Les vecteurs lentiviraux (LVs) dérivés du virus de l’immunodéficience humaine de type I (VIH-1) sont des outils efficaces de transfert de gène, largement utilisés en thérapie génique, en particulier pour la transduction ex vivo de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (CSPHs). Cette thèse porte sur la caractérisation de deux nouveaux additifs de culture permettant de promouvoir l’entrée des LVs dans les cellules cibles : Vectofusin-1 et Tat-Beclin1. Dans un premier temps, mon travail a consisté à caractériser la structure-fonction de la nouvelle famille de Vectofusins, dérivés du peptide LAH4. Dans cette étude, Nous avons comparé l’efficacité de transduction des CSPHs en présence de différents mutants peptidiques de la Vectofusin-1. Nous avons montré que la Vectofusin-1 est le peptide le plus performant parmi tous les isomères de Vectofusin pour la transduction des CSPHs avec les pseudotypes VSV-G-LV et GALVTR-LV. Nos résultats montrent l’importance de (i) l’angle polaire à 140° formé par les résidus histidine dans la représentation de Schiffer-Edmundson, (ii) la présence de résidus lysine à l’extrémité N-terminale, et (iii) l’utilisation de leucines comme résidus hydrophobes. Ces paramètres cruciaux pour la fonction biologique des peptides de la famille Vectofusin nous permettent de mieux comprendre leur mécanisme d’action. Cette thèse porte également sur l’étude du nouvel additif de culture Tat-Beclin1, décrit dans la littérature comme étant un inducteur d’autophagie et un inhibiteur puissant de la réplication virale, en particulier du VIH-1. De façon surprenante, nous avons observé que l’utilisation de faibles doses de Tat-Beclin1 augmente fortement les niveaux de transduction de lignées cellulaires et de CSPHs en présence de divers pseudotypes LVs. Au sein de cette étude nous avons montré que ce peptide Tat-Beclin1 est compatible avec une application en thérapie génique grâce à l’absence de cytotoxicité que ce soit ex vivo ou in vivo lors de l’utilisation de modèle murin humanisé NSG pour la greffe de CSPHs. Le peptide Tat-Beclin1 agit au niveau de l’étape d’entrée, en potentialisant l’adhésion et la fusion virale, sans induire l’agrégation des particules virales. Des études du flux autophagique montrent que Tat-Beclin1 n’induit pas d’autophagie aux faibles doses utilisées. Ceci suggère que ce nouvel additif de culture agit à travers des voies moléculaires encore inconnues impliquant probablement des voies de signalisation intracellulaire indépendantes de l’autophagie. En conclusion, ce travail de thèse permet de décrire Tat-Beclin1 et Vectofusin-1 comme des nouveaux additifs de culture performants pour promouvoir la transduction de cellules cibles avec des LVs de thérapie génique. / Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-derived Lentiviral vectors (LVs) are used for various gene transfer applications, notably hematopoietic gene therapy. Culture additives are necessary to promote an efficient entry of LVs into hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). This work highlights two culture additives: Vectofusin-1 and Tat-Beclin1. First, we studied the structure-function of the new family of culture additives derived from LAH4: Vectofusins. We designed Vectofusin-1 isomers and showed that Vectofusin-1 remains the lead peptide for HSPCs transduction enhancement with LVs pseudotyped with VSV-G and GALVTR envelope glycoproteins. By comparing the efficiency of numerous Vectofusin-1 mutants, it appeared the importance of (i) lysine residues on the N-terminal extremity of Vectofusin-1, (ii) a hydrophilic angle of 140° formed by histidine residues in the Schiffer-Edmundson helical wheel representation, and (iii) hydrophobic residues consisting of leucine are all essential and help to define a minimal active sequence leading to an optimal activity of the Vectofusin-1 peptide. This work also allowed the discovery of a new culture additive called Tat-Beclin1, previously described as an autophagy-inducer peptide and a powerful viral replication inhibitor, especially on HIV-1. In this study, we showed that the use of low doses of Tat-Beclin1 peptide strongly promotes the transduction of cell lines or HSPCs with LVs pseudotyped with various envelope glycoproteins. The use of low doses of Tat-Beclin1 peptide is compatible with a gene therapy application since these experiments showed no cytotoxic effect either ex vivo or in vivo using a humanized mice model of HSPCs engraftment. The Tat-Beclin1 peptide is acting on the viral entry, specifically on the adhesion and fusion steps, but without inducing any aggregation of the viral particles. Studies of the autophagic flux showed that Tat-Beclin1 is not inducing this pathway at the low doses tested. Therefore, Tat-Beclin1 is acting on LVs through signaling pathways that are still to be defined. In conclusion, Tat-Beclin1 and Vectofusin-1 peptides are performant and safe transduction enhancers for retrovirus-based vectors dedicated to gene therapy.

Une transduction efficace des cellules souches hematopoïetiques est un préalable pour la thérapie génique des maladies génétiques comme la β‐thalassemie, l’Adrenoleucodystrophie et le Déficit Immunitaire Combiné Sévère. La petite molécule UM171 à été décrite comme étant une molécule capable de stimuler l’expansion in vitro des cellules souches hématopoïétiques humaines, permettant ainsi une plus large application des thérapies basées sur les cellules souches. Nous avons aussi conduit des études supplémetaires pour confirmer la capacité de UM171 à expandre les souches hématopoïétiques. Durant ce travail, nous avons découvert que UM171 pouvait aussi augmenter de maniére significative, l’efficience de la transduction lentivirale des cellules hématopoïetiques primitives dérivées de sang de cordon. En plus, nous avons montré que UM171 augmentait la transduction des cellules hématopoïeques ayant les phénotypes les plus immatures. Des études plus approfondies ont aussi révélé que UM171 pouvait aussi augmenter la transduction des cellules souches hématopoïétiques avec des lentivirus ayant diffèrent pseudotypes. Au total ces découvertes ont pour conséquence, une nette amélioration des protocoles d’expansion et de transduction des cellules souches hématopoïétiques à travers un meilleur rendement en cellules souches et des taux élevés de transfert de gène en utilisant des quantités réduites de particules virales / Efficient lentiviral gene transfer to hematopoietic stem cells is a prerequisite for theultimate goal of gene therapy for a range of major genetic diseases such as β‐thalassemia, Adrenoleucodystrophy and severe combined immnodeficiency. The small molecule UM171 was recently described as having potent ability to stimulate ex vivo expansion of human hematopoietic stem cells, another key to safer and wider application of stem cell mediated therapies. Here we have conducted additional studies to confirm the stem cell expansion properties of UM171 and in the course of this work discovered that it also has the ability to significantly enhance the efficiency of the lentiviral transduction of primitive hematopietic cells in human cord blood. Subsequent work confirmed that this enhancing effect extends importantly to the most primitive hematopoietic subset as assessed phenotypically and by functional readout in immunodeficient mouse xenografts. Further detailed characterization ofthis phenomenom revealed that UM171’s effects are manifest rapidly and extend to a range of lentiviral pseudotypes. Together these findingsprovide an avenue for improved protocols for hematopoietic stem cell transduction that achieve higher gene efficiency and stem cell recovery coupled with the potential for reduced viral titer requirements.

Une meilleure connaissance des déterminants viraux et cellulaires impliqués dans la régulation de l’expression lentivirale est essentielle pour (i) maitriser l’expression d’un transgène dans le cadre d’un transfert de gène et (ii) mieux comprendre l’absence/la perte de l’expression du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) observé en cas de latence virale après infection. Dans ce contexte, les facteurs cellulaires impliqués dans la reconnaissance et la réparation des cassures de l'ADN, activés dès les étapes précoces du cycle viral, pourraient participer au contrôle de l’expression rétrovirale. Dans la première partie de cette étude, nous avons généré une collection de vecteurs lentiviraux codant le transgène green fluorescent protein (gfp) avec des design variés : promoteur du VIH-1 [long terminal repeat (LTRs)] ou d’origine hétérologue [e.g., promoteur viral CMV (cytomegalovirus), ou humain PGK (phosphoglycerate kinase)], intégrase native ou mutée, LTRs natifs ou self inactivating (SIN). En particulier, nous avons caractérisé l’impact de l’insertion de différentes séquences hétérologues au sein des SIN-LTRs sur l’expression du transgène gfp au cours du temps dans un contexte compétent ou déficient pour l’intégration. Nous avons mis en évidence un phénomène de modulation du niveau d’expression du transgène (d’un facteur 0,3 à 1,8; comparé aux vecteurs sans insertion) qui est dépendant de la séquence insérée et de son orientation. L’expression transgénique résulterait donc d’une balance coûts/bénéfices associés à l’insertion d’éléments aux extrémités des vecteurs qui pourrait déterminer le niveau d’expression du transgène à partir de vecteurs modifiés. Dans la seconde partie, nous avons réalisé une analyse systématique et comparative de l’expression lentivirale au sein des cellules humaines de carcinome de côlon HCT 116 déplétées pour le complexe Ku. Ce complexe, qui est essentiel à la survie chez l’homme et est impliqué dans les processus de réparation de l’ADN, a été identifié comme une cible anti-VIH potentielle. Nous avons mis en évidence que la déplétion en Ku induit une diminution de l’expression précoce du VIH-1 de façon spécifique du LTR et indépendante de Tat. Même si l’action de Ku nécessite l’intégration du VIH-1, sa déplétion ne modifie pas l’efficacité d’intégration virale mais agit plutôt au niveau transcriptionnel. Da façon importante, la réactivation de l’expression du transgène après traitement par l’activateur de NF-κB (Nuclear Factor κB), le TNFα (tumor necrosis factor α) ou un inhibiteur des déacétylases d’histones, la trichostatine A est favorisée par la déplétion en Ku. A l’inverse, en présence d’un niveau normal en Ku, les cellules exprimant le VIH-1 seraient contre-sélectionnées dans le temps. Ainsi, la déplétion en Ku pourrait promouvoir l’établissement d’un état (reactivable) de latence transcriptionelle associé à une moindre contre-sélection des cellules transduites. Les résultats issus de ce travail de thèse démontrent que l’expression lentivirale varie en fonction de nombreux paramètres, dont (i) le design des vecteurs, (ii) le type cellulaire transduit et son fond génétique, et (iii) le temps écoulé depuis la transduction, reflétant ainsi des interactions différentielles entre le vecteur et son hôte. / An improved knowledge of the viral and cellular determinants implicated in the regulation of the lentiviral gene expression is crucial (i) for a better control of transgene expression in strategies designed for gene transfer and (ii) for uncovering the mechanisms of viral latency observed after infection with the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and accounting for the absence/loss of HIV-1 expression. Cellular factors involved in the mechanism of detecting/repairing DNA lesions are largely activated during the initial steps of viral cycle and, thus, may participate in the control of lentiviral expression. In the first part of this study, we generated a set of lentiviral vectors encoding for the transgene green fluorescent protein (gfp) with various design: the original promoter [long terminal repeat (LTRs)] or of heterologuous origins (e.g., the viral cytomegalovirus, CMV or the human phosphoglycerate kinase, PGK), wild-type or mutated integrase and wild-type or self inactivating (SIN) LTRs. By taking advantage of these constructs, we characterized the impact of the insertion of distinct heterologuous sequences within SIN-LTRs on the expression of gfp over the time in conditions of proficiency or deficiency for the integration. We put in evidence a phenomenon of modulation of the level of the transgene expression due to the insertion (by a factor of 0.3 to 1.8, as compared to vectors without insert) that was dependant from the nature and/or the orientation of the insert. We speculate that a balance between the costs and the benefits associated to insertion at the extremities of lentiviral vectors may dictates the level expression of transgene from this engineered construct.In the second part, we performed a systematic and comparative analysis of the lentiviral expression on human HCT 116 colon carcinoma cells depleted from the complex Ku. This complex, which is essential for the survival in humans and has a described role in DNA repair process, has been previously identified as a potential target against HIV-1. Here, we showed that Ku depletion induced a decrease of the HIV-1 early expression in a fashion that was specific for LTR and independent from Tat. Although Ku action needed HIV-1 integration to host genome, its depletion did not modify the viral integration efficiency but rather acted at transcriptional level. Importantly, the reactivation of transgene expression by administering either the NF-κB (Nuclear Factor κB) activator, tumor necrosis factor α (TNFα) or the histone deacetylase inhibitor named trichostatin A was favored in a condition of Ku depletion. On the contrary, in presence of normal level of Ku, cells expressing HIV-1 displayed a high level of counter-selection over the time. Thus, our observations pleased to favor the hypothesis that Ku depletion promotes the establishment of a state of (reactivable) transcriptional latency associated to a lesser counter-selection of transduced cells. Altogether, the results obtained during this thesis demonstrate that lentiviral expression vary depending on (i) specific vector design, (ii) the transduced cell line and its genetic backbone, and (iii) the time elapse from transduction, as a consequence of modified interactions between the vector and its host.

Les vecteurs lentiviraux sont parmi les plus efficaces et les plus aisés à manipuler en vue du transfert de gènes. Leur application est toutefois fortement compromise par le risque de mutagenèse qui résulte de l'intégration de leur génome dans la chromatine de la cellule cible. Plusieurs stratégies peuvent être envisagées afin de contourner ce risque, l'une d'entre elle est de bloquer l'intégration du génome vecteur et d'utiliser des vecteurs lentiviraux sous forme épisomale.<br />Nous avons introduit une mutation dans la région C-terminale de l'itégrase de vecteurs dérivés du HIV (262RRK->AAH). Nous avons démontré que ces vecteurs permettent l'expression d'un transgène dans différentes lignées cellulaires in vitro ainsi que dans des cultures primaires de cellules en arrêt de division (astrocytes et neurones). L'expression du transgène est perdue par dilution des génomes non intégrés au cours de la division cellulaire. Elle est au contraire stable dans des cellules en arrêt de division. Nous avons également évalué l'activité résiduelle d'intégration des vecteurs mutants exprimant le gène de résistance au G418 (NEO), elle est réduite de 2 à 3 log par rapport au vecteur contrôle. Enfin, nous avons démontré la capacité de ces vecteurs lentiviraux non-intégratifs à diriger l'expression d'un transgène in vivo dans le système nerveux central de rongeur, pendant au moins 10 semaines après injection dans le striatum de souris et pendant au moins 5 mois après injection sous-rétinienne chez le rat.<br />Nous avons ensuite entrepris l'amélioration de l'efficacité d'expression du transgène et la réduction de l'activité résiduelle d'intégration. En premier lieu, dans le but d'augmenter l'activité transcriptionnelle des formes épisomales du génome lentiviral, nous avons incorporé des séquences d'attachement à la matrice nucléaire (séquence MAR de la chaîne légère de l'immunoglobuline de souris et séquence MAR du lysozyme de poulet). Nous avons transduit in vitro différentes lignées cellulaires ainsi que des progéniteurs neuraux humains avec des vecteurs lentiviraux non-intégratifs permettant l'expression de la Luciférase. Nous n'avons pas observé d'amélioration significative du niveau d'expression du transgène en présence des séquences MAR.<br />Parallèlement, nous avons produit des vecteurs portant différentes mutations de l'intégrase (N : 262RRK↑AAH, ou LQ : 186K↑Q, 214Q↑L, 216Q↑L, ou 64D↑V) permettant l'expression de différents transgènes (GFP, LUC, GDNF). Nous avons comparé in vitro l'efficacité de transduction de ces différents vecteurs. Nous avons établi que le vecteur N est moins efficace que les vecteurs D64V et LQ. Nous avons en effet observé un phénomène de saturation de la transduction par le vecteur N. Les vecteurs D64V et LQ permettent une expression comparable du transgène.<br />Nous avons également produit des vecteurs permettant l'expression du gène NEO portant ces différentes mutations d'intégrase, seules ou en combinaison avec la modification des séquences d'attachement des LTR. Nous avons comparé la fréquence d'intégration résiduelle de ces différents vecteurs et observé que le vecteur D64V présente l'intégration la plus élevée parmi les vecteurs mutants. La fréquence d'intégration est réduite de 1 à 2 log par rapport au vecteur contrôle intégratif tandis qu'elle est réduite de 2 à 3 log pour les vecteurs N et LQ. Par ailleurs, nous n'avons pas observé de réduction significative de l'intégration par la modification des LTR, qu'elle que soit l'intégrase mutée considérée.

La thérapie génique est envisagée pour le traitement de nombreuses maladies du <br />système nerveux. Le transfert de gène peut être utilisé pour compenser l'absence ou le <br />dysfonctionnement d'un gène déficient, coder une protéine thérapeutique, ou inhiber un <br />gène par ARN interférence. L'utilisation de vecteurs lentiviraux pour transférer un gène <br />thérapeutique, est une approche prometteuse pour de futures applications thérapeutiques. <br />Cependant, pour une utilisation sécurisée de ces vecteurs, il est nécessaire de contrôler <br />l'expression des gènes thérapeutiques. Ceci permettra d'adapter le traitement aux besoins <br />du patient ou de l'arrêter en cas de complications graves. Dans ce contexte, mon travail a <br />porté sur la mise au point de systèmes de régulation de l'expression de gènes thérapeutiques <br />inductibles par la tétracycline (Tet-on) au sein d'un seul vecteur lentiviral. <br /><br />Dans une première approche, le système Tet-on a été incorporé au sein d'un vecteur <br />lentiviral unique. Des vecteurs codant la luciférase et la tyrosine hydroxylase (TH) ont été <br />produits et caractérisés in vitro et in vivo. Ces vecteurs ont permis d'exprimer de façon <br />régulée les transgènes avec une expression induite d'un facteur 100 en présence de <br />doxycycline. Le vecteur TH inductible a été par la suite validé dans un modèle de rat de la <br />maladie de Parkinson pour démontrer son efficacité et la possibilité de réguler un gène <br />thérapeutique in vivo. <br /><br />Le deuxième volet de mon travail a porté sur le développement d'un système <br />inductible d'expression des shARN utilisant un nouveau transactivateur dépendant de la <br />doxycycline capable d'induire la transcription de shARN à partir d'un promoteur d'ARN <br />polymérase III minimal. Après intégration dans un vecteur lentiviral, ce système a permis <br />de contrôler efficacement et de manière réversible l'expression de la GFP et de la protéine <br />p53 in vitro. En présence de doxycycline, une extinction de 90 % de l'expression des deux <br />gènes cibles a été obtenue. Cette expression a été réinduite après retrait de la doxycycline. <br />L'efficacité de ce système est dépendante de la dose et du temps de traitement avec la <br />doxycycline. <br /><br />L'intégration de systèmes de régulations efficaces au sein d'un vecteur lentiviral <br />unique constitue une étape cruciale pour une utilisation sécurisée de ces vecteurs en <br />thérapeutique humaine.

Le système immunitaire est un réseau d'organes, de cellules et de molécules reliés dynamiquement chargé de surveiller l'intégrité de l'organisme. La meilleure connaissance de son fonctionnement est de nature à amener de nouvelles pistes thérapeutiques pour traiter nombre de maladies telles que le cancer, les maladies auto immunes ou les maladies infectieuses. Nos travaux sur la tolérance immunitaire ont montré sans équivoque dans deux modèles différents qu'une population spécialisée de lymphocytes T exprimant le facteur de transcription foxp3 était sélectionnée par l'expression de l'antigène cognitif dans le thymus. La redécouverte de cette population de lymphocytes a rejoint les avancées majeures de l'immunologie moderne. Nous avons montré chez la souris que l'expression de foxp3, tenu pour responsable de la fonction suppressive dans le système immunitaire, était instable et très sensible à l'action d'inhibiteurs " coupant " la voie de signalisation initié par l'IL-2. Nous rechercherons d'autres voies de signalisation spécifique aux lymphocytes T régulateurs chez la souris dans un modèle "naturel " de sélection thymique. Cette étude systémique permettra de définir de nouvelles cibles pour une inhibition pharmacologique ou génétique de foxp3. L'utilisation d'inhibiteur de foxp3 présente un intérêt évident pour l'immunothérapie anti-tumorale où la fonction régulatrice joue contre l'élimination de la tumeur. Nous avons pour projet de transposer nos résultats obtenus chez la souris à l'homme afin de développer une stratégie d'immunothérapie anti-tumorale. Nous prévoyons de développer un modèle du cancer colo-rectal humain chez la souris NOD.SCID.gc-/- afin de pouvoir valider l'idée que la déplétion pharmacologique de lymphocytes T régulateurs avant transfert de lymphocytes T a un vrai impact sur la réponse contre la tumeur autologue. Nous avons par ailleurs montré que dans ce modèle de souris, le transfert de cellules souches hématopoietiques humaines conduisait à la génération de lymphocytes T CD4+ susceptibles à l'infection par le VIH. Nous prévoyons dans un second projet d'utiliser ce nouveau modèle animal de l'infection pour tout d'abord questionner la vision actuelle de l'immunopathologie de l'infection en déterminant (i) si la réponse des lymphocytes T CD8+ est bien responsable de la résolution du pic de virémie durant la phase primaire de l'infection par le VIH et (ii) si la population de lymphocytes T double négatifs est bien la population responsable de la production de la majorité des virions infectieux. Dans un second temps, nous prévoyons d'utiliser les souris humanisées pour valider une stratégie de thérapie génique de l'infection par le VIH. La spécificité des vecteurs lentiviraux envers les lymphocytes T CD4, gage de sécurité et d'efficacité maximum, a été validé chez la souris et chez l'homme. Aussi, nous avons construit des vecteurs exprimant une combinaison de gènes thérapeutiques inhibant la fusion du virion avec la membrane de la cellule, soit en entrant en compétition avec la gp41 virale, soit en modulant l'expression de CCR5 à la surface. Le suivi des souris traitées puis infectées sera réalisée en mesurant la charge virale et la fréquence des lymphocytes T CD4+ afin de juger de la qualité de la reconstitution immunitaire après thérapie génique. L'ensemble de ces travaux et projets vise à transposer les résultats de nos travaux de recherche les plus fondamentaux au service du patient.

Dans une perspective de médecine régénératrice, les cellules souches nerveuses et progénitrices fœtales humaines constituent indéniablement un des outils les plus adaptés au traitement des lésions du SNC et des maladies neurodégénératives. Jusqu'à présent, leur utilisation en thérapie cellulaire a eu recours à des populations hétérogènes composées à la fois de cellules immatures, de cellules en voie de différenciation et de cellules pleinement différenciées. Or des études récentes ont révélé l'intérêt de disposer de populations enrichies en un type cellulaire donné afin d'améliorer l'efficacité des greffes. Pour homogénéiser les populations et mieux cibler les pathologies, nous avons donc mis en œuvre deux stratégies. La première consiste à surexprimer, dans les cellules en culture, les gènes proneuraux à motif bHLH Ngn1, Ngn2, Ngn3 et Mash1 au travers de vecteurs lentiviraux dits « de différenciation ». Cette surexpression a permis d'orienter la différenciation des cellules majoritairement vers le lignage neuronal et également de spécifier des sous-types neuronaux. La seconde méthode utilise des vecteurs lentiviraux traceurs pour exprimer une protéine rapportrice sous le contrôle de promoteurs spécifiques des différents lignages du SNC en vue de leur sélection par tri cellulaire. Nous avons ainsi utilisé le promoteur Nestine pour les cellules immatures, le promoteur Synapsine pour les cellules neuronales et le promoteur GFAP pour les cellules astrocytaires. Si les promoteurs Synapsine et GFAP ont révélé une spécificité contestable, le promoteur Nestine, quant à lui, a permis de sélectionner une population enrichie à 81% en cellules nestine+. Ce travail s'inscrit dans un projet de plus grande envergure, qui a pour but d'évaluer les bénéfices de greffes de ces populations homogénéisées.

A ce jour, un certain nombre d'adénomes hypophysaires somatotropes échappent encore au contrôle de la maladie. Il reste nécessaire d'étudier plus finement les différentes voies de contrôle de la sécrétion hormonale et de la prolifération tumorale afin d'identifier des traitements alternatifs susceptibles de contrôler ces symptômes tumoraux. De même, un certain nombre de patients porteurs de prolactinomes (environ 10%), à l'origine de dysfonctionnement gonadique et sexuels, échappent au contrôle de l'hypersécrétion de prolactine par les traitements actuels. Pour ces deux types de tumeurs, s'ajoutent des complications neurologiques consécutives à l'accroissement des volumes tumoraux. Dans une perspective de contrôle de l'hypersécrétion tumorale nous nous sommes intéressés à deux stratégies faisant intervenir un transfert de gènes dans les cellules. POU1F1 est un facteur de transcription crucial pour le développement et le maintien des lignages somatotrope, lactotrope et thyréotrope et son expression est retrouvée dans les adénomes hypophysaires. De plus, des mutations de ce gène, notamment le mutant dominant négatif R271W, ont été identifiés chez des patients présentant des déficits hypophysaires combinés en GH, en PRL et en TSH. Une première partie de ma thèse a donc porté sur l'étude du transfert du mutant dominant négatif de POU1F1 par un vecteur lentiviral dans les tumeurs hypophysaires somatotropes et lactotropes afin d'évaluer son impact sur la sécrétion hormonale et sur la viabilité cellulaire. Nous avons montré que l'inactivation de ce facteur de transcription entrainait une diminution de la viabilité cellulaire et de la sécrétion de toutes les tumeurs testées. / To this date, some somatotroph adenomas do not respond to the current treatment of pituitary tumors. It still necessary to study the different ways to control the hormonal secretion and the tumor progression to identify alternate therapy capable to manage these symptoms. Likewise, some patient with prolactinomas (about 10%) responsible of gonad and sexual dysfunction do not respond to the control of prolactin hypersecretion. In addition, some neurological complications are finding due to the neighboring structures compression for both of these tumors. To better control the hormonal secretion we investigate two different strategies involving a gene transfer in the cells. POU1F1 is a major transcription factor involved in the pituitary development and the management of somatotroph, thyreotroph and lactotroph cell lines. Its expression is found in pituitary adenomas belonging of these 3 cell lines. Moreover some mutations like the R271W mutant are identified in patients with combined pituitary hormonal deficiency (CPHD). In the first part of my thesis we transfer this dominant negative mutant via a lentiviral transfer in the somatotroph and lactotroph adenomas to evaluate its impact on hormonal secretion and cell viability. We show an inhibitory effect of the POU1F1 inactivation on the secretion and the cell viability of all our tumors. Somatostatin analogs are the major medical therapy for somatotroph adenomas and control GH secretion in 60% of these patients. Octreotide resistance is highly correlated to a low expression of the sst2 receptor.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie très sévère, progressive et sans traitement vraiment efficace. Elle est caractérisée par l’absence fonctionnelle de la dystrophine, une protéine essentielle au maintien des muscles squelettiques. La thérapie génique est actuellement envisagée comme approche thérapeutique pour livrer la dystrophine dans les muscles. Les vecteurs adénoviraux de troisième génération (Helper-dependent adenoviral vector, HD) sont des véhicules de transfert génique très prometteurs pour traiter la DMD. Puisque les gènes adénoviraux ont été enlevés complètement du HD, ils sont peu toxiques, faiblement immunogéniques et ils possèdent un espace cargo suffisant pour transporter l’ADN codant complet de la dystrophine. Bien que le HD puisse fournir la dystrophine de façon thérapeutique chez des souris dystrophiques (mdx), l’expression du gène thérapeutique est progressivement perdue plusieurs mois suivant l’injection intramusculaire. Deux stratégies innovantes furent explorées dans cette thèse dans le but de stabiliser l’expression de la dystrophine. La première stratégie vise à l’intégration de l’ADN du HD dans les chromosomes cellulaires, ce qui pourrait le protéger contre son élimination progressive des muscles. Une intégrase site-spécifique issue du phage ΦC31 a été utilisée pour catalyser l’intégration d’un HD transportant un marqueur de sélection. Dans les cellules humaines et les myoblastes murins, l’activité de l’intégrase a été évaluée d’après son efficacité d’intégration (après sélection) et sa spécificité (dans les clones résistants). L’efficacité atteint jusqu’à 0,5 % par cellule et jusqu’à 76 % des événements d’intégration ont été réalisés de façon site-spécifique. Bien que des délétions aient été trouvées aux extrémités du vecteur, 70 % des clones analysés montraient une seule copie du vecteur intégré (le nombre attendu). Seulement une petite augmentation du nombre de brisures double-brin a été mesurée dans les myoblastes exprimant l’intégrase. En conclusion, l’intégration du HD est relativement efficace, spécifique et sécuritaire. Cette méthode est très prometteuse, car la dystrophine peut être livrée dans le muscle avec l’aide du HD et l’intégration de l’ADN du HD pourrait stabiliser son expression in vivo. La deuxième stratégie implique l’utilisation d’un nouveau promoteur musculospécifique (ΔUSEx3) pour réduire la toxicité induite liée à une expression trop étendue de la dystrophine. Dans cette étude, nous avons investigué l’effet du contexte viral sur l’activité du promoteur. Un HD et un vecteur lentiviral (LV) ont été construits avec le promoteur ΔUSEx3 pour contrôler l’expression d’un gène rapporteur. Les résultats démontrent que ΔUSEx3 confère une expression puissante, musculospécifique et stable (via le LV) in vitro. L’injection intramusculaire du HD a conduit à une expression puissante du transgène. Ces résultats contrastent avec ceux du LV, car après l’injection de ce dernier, l’expression était faible. La livraison du HD dans le muscle, mais aussi dans plusieurs organes démontre la musculospécificité de ΔUSEx3. Par conséquent, le contexte du vecteur et l’environnement musculaire modulent tous les deux l’activité de ΔUSEx3. Bien que ΔUSEx3 soit musculospécifique, d’autres études sont requises pour déterminer si le promoteur peut stabiliser l’expression de la dystrophine in vivo. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe, progressive and orphan disease that is characterized by the absence of the functional muscle protein dystrophin. Gene therapy is currently investigated as a therapeutic approach to deliver dystrophin into muscles. Helper-dependent adenoviral vectors (HD) are promising gene transfer vehicles for gene therapy of DMD. Because HD are devoid of all adenoviral genes, they are weakly toxic, poorly immunogenic and possess sufficient cargo capacity to carry the full-length dystrophin cDNA. Although HD can provide dystrophin therapeutically in dystrophic mice, gene expression decays months after intramuscular injection. Two strategies that both aimed to stabilize dystrophin expression were explored here. The first strategy involved the integration of HD DNA into cellular chromosomes. Stabilizing HD DNA could prevent its elimination from muscles. A site-specific integrase from phage ΦC31 was used to integrate an HD carrying a selection marker in human cells and murine myoblasts. Efficacy of integration (obtained after selection) reached up to 0.5% per cell, and up to 76% of integration events (in clones) were mediated site-specifically. Although some deletions in HD extremities occurred, 70% of clones analyzed showed one integrated copy of HD (as expected). Only a small increase in the number of double-strand breaks was found in myoblasts expressing the integrase. In conclusion, HD integration was relatively efficient, specific and safe. This method could be used to stabilize dystrophin expression in vivo. The second strategy involved using a muscle-specific promoter (ΔUSEx3) to reduce potential toxicity induced by widespread expression of dystrophin. Because ΔUSEx3 would be delivered by HD, we investigated whether or not the viral context could affect ΔUSEx3 activity. We constructed an HD and a lentiviral vector (LV) carrying a reporter gene under its control. Strong, muscle-specific and stable (with LV) expression was obtained in vitro. Intramuscular injection of HD resulted into a powerful transgene expression contrasting with LV, where expression was relatively weak. Delivery of ΔUSEx3 in multiple tissues by HD demonstrated its muscle-specificity. Therefore, both the viral context and the muscular environments modulate ΔUSEx3 activity. Further studies are required to determine whether or not ΔUSEx3 can stabilize dystrophin expression in vivo.

La glycogénose de type Ia (GSDIa) est une maladie métabolique rare causée par un déficit en glucose-6- phosphatase (G6Pase), menant à l'absence de production endogène de glucose. Cette pathologie est caractérisée par des hypoglycémies sévères, une hépatomégalie et une stéatose hépatique ainsi qu'une néphromégalie. En absence de traitement curatif, la prise en charge de cette maladie repose actuellement sur des mesures diététiques très strictes. Cependant, des complications apparaissent avec l'âge comme le développement de tumeurs hépatiques et la progression de la néphropathie vers l'insuffisance rénale. Afin d'étudier l'évolution de cette pathologie à long terme, nous avons utilisé des modèles murins originaux présentant une invalidation du gène de la sous-unité catalytique de la G6Pase spécifiquement au niveau du foie ou des reins. Dans ce travail, nous avons démontré que la déficience en G6Pase uniquement au niveau des reins est suffisante pour entrainer le développement de la pathologie rénale de la GSDIa. Les souris déficientes en G6Pase hépatique nous ont permis de mettre en évidence les effets délétères d'une consommation modérée de fructose ou de galactose et d'une alimentation riche en lipides, de type « cafétéria », sur la pathologie hépatique de la GSDIa, en particulier sur le développement tumoral. Nous avons également démontré chez ces souris l'efficacité et l'innocuité d'un traitement par thérapie génique ciblant le foie. Le transfert de gène avec un vecteur lentiviral, permettant l'intégration du transgène au génome, semble plus efficace qu'avec un vecteur AAV pour prévenir le développement de la pathologie hépatique de la GSDIa et l'apparition des tumeurs / Glycogen storage disease type Ia (GSDIa) is a rare metabolic disease caused by glucose-6-phosphatase (G6Pase) deficiency, leading to the absence of endogenous glucose production. This pathology is characterized by severe hypoglycemia, hepatomegaly, hepatic steatosis and nephromegaly. In the absence of a curative therapy, the current treatments available consist in strict dietary management. However, various complications occur with aging, such as hepatic tumor development and progressive chronic renal disease leading to renal failure. In order to study the long term pathology development, we used original mouse models, presenting an invalidation of the gene encoding the G6Pase catalytic subunit, specifically in the liver or in the kidneys. In this work, we demonstrated that renal G6Pase deficiency alone is sufficient to induce the development of the GSDIa nephropathy. Mice with liver-specific G6Pase deficiency allowed us to highlight the deleterious effects of high-fat diet, such as « fast-food » diet, as well as moderate consumption of fructose or galactose on the hepatic GSDIa pathology, particularly on tumor development. Furthermore, we demonstrated the efficiency and innocuity of gene therapies targeting the liver in these mice. Gene transfer with a lentiviral vector, allowing transgene integration into the genome, seems to be more efficient than an AAV vector in preventing the development of hepatic GSDIa pathology and tumor formation