A chaque instant notre organisme est confronté à des agents pathogènes de nature très variable. Pourtant, malgré toutes les agressions rencontrées, il maintient une certaine intégrité. Cette dernière résulte de la mise en place d’un système de défense perfectionné, fruit de la collaboration étroite de diverses cellules : le système immunitaire. Parmi toutes les cellules qui le composent, les cellules dendritiques jouent un rôle prépondérant. Disséminées dans la plupart de nos organes et tissus, elles surveillent, en alerte du moindre danger. Elles orchestrent la réponse immune : elles sont capables d'initier et polariser une réponse immune ou d'instaurer la tolérance. De nombreux traitements thérapeutiques tentent d’exploiter leurs capacités intrinsèques. Ces cellules présentent en effet un grand potentiel dans la vaccination anti-tumorale et antivirale, dans l’acceptation de greffes et le contrôle de maladies auto-immunes. Toutefois, de nombreux éclaircissements restent encore à apporter que ce soit sur l’ontogénie des cellules dendritiques, leur rôle ou leur propre biologie. Aussi, le dessein de ce travail était d’approfondir nos connaissances fondamentales sur les propriétés moléculaires et la biologie des cellules dendritiques afin de mieux appréhender la nature et l’amplitude des réponses qu’elles induisent. A cette fin, nous avons identifié deux nouveaux gènes qu’elles expriment préférentiellement et nous avons essayé de caractériser leur fonction. L’avènement de l’utilisation de la technique d’ARN interférence dans les systèmes de mammifères et le développement des vecteurs lentiviraux nous sont apparus comme des outils présentant un réel potentiel pour répondre à nos questions. Nous avons donc généré des souris qui sur- ou sous- expriment le gène d’intérêt, par infection lentivirale d’embryons, pour tenter de cerner son rôle in vivo. Cette méthode de transgénèse était très prometteuse car rapide, efficace, peu onéreuse et sollicitait peu de compétences pour la manipulation des embryons. Cependant, l’approche s’est révélée plus laborieuse que prévu. Nous avons en effet rencontré de nombreux phénomènes de variégation et de « silencing » qui a rendu plus ardue l’utilisation des souris transgéniques. Néanmoins, nous pensons aujourd’hui être à même d’élaborer une stratégie de sélection des souris générées par transgénèse lentivirale qui ne développeraient probablement pas les problèmes rencontrés. Au cours de l’étude, nous avons également observé une fluctuation de l’activité du promoteur CAG pendant le développement thymique, pointant l’importance du choix d’un promoteur optimal en fonction du projet de recherche. Enfin, l’analyse des souris, bien que préliminaire, suggère un rôle potentiel d’un des gènes examinés dans la différenciation, la mobilisation ou la survie des cellules dendritiques, des macrophages et des lymphocytes B.

Les IFN-I (interférons de type I), principalement IFN et , constituent un mécanisme de défense primordial de l’hôte contre les pathogènes. Pourtant, dans le cas du VIH-1 (virus de l’immunodéficience humaine), la relation entre les IFN-I et la réplication virale apparaît plus complexe. En effet, si les IFN-I inhibent la réplication du VIH-1 ex vivo, un état d’hyperactivation permanent de la réponse IFN-I a été récemment associé à la progression vers le SIDA ainsi qu’à une forte virémie chez les patients infectés par le VIH-1. De même, la dérégulation de la réponse IFN-I est un critère déterminant dans l’issue pathogénique de certains modèles d’infection virale chez le singe. Si l’hypothèse du rôle pathogénique des IFN-I s’avère correcte, le VIH-1 pourrait avoir évolué afin de se répliquer même en présence d’une telle réponse, qui semble être au final, plus délétère pour l’hôte que pour le virus. L’objectif de ce travail a été d’évaluer la résistance du VIH-1 aux IFN. Dans ce contexte, le VIH-1 a été comparé au VIH-2 et au SIVmac (virus de l’immunodéficience simienne), virus phylogénétiquement proches mais peu ou pas pathogènes pour l’homme, lors de l’infection de plusieurs types cellulaires tels que des lymphocytes, des macrophages et des cellules dendritiques. En accord avec l’hypothèse initiale de travail, les expériences réalisées ont montré que le VIH-1 est capable de se répliquer dans les cellules primaires prétraitées avec des doses d’IFN comparables à celles mesurées in vivo, alors que la réplication des virus VIH-2/SIVmac est complètement bloquée, même à des concentrations très faibles d’IFN. Ce travail a permis de démontrer que le blocage induit par l’IFN s’exerce au niveau des phases précoces de l’infection et plus précisément à l’étape de la transcription inverse. En effet, les données obtenues suggèrent que l’IFN induit l’expression d’un effecteur cellulaire qui affecte différentiellement la stabilité des complexes viraux, ce qui se traduit par un défaut d’accumulation de l’ADN viral plus important pour le VIH-2 et le SIVmac, que pour le VIH-1. La différence de susceptibilité des lentivirus de primates aux IFN-I pourrait ainsi expliquer en partie, les différents niveaux de réplication de ces virus, associés à leurs degrés de pathogénicité in vivo. / Type I Interferons (IFN-α/β, herein IFNs) provide an important mechanism of defense against pathogens and regulate in a paracrine and autocrine manner both intrinsic and adaptive immune responses. In the case of HIV-1 however, the relationship between IFNs and viral replication appears more complex. Indeed, if IFNs have been described to interfere with HIV-1 at basically all phases of its life cycle ex vivo, an IFN-induced state is linked to AIDS progression and to high viral loads in HIV-1 infected individuals. Similarly, a deregulated and prolonged IFN production/state seems one of the main distinguishing features between pathogenic and non-pathogenic SIV infection in primate animal models, suggesting that a deregulated IFN-state may be more detrimental to the host than to the virus itself in vivo.If this hypothesis is correct and if HIV-1 plays an active role in the perpetration of this antiviral state, it is possible that HIV-1 may have overall evolved to cope with this environment, remaining able to replicate despite it.To determine whether HIV-1 was better armed to replicate in the presence of an IFN-state environment than other primate lentiviruses, we compared HIV-1 to SIVmac and more importantly to HIV-2 that albeit capable of inducing AIDS in humans does so in a much less aggressive manner. In agreement with the initial hypothesis, our results indicate that HIV-1 is better fit to replicate in primary cells in the presence of amounts of IFN comparable to the ones measured in vivo, while the replication of HIV-2/SIVmac viruses is completely blocked even in the presence of low levels of IFN. By decorticating the effects of IFNs on the early and late phases of the viral life cycle in primary macrophages, we show here that the main target of the differential action of IFNs are the early phases of infection. More specifically, with time kinetics that we determine herein, IFNs induce cellular factor/s that differentially affect the stability of pre-reverse transcription complexes of HIV-2, but not of HIV-1. Our results could underlie a different evolutionary adaptation of primate lentiviruses to interferons that might be responsible for their different pathogenicity in vivo.

Le déclin de la fonction respiratoire dans l’asthme est associé à une augmentation de la massedu muscle lisse bronchique. La cellule musculaire lisse (CML) bronchique joue un rôle central dans la physiopathologie de l'asthme. Elle participe à l'inflammation et constitue une composante importante du remodelage des voies aériennes. Récemment, le rôle de la chitinaseYKL-40 comme bio marqueur de ce remodelage dans l'asthme a été évoqué. Dans ce contexte, la question centrale ayant motivé une partie de ce travail de thèse, a été d'étudier les effets d'YKL-40 sur différentes propriétés des CML. Nous nous sommes également intéressés au récepteur activé par les protéases, de type 2 (PAR-2), potentiel récepteur d'YKL-40, mais aussi acteur principal de l’inflammation bronchique.Ce travail a permis d'établir qu'YKL-40 est plus qu'un simple bio marqueur dans l'asthme puisqu’elle altère les propriétés physiologiques de la CML, et semble jouer un rôle dans le remodelage musculaire lisse bronchique. Par ailleurs, ce travail a également permis de mettre en évidence une surexpression du PAR-2 dans les CML d’asthmatiques ainsi qu’une augmentation de son expression et de la prolifération cellulaire, en réponse à une stimulation chronique. Ce travail a enfin permis d’optimiser la technique de l’interférence ARN lentivirale dans les CML bronchiques humaines. / The decline in lung function in asthma is associated with an increased bronchial smooth muscle (BSM) mass. BSM cells play a central role in the pathophysiology of asthma. They are involved in inflammation and are an important component of airway remodelling. Recently, the role of the chitinase YKL-40 as biomarker of this remodelling in asthma has been evoked. In this context, the central question that motivated part of this thesis was to study the effects of YKL-40 on various properties of BSM cells. We also studied the protease activated receptor 2 (PAR-2), as a potential receptor of YKL-40, as well as an important actor of airway inflammation.This work has established that YKL-40 is more than just a biomarker for asthma since YKL-40 alters physiological properties of BSM cells and appears to play a role in BSM remodelling. Moreover, this work has also highlighted an overexpression of PAR-2 in asthmatic BSM cells, as well as an increase of both PAR-2 expression and BSM cell proliferation in response to chronic stimulation. This work has finally allowed us to optimize lentiviral RNA interference in human BSM cells.

L’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) reste un problème de santé publique avec plus de 880 000 décès chaque année dans le monde. Au stade chronique de l’infection virale B, des complications peuvent survenir comme la fibrose, la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. L'implication du VHB, de ses protéines ou de sa variabilité génétique dans la fibrose hépatique reste à élucider. Toutefois, des méta-analyses semblent montrer un lien statistiquement significatif entre la présence de la double mutation A1762T/G1764A dans le promoteur basal du core (PBC) du VHB et la fibrose sévère. C’est pourquoi nous avons orienté nos travaux de recherche selon deux axes : l’implication des mutations du PBC et de la région précore (PC) dans la sévérité des lésions hépatiques ainsi que le rôle des protéines HBc et HBe du VHB dans l’induction de la fibrogénèse. Dans un premier temps, deux études cliniques ont permis de confirmer l’association significative du double mutant PBC avec la fibrose sévère indépendamment du génotype viral. Nous avons également démontré un effet antagoniste de la mutation G1899A située dans la région PC vis-à-vis du double mutant PBC dans la sévérité de la fibrose. La deuxième partie de nos travaux a consisté à développer une technique innovante de production de protéines en utilisant la transduction de la lignée HepaRG par des vecteurs lentiviraux contenant la séquence de la protéine GFP (green fluorescent protein). En parallèle, nous avons synthétisé des particules lentivirales contenant les séquences sauvages et mutées du PBC et de la région PC, avec pour objectif de produire les protéines HBc et HBe dans les HepaRG. / The hepatitis B virus (HBV) infection remains a significant public health problem with more than 880 000 deaths every year worldwide. At the stage of chronic HBV infection, complications can occur such as fibrosis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The role of HBV, its protein and its genomic variability in fibrosis are still unclear. Meta-analysis seems to indicate a strong link between the double mutation A1762T/G1764A detection in the basal core promotor (BCP) of HBV and the development of fibrosis. In this context, our work aimed to explore: i. the implication of BCP or precore (PC) regions mutations on the severity of fibrosis, and ii. the role of HBc and HBe proteins in fibrosis induction. For the first approach, our studies confirmed the association between the presence of the BCP double mutation and severe fibrosis, independently of the viral genotype. We also showed that the G1899A mutation in the PC region presents an antagonist effect regarding the double BCP mutant for fibrosis severity. In the second part of our work, we developed an innovative technology to produce protein via the transduction of HepaRG cells using lentiviral technology with a plasmid vector containing GFP (greenfluorescent protein) sequence. We also obtained lentiviral particles containing the wild and mutated sequences for the BCP and PC regions, in order to produce HBc and HBeprotein in HepaRG cells and to explore of the pathogenic role of BCP and PC mutants.

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A chaque instant notre organisme est confronté à des agents pathogènes de nature très variable. Pourtant, malgré toutes les agressions rencontrées, il maintient une certaine intégrité. Cette dernière résulte de la mise en place d’un système de défense perfectionné, fruit de la collaboration étroite de diverses cellules :le système immunitaire. Parmi toutes les cellules qui le composent, les cellules dendritiques jouent un rôle prépondérant. Disséminées dans la plupart de nos organes et tissus, elles surveillent, en alerte du moindre danger. Elles orchestrent la réponse immune :elles sont capables d'initier et polariser une réponse immune ou d'instaurer la tolérance. De nombreux traitements thérapeutiques tentent d’exploiter leurs capacités intrinsèques. Ces cellules présentent en effet un grand potentiel dans la vaccination anti-tumorale et antivirale, dans l’acceptation de greffes et le contrôle de maladies auto-immunes. Toutefois, de nombreux éclaircissements restent encore à apporter que ce soit sur l’ontogénie des cellules dendritiques, leur rôle ou leur propre biologie. <p><p>Aussi, le dessein de ce travail était d’approfondir nos connaissances fondamentales sur les propriétés moléculaires et la biologie des cellules dendritiques afin de mieux appréhender la nature et l’amplitude des réponses qu’elles induisent. A cette fin, nous avons identifié deux nouveaux gènes qu’elles expriment préférentiellement et nous avons essayé de caractériser leur fonction. L’avènement de l’utilisation de la technique d’ARN interférence dans les systèmes de mammifères et le développement des vecteurs lentiviraux nous sont apparus comme des outils présentant un réel potentiel pour répondre à nos questions. Nous avons donc généré des souris qui sur- ou sous- expriment le gène d’intérêt, par infection lentivirale d’embryons, pour tenter de cerner son rôle in vivo. Cette méthode de transgénèse était très prometteuse car rapide, efficace, peu onéreuse et sollicitait peu de compétences pour la manipulation des embryons. Cependant, l’approche s’est révélée plus laborieuse que prévu. Nous avons en effet rencontré de nombreux phénomènes de variégation et de « silencing » qui a rendu plus ardue l’utilisation des souris transgéniques. Néanmoins, nous pensons aujourd’hui être à même d’élaborer une stratégie de sélection des souris générées par transgénèse lentivirale qui ne développeraient probablement pas les problèmes rencontrés. Au cours de l’étude, nous avons également observé une fluctuation de l’activité du promoteur CAG pendant le développement thymique, pointant l’importance du choix d’un promoteur optimal en fonction du projet de recherche. Enfin, l’analyse des souris, bien que préliminaire, suggère un rôle potentiel d’un des gènes examinés dans la différenciation, la mobilisation ou la survie des cellules dendritiques, des macrophages et des lymphocytes B.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished