonctionnel ayant une forte affinité pour le fer, alors la peroxydation des lipides en émulsion est faible. Dans notre démonstration, si une protéine n'est pas phosphorylée et pour des pH proches de 7, alors l'émulsion ne sera pas peroxydée car le fer ne migre pas à l'interface huile/eau.

Le bénéfice de l’encapsulation des molécules bioactives a séduit les industries agroalimentaires depuis plusieurs décennies. Plus récemment des études ont montré la capacité de protéines alimentaires de charge opposée à s’assembler en microsphères par coacervation complexe. La compréhension des forces gouvernant le processus de coacervation entre protéines et l’influence exercée par la présence de bioactifs demeurent des prérequis pour l’utilisation des coacervats complexes comme agent d’encapsulation. Dans ce contexte, l’objectif de mon projet de thèse a été de comprendre le mécanisme de coacervation complexe entre la ¿-lactoglobuline (¿-LG) chargée négativement, et la lactoferrine (LF) chargée positivement, en absence et en présence de petits ligands. La LF a présenté une coacervation préférentielle avec le variant A de la¿¿-LG qui se distingue du variant B par la substitution de 2 acides aminés. Au niveau moléculaire, deux sites de fixation de la ¿-LG sur la LF ont été identifiés.En outre, par la mesure d’une part des coefficients de diffusion rotationnel et d’autre part de la cinétique de diffusion des entités moléculaires constituant les coacervats, il est suggéré que ces derniers sont formés à partir de -LG libre¿¿de pentamère, LF(-LG2)2, ainsi que des entités plus larges, (LF-LG2)n. Afin d’évaluer l’effet de la présence de petits ligands sur la coacervation complexe entre la -LG et la LF, des ligands modèles (ANS et acide folique) ont été utilisés. Dans les conditions expérimentales testées ces deux ligands n’ont pas d’affinité pour la -LG, mais après interact / Encapsulation of bioactives has been used by the food industries for decades and represents a great potential for the development of innovative products. Given their versatile functional properties, milk proteins in particular from whey have been used for encapsulation purposes using several encapsulation techniques. In parallel, recent studies showed the ability of oppositely charged food proteins to co-assemble into microspheres through complex coacervation. Understanding the driving forces governing heteroprotein coacervation process and how it is affected by the presence of ligands (bioactives) is a prerequisite to use heteroprotein coacervates as encapsulation device. In this context, the objective of my thesis work was to understand the mechanism of complex coacervation between -lactoglobulin (-LG) and lactoferrin (LF) in the absence and presence of small ligands. The conditions of optimal ¿-LG - LF coacervation were found at pH range 5.4-6 with a molar excess of ¿-LG. RemarkabAt molecular level, the presence of two binding sites on LF for -LG was evidenced. Moreover, the heterocomplexes such as pentamers LF(-LG2)2 and quite large complexes (LF-LG2)n were identified as the constituent molecular species of the coacervate phase. To evaluate the -LG - LF complex coacervation in the presence of small ligands, models of hydrophobic (ANS) and hydrophilic molecules (folic acid) were used. Although under the experimental conditions tested the small ligands did not interact with -LG, both interacted with LF inducing its self-association into nanoparticles. High relati

Les protéines et les polysaccharides constituent avec les lipides les principaux ingrédients de l’alimentation et lui confèrent à la fois ses propriétés de nutrition et de texture. Une tendance actuelle de l’industrie agroalimentaire est d’élaborer des aliments plus sains c'est-à-dire moins gras et moins salés. A ce titre, les polysaccharides sont des agents detexturation efficaces lorsqu’ils sont utilisés seuls ou en combinaison avec des protéines. Le développement de nouveaux produits alimentaires nécessite donc de rationaliser et mieux comprendre les propriétés physico-chimiques des solutions et des gels mixtes à base de protéines et de polysaccharides. Au cours de ce travail de thèse, nous avons étudié des mélanges de protéines globulaires (la β-lactoglobuline: β-lac) et de polysaccharide (le κ-carraghénane: κ-carr). Ce dernier provient d’algues et, en solution, il conduit à des gels au dessous d’une température critique qui dépend de la nature du sel ajouté. Le κ-carr est un additif important dans l’industrie alimentaire et plus particulièrement comme texturants des produits laitiers. Il est donc essentiel de comprendre les interactions qu’il développe avec les protéines du lait comme la β-lac.L’objectif de ce travail est d’étudier la structure et les propriétés mécaniques d’agrégats ou de gels de β-lac mélangés avec du κ-carr et d’étudier leur influence sur la gélification de ce dernier. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à la sensibilité des mélanges aux ions calcium. Des agrégats protéiques ont été formés soit indépendamment puis mélangés au κ-carr soit directement in situ en dénaturant thermiquement des mélanges κ-carr/β-lac native. Les deuxméthodes de préparation ont été comparées pour des compositions constantes des mélanges. La diffusion de la lumière, la rhéologie et la microscopie laser confocale ont été mises en oeuvre pour étudier la texture des mélanges.La taille et la morphologie des agrégats protéiques dépendent fortement de la concentration en ions calcium ajoutés qui se lient spécifiquement aux protéines. Nous avons montré que les très grands agrégats protéiques formés en présence de calcium conduisent à une microséparation de phase quand ils sont mélangés avec du κ-carr même à très faible concentration. Ainsi, la structure des systèmes mixtes est très sensible à la quantité de calcium en présence. Lesagrégats protéiques renforcent les gels de κ-carr formés en présence de potassium tout comme l’ajout de calcium. Ce renforcement dans le cas des agrégats protéiques est dû au transfert des ions calcium de la β-lac vers le κ-carr. De plus, nous avons montré que la gélification du β-carr induite par des ions potassium continuait à avoir lieu en refroidissantdes mélanges κ-carr/β-lac où cette dernière est dénaturée in situ. Cela conduit à des réseaux interpénétrés qui sont plus forts mécaniquement que la somme des deux réseaux pris individuellement. En conclusion, nous avons montré que la compétition entre la β-lac et le κ-carr pour les ions calcium était le paramètre de contrôle des propriétés texturales desgels mixtes. / Protein and polysaccharide are together with lipids the main ingredients of food and procure both nutrition and texture. A recent tendency in the food industry is to develop more healthy products that contain less fat and salt. The addition of polysaccharides is recognized as a good way to control the texture of food products. The texture of many food products is determined by gelation of either the proteins or the polysaccharides, or both. When both are present, gelation of the protein or the polysaccharide will be influenced by the presence of the other type. Understanding of the physical chemical properties of aqueous solutions and gels containing protein and polysaccharides by themselves and in mixtures is needed for a rational development of novel food products. This thesis describes an investigation of mixtures of the globular protein β-lactoglobulin (β-lg) and the polysaccharide κ-carrageenan (κ-car). κ-car is a polysaccharide isolated from algae that is often used as an additive in food industry. In solution it forms a gel below a critical temperature that depends on the amount and the type of salt. Addition of κ-car can improve the smoothness, creaminess, and body of food products and is often usedmodify the texture of dairy products. Therefore it is important to understand the interaction of κ-car with milk proteins such as β-lg, which is the main protein component of whey. The objective of the present investigation was to study the structure andthe mechanical properties of β-lg aggregates or gels when mixed with κ-car and to study the influence of the former on the gelation of κ-car. The focus was on the sensitivity of the system to calcium ions Protein particles were either formed separately and subsequently mixed with κ-car or formed directly in mixtures of κ-car and native β-lg by heating. The two different methods of preparation were compared with the same composition of polymers. The research presented in this thesis is essentially experimental using scattering techniques and confocal laser scanning microscopy to study the structure and shear rheology to study the dynamic mechanical properties.The size and morphology of protein aggregates formed by heating β-lg is strongly dependent on the concentration of Ca2+ that binds specifically to the proteins. It is shown that larger aggregates formed in the presence of Ca2+ micro-phase separate already at low κ-car concentrations. Therefore the structure of mixed systems is extremely sensitive to the amount of Ca2+ present in the system. The presence of protein aggregates was found to reinforce potassium induced κ-car gels, but it was also found that addition of CaCl2 strengthens potassium induced pure κ-car gels. We show that the reinforcement by addition of protein aggregates is caused by the transfer of a fraction of Ca2+ from β-lg to κ-car. It was shown that potassium induced gelation of κ-car also occurs during cooling heat-set β-lg gels formed in mixtures at higher protein concentrations leading to interpenetrated networks that are stronger than the sum of the individual networks. Themain conclusion of the investigation reported here is that the competition of κ-car and β-lg for calcium ions determines both the structure and the mechanical properties of the mixed systems.

La première étape de ce travail visait à caractériser l’impact du calcium sur les interactions entre la β-lactoglobuline (β-lg) et l’epigallocatéchine-3-gallate (EGCG). Il a été démontré que le calcium avait un impact important sur la taille des agrégats formés et leur potentiel-zêta (ζ). De plus, l’analyse de la composition de ces complexes a démontré un impact important du calcium sur la rétention d’EGCG par ces particules. Différents types d’interactions entre la protéine, la catéchine et le calcium (par exemple. électrostatiques, hydrophobes et hydrogènes) sont suggérés comme étant responsables des caractéristiques observées. La deuxième étape visait à déterminer l’impact de différentes concentrations de calcium sur les interactions entre la β-lg et l’EGCG. Cette deuxième étape a permis de démontrer que l’effet du calcium sur l’augmentation de la taille de particule ainsi que sur le changement de potentiel-ζ était seulement possible en présence d’EGCG. Cet effet serait principalement dû à la formation de ponts calciques (EGCG/calcium/EGCG) pouvant créer un réseau responsable de l’augmentation de la taille des particules. La troisième et dernière étape de ce travail visait à déterminer si les complexes formés par la β-lg, l’EGCG et le calcium pouvaient améliorer la réponse glycémique chez des souris C57BL/6 soumis à un test oral de tolérance au glucose. Il a pu être démontré que la β-lactoglobuline seule avait un effet bénéfique sur la glycémie postprandiale. L’ensemble de ces résultats démontre que la présence du calcium a un effet important sur les interactions entre la protéine laitière et la catéchine du thé vert et sur la taille des agrégats résultants. Par ailleurs, la protéine seule semblait avoir le plus grand effet sur la réponse métabolique indiquant que des interactions avec l’EGCG et le calcium n’avaient que peu d’effet sur l’activité métabolique de la β-lg. / The first step of this work aimed to determine the impact of calcium on the interactions between β-lactoglobulin (β-lg) and epigallocatechin-3-gallate (EGCG) and it was shown that calcium had an important impact on particle size and zeta(ζ)-potential values. Moreover, the analysis of the formed complexes’ composition revealed that the presence of calcium could greatly influence the quantity of EGCG retained by the complexes. Various interactions between the protein, the catechin and calcium (eg. electrostatic, hydrophobic, and hydrogen) are suggested as being responsible for the characteristics of the complexes observed. The second step aimed to determine the impact of various calcium concentrations on the interactions between β-lg and EGCG. This second step allowed us to demonstrate that the impact of calcium on particle size and ζ-potential was only possible when in the presence of EGCG. This effect would primarily be due to the formation of calcium bridging capable of creating a large network responsible for the increased particle size. The third and last step of this work aimed to determine if the formed complexes between β-lg, EGCG and calcium reduce the glycemic response of C57BL6 mice. It was demonstrated that β-lg alone had a beneficial effect on postprandial glycaemia. Together, these results demonstrate that the presence of calcium has an important effect on the interactions between the milk protein and green tea catechins. However, these interactions do not appear to modulate the metabolic response associated with the consumption of β-lg.

De nombreuses études ex vivo et in vivo ont montré que certaines protéines du lactosérum (β-lactoglobuline, α-lactalbumine et lactoferrine) et que des ingrédients à base de protéines du lactosérum (WPC, WPI) peuvent influencer la réponse immunitaire. Plusieurs études ex vivo ont aussi montré que des hydrolysats enzymatiques des protéines du lactosérum possèdent une activité immunomodulante, suggérant ainsi la libération de peptides bioactifs. Dans cette étude, des peptides issus de la β-lactoglobuline (β-Lg) et de l'α-lactalbumine (α-La) ont été sélectionnés sur la base de leurs propriétés physico-chimiques, puis préparés par synthèse chimique. Les propriétés immunomodulantes de ces peptides ont ensuite été évaluées ex vivo, en mesurant leurs effets à différentes concentrations (10-2000 ug.mL⁻¹) sur la prolifération de splénocytes murins, en absence et en présence d'un mitogène (Concanavaline A). L'effet sur la sécrétion des cytokines (IL-4, IL-2, IL-10 et IFN-γ) de certains peptides (β-Lg f 15-20, f55-60, fl 39-148) a aussi été étudié, avec et sans ConA. Les résultats ont montré que le peptide β-Lg 178-83 ne possède aucun effet sur la prolifération des cellules, alors que d'autres peptides (β-Lg fl 5-20, f55-60, f84-91, f92-105, H39-148, fl42-148 et α-La 10-16) stimulent plus ou moins fortement la prolifération des splénocytes. Trois peptides ont montré un effet inhibiteur sur la croissance des cellules: le β-Lg fl-8 semble affecter l'intégrité des cellules à fortes concentrations, alors que l'effet inhibiteur des peptides β-Lg f"102-105 et α-La f 104-108 semble plutôt associé à leur faible solubilité à fortes concentrations, ce qui affecterait la croissance des cellules. L'étude des corrélations entre les caractéristiques physico-chimiques et les propriétés immunostimulantes des peptides a suggéré que la charge positive, l'hydrophobicité et la taille des peptides pourraient jouer un rôle important dans leurs propriétés immunomodulantes. Le dosage des cytokines a révélé un effet différent de chacun des peptides étudié sur la sécrétion cytokinique, suggérant un mode d'action différent de ces derniers sur la stimulation de la prolifération des splénocytes. Ces résultats suggèrent donc que certains peptides trouvés dans la séquence primaire des protéines majeures du lactosérum posséderaient un effet sur la réponse immunitaire spécifique.

L’induction de la tolérance orale est une des stratégies intéressantes pour prévenir les allergies alimentaires chez les enfants classés à risque. D’autre part, la composition de la microflore intestinale des enfants est un facteur important pour le développement de la tolérance. L’effet des bactéries probiotiques sur la tolérance orale a été très peu étudié et leurs mécanismes d’action sont mal documentés. Nous avons comparé l’effet de trois souches probiotiques sur l’induction et le maintien de la tolérance orale à la β-lactoglobuline chez la souris. Il a été observé que l’effet des probiotiques dépend de la souche utilisée et que la tolérance orale est bien induite et maintenue, aux niveaux humoral et cellulaire, en présence de Lactobacillus paracasei NCC2461. Les mécanismes d’action des probiotiques semblent être reliés à leur activité métabolique puisque des peptides issus de la β-lactoglobuline bovine, et libérés par L. paracasei ou Bifidobacterium lactis NCC362, modulent la réponse immune. Par contre, la stimulation de la voie de la cyclooxygénase-2 par les probiotiques n’a pas été observée, alors que l’implication de cette enzyme dans les mécanismes de la tolérance orale a clairement été démontrée. / Inducing oral tolerance to commonly allergenic food proteins is seen as a promising means to prevent food allergy in newborn population diagnosed as at risk of allergy. The intestinal microbiota has been shown to play a key role in oral tolerance development. Recently, a great interest has been focused on probiotic bacteria for their purported beneficial effects on human health but their effects on oral tolerance induction have been poorly investigated. The effect of three probiotic strains (Lactobacillus paracasei NCC2461, Lactobacillus johnsonii NCC533 and Bifidobacterium lactis NCC362) has been investigated and oral tolerance to bovine β-lactoglobulin (BLG) has been better induced and maintained in mice mono-colonized with L. paracasei. B. lactis and L. paracasei might induce oral tolerance through the hydrolysis of BLG and releasing of peptides with modified immunological properties. L. paracasei enzymes mainly hydrolyze acidic BLG-derived peptides and release smaller ones, which suppress splenocyte proliferation, down-regulate IFN-γ and IL-4 production and up-regulate IL-10 secretion. In contrast, hydrolysis of acidic BLG-derived peptides by B. lactis enzymes releases peptides, which stimulate splenocyte proliferation, IFN-γ and IL-10 production and down-regulate IL-4. Moreover, the residual allergenicity of released peptides is significantly reduced after B. lactis hydrolysis. These results suggest that L. paracasei and B. lactis might promote oral tolerance by activating different cellular mechanisms: L. paracasei stimulating the active suppression pathway, whereas B. lactis stimulating T helper type 1 lymphocytes downregulating T helper type 2 lymphocytes, implicated in allergy. On the other side, neither L. paracasei nor B. lactis was shown to stimulate the cyclooxygenase-2 pathway while its implication in oral tolerance induction has been clearly demonstrated.

En raison des restrictions législatives de plus en plus sévères sur la pollution de l'environnement, les industries laitières font face au fil des dernières années à un défi crucial de valorisation des grandes quantités de lactosérum générées. Ainsi, grâce aux récents progrès technologiques et scientifiques ainsi que la forte croissance du marché d'ingrédients biofonctionnels, une voie de valorisation plus efficiente et prometteuse du lactosérum a émergé. En effet, au cours des dernières années, plusieurs études ont démontré que les attributs nutritionnels et biofonctionnels du lactosérum sont particulièrement liés à ses protéines qui constituent une source optimale d'ingrédients alimentaires fonctionnels et de peptides bioactifs. Ainsi, la β-lactoglobuline (β-lg), protéine majeure du lactosérum est un additif fréquemment utilisé dans une large gamme de produits alimentaires en raison de ses excellentes propriétés biofonctionnelles, de sa valeur nutritionnelle élevée et de son faible coût. Ces propriétés biofonctionnelles de la β-lg peuvent être améliorées par différentes méthodes de traitement, notamment les traitements physiques, chimiques et enzymatiques. Cependant, en raison de sa structure globulaire compacte, la β-lg sous sa forme native est relativement résistante aux modifications. Bien que les traitements conventionnels soient efficaces pour améliorer les propriétés structurelles et fonctionnelles des protéines ainsi que la production de peptides biologiquement actifs, ils sont cependant consommateurs de ressources et peuvent affecter négativement la qualité des produits finaux. Par conséquent, l'application de méthodes de traitement physique non thermique émergentes s'avère nécessaire. Ainsi, dans le cadre de ce projet doctoral, les traitements électriques à hauts voltages (TEHV) respectueux de l'environnement, notamment les champs électriques pulsés (CEP) et les arcs électriques (ARC) ont été utilisés comme méthode de prétraitement de la β-lg. Un prétraitement thermique de la β-lg a été effectué afin de comparer l'efficacité des prétraitements par TEHV avec l'approche conventionnelle. De ce fait, les échantillons de β-lg préchauffés étaient considérés comme témoin positif et ceux de la forme native, comme témoin négatif. L'effet des prétraitements sur les propriétés fonctionnelles de la β-lg a été évalué. De même, l'impact des TEHV et du prétraitement thermique sur la structure de la β-lg et sa susceptibilité à l'hydrolyse trypsique et chymotrypsique a été étudié. La chromatographie liquide ultra-performante couplée à la spectrométrie de masse en tandem (UPLC-MS/MS) a été utilisée afin d'analyser et de caractériser les fractions peptidiques issus des différents hydrolysats de la β-lg. De plus, les scores d'éco-efficience (EE) de génération de peptides après hydrolyses trypsique et chymotrypsique ont été calculés dans le but de déterminer laquelle des méthodes de prétraitement était la plus efficiente. Les résultats ont démontré une amélioration des propriétés fonctionnelles (propriétés moussantes, émulsifiantes et d'hygroscopicité) de la β-lg favorisée par l'impact positif des TEHV sur sa structure secondaire. En effet, les analyses structurales ont montré que les TEHV ont induit une modification partielle de la conformation de la β-lg. Une telle modification structurelle a eu pour conséquence une augmentation du degré d'hydrolyse (DH) de près de 2 fois après prétraitement par TEHV comparée à la protéine native. Dans le cas du prétraitement par chauffage conventionnel, l'augmentation du DH était d'environ 1,2 fois comparée à la protéine native. Ces résultats ont été confirmés par l'amélioration des paramètres cinétiques de la β-lg à l'état d'équilibre, après les TEHV. Par ailleurs, une différence significative a été observée entre la trypsine et la chymotrypsine quant au DH et l'efficacité catalytique des deux enzymes. En effet, les constantes d'efficacité catalytique de la chymotrypsine étaient plus élevées que celles de la trypsine, suggérant une meilleure affinité de la chymotrypsine pour la protéine par rapport à la trypsine. En outre, l'analyse des échantillons prétraités en UPLC-MS/MS a démontré que l'application des TEHV a conduit à la libération de peptides à partir des molécules de β-lg avant même l'ajout de trypsine et de chymotrypsine aux milieux réactionnels. De plus, les TEHV ont généré en moyenne 37 à 50 % plus de peptides que les protéines natives et préchauffées. Enfin, l'analyse de l'EE a révélé que les TEHV constituaient une méthode de prétraitement plus éco-efficiente que la méthode conventionnelle car leurs scores EE étaient plus élevés tant pour les procédés d'hydrolyse que pour les peptides bioactifs résultant de l'hydrolyse. Cette thèse apporte également de nouveaux éléments de compréhension quant à la valorisation multidirectionnelle des protéines du lactosérum. / Due to increasingly severe legislative restrictions on environmental pollution, dairy industries have faced over the past few years a crucial challenge of valuing the large quantities of whey generated. Thus, thanks to recent technological and scientific progress as well as the important growth of the biofunctional ingredients market, a more efficient and promising way of whey valorization has emerged. Indeed, in recent years, several studies have demonstrated that the nutritional and biofunctional attributes of whey are particularly linked to its proteins, which constitute an optimal source of functional food ingredients and bioactive peptides. Therefore, ß-lactoglobulin (β-lg), a major whey protein is an additive frequently used in a wide range of food products due to its excellent biofunctional properties, its high nutritional value and its low cost. These biofunctional properties of β-lg can be improved by different treatment methods, including physical, chemical and enzymatic ones. However, due to its compact globular structure, β-lg in its native form is relatively resistant to modifications. Although conventional treatments are effective in improving the structural and functional properties of proteins as well as the production of biologically active peptides, they are nonetheless resource intensive and can negatively affect the quality of final products. Therefore, the application of emerging non-thermal physical treatment methods is necessary. Thus, in the frame of this doctoral project, sustainably high-voltage electrical treatments (HVET), namely pulsed electric fields (PEF) and electric arcs (ARC) were used as pretreatment method of β-lg. Thermal pretreatment of β-lg was performed in order to compare the efficiency of HVET pretreatments with the conventional approach. Therefore, the preheated β-lg samples were considered as positive control and those of the native one as negative control. The effect of pretreatments on the functional properties of β-lg was evaluated. Likewise, the impact of HVET and heat pretreatments on the structure of β-lg and its susceptibility to tryptic and chymotryptic hydrolyses was investigated. Ultra-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) was used to analyze and characterize the peptide fractions from the various hydrolysates of β-lg. In addition, the eco-efficiency (EE) scores of peptide generation after tryptic and chymotryptic hydrolyses were calculated in order to determine which of the performed pretreatment methods was the most efficient. The results demonstrated an improvement in the functional properties (foaming, emulsifying and hygroscopicity properties) of β-lg promoted by the positive impact of HVET on its secondary structure. Indeed, structural analyzes have shown that HVET induced a partial modification of the conformation of β-lg. Such structural modification resulted in almost 2-times increase in the degree of hydrolysis (DH) after HVET pretreatments compared to the native protein. In the case of the conventional heating pretreatment, the increase in DH was approximately 1.2-times compared to native protein. These results were confirmed by the improvement in the kinetic parameters of β-lg at steady state after HVET. Furthermore, a significant difference was observed between trypsin and chymotrypsin with regard to DH and the catalytic efficiency of the two enzymes. Indeed, the catalytic efficiency constants of chymotrypsin were higher than those of trypsin, suggesting a better affinity of chymotrypsin with the protein compared to trypsin. In addition, the UPLC-MS MS analysis of pretreated samples demonstrated that the application of HVET led to the release of peptides from β-lg molecules even before the addition of trypsin and chymotrypsin to the reaction media. Additionally, the HVET have generated in average 37-50% more peptides than native and preheated proteins. Finally, the EE analysis revealed that HVET were the most efficient pretreatment method than the conventional one as their EE scores were higher for both hydrolysis processes and bioactive peptides generated from performed hydrolyses. This thesis highlights new understanding elements regarding the multidirectional valorization of whey proteins.

L’interaction associative entre la β-lactoglobuline et le xanthane (natif ou traité par hautes pressions hydrodynamiques) résultant en la formation de complexes électrostatiques a été étudiée par diverses techniques chimiques et physiques. L’objectif principal était d’approfondir les connaissances fondamentales au niveau moléculaire sur les interactions protéines – polysaccharides anioniques. Il a été trouvé que le mécanisme de séparation de phases associative suivi par ce système est une nucléation et croissance qui résultant en la formation de diverses structures fractales. Notamment, des différences de taille, de structure interne (compacité) et de solubilité ont été obtenues selon, entre autres, le pH et le ratio protéine – xanthane qui dirigent les processus de structuration dans le système en gouvernant, respectivement, la densité de charge des molécules et les effets d’équilibre de masse. L’importance et l’effet des forces de cisaillement appliquées (ou non) ainsi que la méthode d’acidification utilisée pendant la séparation de phases ont aussi été démontrés. Ainsi, lorsque la complexation a lieu sous cisaillement, la taille et la structure des complexes sont déterminées par un processus de restructuration induit par une compétition entre les forces électrostatiques attractives et les forces de rupture dues à l’écoulement. D’autre part, il a été démontré que le degré d’agrégation du xanthane est responsable des différentes structures formées puisque c’est le polysaccharide qui agit comme support lors de la complexation. Particulièrement, à des taux d’acidification lents, la taille des complexes peut être contrôlée en modifiant le poids moléculaire du xanthane. Les propriétés fonctionnelles des complexes obtenus peuvent ainsi être modifiées et façonnées en ajustant divers paramètres initiaux (ratio protéine – xanthane, poids moléculaire du xanthane) ainsi que les conditions présentes lors de leur fabrication (cisaillement, vitesse d’acidification). La fonctionnalité des complexes comme substituts de matière grasse a été évaluée dans des formulations modèles de garniture à biscuit ou glaçage à gâteaux. Les complexes ont conféré de bons attributs de viscosité et de texture aux échantillons faibles en gras. / The associative interaction between β-lactoglobulin and xanthan gum (native or treated by high hydrodynamic pressures) resulting in the formation of electrostatic complexes was studied by several chemical and physical techniques. The main objective was to develop a fundamental knowledge of this system at a molecular level, to better understand the interactions between proteins and anionic polysaccharides. The associative phase separation in this system proceeded via a nucleation and growth mechanism that resulted in the formation of distinct fractal structures. Namely, differences in size, internal structure (compactness), and solubility were obtained depending principally on the pH and initial protein to polysaccharide ratio; which, in turn governed molecular charge density and mass action equilibrium effects determining the structuration processes. The important effects of the acidification method and the shearing forces applied during complexation were also identified. Particularly, it was revealed that when shear forces were applied during complexation the size and the structure of interpolymeric complexes were determined by restructuring processes set by a competition between attractive electrostatic forces and rupture forces caused by flow. Moreover, it was found that the aggregation pattern of xanthan gum was responsible for the formation of the different structures since it is the polysaccharide that acts as the support during complexation. Accordingly, at slow rates of acidification, a modification of the molecular weight of xanthan gum can control the size of the complexes. Therefore, the characteristics and functional properties of the complexes can be modified and tailored by adjusting the initial parameters and the conditions present during their manufacture.

La protéine majeure du lactosérum, la β-lactoglobuline (βlg) est bien reconnue pour ses propriétés structurales intéressantes lui permettant d’établir des interactions avec des ligands de taille et de caractéristiques différentes. La riboflavine (RF) et la vitamine D3 (D3) ont été sélectionnées comme modèles de petits nutraceutiques amphiphiles et hydrophobes, respectivement, et le lysozyme (Lyso), comme ligand protéique de plus grande taille. La capacité de la βlg à lier la RF a été étudiée par des méthodes spectroscopiques. La βlg et la RF forment le complexe βlg-RF dont la photoactivation génère une activité antiproliférative contre les cellules cancéreuses de la peau, démontrée en utilisant le protocole du NCI/NIH Developmental Therapeutics Program. La cytotoxicité serait probablement due à la génération d’espèces oxydatives réactives résultant de l’interaction entre la RF et la βlg. L’impact de la formation du βlg-D3 sur la solubilité et stabilité de la D3 a été étudié en utilisant des méthodes spectroscopiques et de chromatographie. Les résultats ont démontré que le complexe βlg-D3 était stable aux pHs gastrique et intestinal et augmentait la solubilité de la D3. De plus, une matrice protéique appelée coagulum enrichie en D3 (94.5 ± 1.8 % de taux d’encapsulation) été formée à partir du complexe βlg-D3 grâce à l’aptitude de la βlg à s’auto-associer. Les images de microscopie électronique ont montré que les interactions électrostatiques entre la βlg et Lyso ont pour leur part, abouti à la formation de microsphères pouvant encapsuler la D3 à un taux élevé (90.8 ± 4.8 %). La capacité des matrices à base de βlg à transporter, protéger et à améliorer la solubilité, la stabilité et la biodisponibilité de la D3 a été évaluée en effectuant des expériences in vitro et in vivo chez des modèles animaux. Les matrices protéiques à base de βlg ont significativement augmenté la solubilité, stabilité et biodisponibilité de la D3 (p < 0.001). Ces études prouvent que la βlg, grâce à ses caractéristiques suturales, pourrait former des matrices protéiques compatibles avec une administration orale et les aliments, tout en préservant l’activité biologique de la RF, de la D3 et donc possiblement d’autres molécules bioactives / The major whey protein, β-lactoglobulin (βlg) is well recognized for its interesting structural properties and ability to interact with ligands with varying size and characteristics. Riboflavin (RF) and vitamin D3 (D3) were selected as small amphiphilic and hydrophobic nutraceutical models, respectively, and Lysozyme, as a larger size ligand model. Spectroscopic methods were used to demonstrate interaction between βlg and RF. βlg and RF form a complex, which was irradiated according to the NCI/NIH Developmental Therapeutics Program. The βlg-RF complex exhibited an important anti-proliferative activity against skin melanoma cancer cell lines, probably due to the generation of reactive oxygen species as the result of the interaction between RF and βlg. The impact of the βlg-D3 complex on the solubility and stability of the D3 was studied using spectroscopic methods and chromatography. The findings indicate that the βlg-D3 complex is stable at the gastric and intestinal pHs and increases the solubility of the vitamin. A βlg-based scaffold, named coagulum, enriched with D3 (94.5 ± 1.8 % of encapsulation efficiency) was prepared by using the capacity of βlg to self-aggregate. Electronic microscopy images showed that microspheres, with high D3 encapsulation efficiency (90.8 ± 4.8 %), were formed as the result of electrostatic interactions between βlg and Lyso. The efficiency of βlg-based scaffolds to improve the solubility, stability and bioavailability of the D3 was evaluated by performing in vitro and in vivo experiments using animal model. The βlg-based scaffolds significantly increased the solubility, stability bioavailability of D3 (p < 0.001). Overall, the present study showed that βlg, due to its structural properties, can be used to form protein-based matrices compatible with a food and an oral administration while preserving the biological activity of RF, D3 and possibly other bioactive molecules.

La β-lactoglobuline (β-Lg) bovine contient plusieurs séquences peptidiques à activité biologique qui présentent un intérêt à titre d’ingrédients nutraceutiques. Toutefois, des études ont démontré que certains de ces peptides, actifs lors de tests in vitro, sont inefficaces suite à leur ingestion orale chez l’animal, suggérant leur dégradation lors du transit gastro-intestinal. L’objectif de ce travail était d’étudier les interactions β-Lg:peptide bioactif et d’évaluer l’impact de ces interactions sur la digestibilité in vitro des complexes. Premièrement, il a été démontré que l’hydrolyse pepsique et chymotrypsique de certains peptides bioactifs varie en fonction de la longueur de la chaîne peptidique, la nature du peptide et la présence d’autres peptides dans le milieu réactionnel. Par la suite, il a été démontré à l’aide d’une méthode d’ultrafiltration que les peptides β-Lg f102-105, f142-148 et f69-83 se lient en quantité significative à la β-Lg A, avec des taux de fixation de 1.5, 1.1 et 0.7 moles de peptides par mole de protéine respectivement. Ces résultats ont été validés par spectroscopie de fluorescence frontale. Les spectres d’émission de fluorescence ont démontré que la liaison de ces peptides à la β-Lg A modifie l’environnement des résidus tryptophane dans la structure de la protéine. De plus, une analyse par calorimétrie à titration isothermique a démontré que le peptide antihypertensif β-Lg f142-148 se lie à la β-Lg A selon un modèle de liaison séquentielle à trois sites. Pour ce peptide, les isothermes de liaison ont révélé des constantes d’association de 2 X 103, 1 X 103 et 0.4 X 103 M-1 pour le 1ier, 2ième et 3ième site de liaison, avec une enthalpie de liaison exothermique dans le cas des deux premiers sites, mais endothermique pour le troisième site. Enfin, l’hydrolyse in vitro de la protéine et des complexes à l’aide de pepsine, trypsine, chymotrypsine et pancréatine a démontré que le les complexes sont hydrolysés plus lentement que la protéine native par la chymotrypsine ou un mélange pepsine/chymotrypsine. L’ensemble de ces résultats supporte donc l’hypothèse que la liaison de peptides bioactifs à la β-Lg A pourrait permettre d’améliorer leur résistance à la protéolyse et ainsi, maintenir leur intégrité structurale et leur bioactivité lors du transit gastro-intestinal. / Bovine β-lactoglobulin (β-Lg) contains numerous peptide sequences with biological activities, which have a high potential as nutraceutical ingredients. However, studies have demonstrated that some of these peptides, which are active during in vitro tests, loose their activity in animal models following oral ingestion, suggesting their enzymatic degradation during gastrointestinal transit. The aim of this work was to study β-Lg:bioactive peptide interactions and to investigate the in vitro digestibility of the resulting complexes. Firstly, it was shown that pepsic and chymotryptic digestions of some bioactive peptides varied according to the peptide chain length, the nature of the peptide and the presence of other peptides in the reaction medium. Using an ultrafiltration method, it was demonstrated that peptides β-Lg f102-105, f142-148 and f69-83 bind to β-Lg A in significant amounts corresponding to 1.5, 1.1 and 0.7 moles of peptides per mole of protein respectively. These results were validated by front-face fluorescence spectroscopy, which also provided evidences that the binding of the three peptides to β-Lg A modified the polarity of tryptophan environment in the protein structure. In addition, binding isotherms obtained by isothermal titration calorimetry showed that the binding of the antihypertensive peptide β-Lg f142-148 to β-Lg A followed a sequential three-site binding model with constants of associations of 2 X 103, 1 X 103 and 0.4 X 103 M-1 for the 1st, 2nd, and 3rd binding sites respectively. The enthalpy of binding was exothermic for the 1st and 2nd binding sites and endothermic for the 3rd binding site. Lastly, the in vitro digestibility of the protein and the complexes with pepsin, trypsin, chymotrypsin, and pancreatin showed that the complexes were hydrolyzed more slowly than the native protein by chymotrypsin or pepsin/chymotrypsin. The overall results support the hypothesis that the binding of bioactive peptides to β-Lg A could improve their resistance to proteolysis, and thus could contribute to maintain their structural integrity and bioactivity during gastrointestinal transit.