Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-06-13T15:18:11Z No. of bitstreams: 1 Lidiane Regia Pereira Braga de Brito.pdf: 2287582 bytes, checksum: 17e61dc27685605b15670b417a165d29 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-13T15:18:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lidiane Regia Pereira Braga de Brito.pdf: 2287582 bytes, checksum: 17e61dc27685605b15670b417a165d29 (MD5) Previous issue date: 2014-06-13 / The chemotherapy used in the treatment of acute leukemias (AL) in pediatric immune system, promoting the morbidity and mortality from infection during the induction phase of treatment, the first 50 days. However, questions remain about why some of these children develop severe and fatal infections. The occurrence of polymorphisms (SNPs) in regions associated with regulation of immune system components may be associated with proteins that indicate the recognition of pathogens, such as the mannose-binding lectin (MBL) and cytokine tumor necrosis factor alpha (TNFα) and interleukin 10 (IL-10). The aim of this study was to evaluate the association between susceptibility to infection of pediatric patients and the following polymorphisms: -550 promoter regions (alleles H / L), -221 (alleles X / Y) and structural exon 1 (alleles A / O) MBL2 gene, the promoter region -1082 (allele G / A), -819/-592 (allele C / T) of the IL-10 gene region and -308 (allele G / A) gene TNFα. The 225 patients were evaluated in the CEONHPE / HUOC-UPE. Of these, 84% (n = 189) were diagnosed with acute lymphoblastic leukemia (ALL). Overall group (AL), there was no association between the three polymorphic regions studied with febrile neutropenia (-550 H/L, p=0.912; -221 X/Y, p=0.471; exon 1 A/O, p=0.138), number of infectious events (-550 H/L, p=0.912; exon 1 A/O, p=0.741) and the risk of relapse (-550 H/L, p=0.588; exon 1 A/O, p=0.882). However, an association was observed between age and genotype AO of exon 1 in patients younger than 10 years in AL (p=0.027) and ALL (p=0.038). In conclusion, we can suggest that the pediatric patients younger than 10 years, carriers of the MBL2 genotype AO, that determine low oligomerization and compromised biological function of the protein may have immune response deficiency. / A quimioterapia utilizada no tratamento de leucemias agudas (LA) pediátricas deprime o sistema imune, favorecendo a morbidade e mortalidade por infecções durante a fase de indução do tratamento, ou seja, os primeiros 50 dias. Entretanto, permanecem duvidas sobre o porquê de algumas dessas crianças desenvolverem infecções severas e fatais. A ocorrência de polimorfismos (SNPs) em regiões promotoras e estruturais de genes de componentes do sistema imune pode estar associada ao padrão de reconhecimento de patógenos, a exemplo da Lectina Ligadora de Manose (MBL) e das citocinas Fator de Necrose Tumoral alfa (TNFα) e interleucina 10 (IL-10). O objetivo deste trabalho foi verificar uma possível associação entre a susceptibilidade à infecção nos pacientes pediátricos com os polimorfismos nas regiões promotoras -550 (alelos H/L), -221 (alelos X/Y) e estrutural éxon 1 (alelos A/O) do gene MBL2, das regiões promotoras -1082 (alelos G/A), -819/-592 (alelos C/T) do gene IL-10 e região -308 (alelos G/A) do gene TNFα. Foram avaliados 225 pacientes com LA em tratamento no CEONHPE/HUOC-UPE. Destes, 84%(n=189) tiveram o diagnóstico de Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA). No grupo geral (LA), houve ausência de associação entre as três regiões polimórficas estudadas do gene MBL2 com a neutropenia febril (-550 H/L, p=0,912; -221 X/Y, p=0,471; éxon 1 A/O, p=0,138), número de eventos infecciosos (-550 H/L, p=0,912; éxon 1 A/O, p=0.741) e o risco de recaída (-550 H/L, p=0,588; éxon 1 A/O, p=0,882). Entretanto, observou-se que o genótipo AO do gene MBL2 foi associado aos pacientes pediátricos com LA (p=0,027) e LLA (p=0,038) que apresentavam idade abaixo de 10 anos. Com relação aos polimorfismos dos genes IL-10 e TNFα não foi observada associação com as mesmas situações clínicas anteriormente referidas e nem com a idade dos pacientes. Em conclusão, podemos sugerir que os pacientes pediátricos com idade abaixo de 10 anos e portadores do genótipo AO do gene MBL, que determina baixa oligomerização e função biológica comprometida da proteína podem apresentar deficiência na resposta imune.

Orientador: Carmen Veríssima Ferreira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T13:47:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_PaulaAnastacia_D.pdf: 2451128 bytes, checksum: a13caa2510a3ac1dca624878d50fafab (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A eficiência do tratamento da leucemia sob vários aspectos, mesmo com os avanços farmacotecnológicos, ainda permanece como desafio para a medicina. Diante desse fator, maiores informações sobre a base molecular da leucemia e o desenvolvimento de agentes que atuem de forma alvo-específico, apresentem poucos efeitos colaterais e possam impedir o escape das células tumorais à indução de morte são extremamente desejáveis. No presente trabalho, foram abordados 2 aspectos: indução de morte das células leucêmicas por calix[6]areno, flavonóides e diterpeno lactona e contribuição da proteína tirosina fosfatase de baixo massa molecular (LMWPTP) para a resistência de células leucêmicas. As linhagens K562, Lucena-1 (resistente) e HL60 foram utilizadas como modelos no estudo. Calix[6]areno apresentou o mesmo nível de toxicidade para as duas linhagens celulares, mostrando valores de IC50 na faixa de 1-5 µM para K562 e 5-10 µM para Lucena-1. Calix[6]areno induziu vias apoptóticas como demonstrado pelo aumento da razão Bax/Bcl-2 e clivagem de PARP. A proteína tirosina fosfatase PTEN foi ativada pelo Calix[6]areno, fato relacionado com a diminuição da sobrevivência e proliferação. O Calix[6]areno aumentou a expressão de algumas enzimas antioxidantes e não afetou a atividade da proteína associada com o fenótipo de resistência, P-Glicoproteína. As células Lucena-1, que apresentam alta expressão da P-Glicoproteína, também apresentam altos níveis da LMWPTP. Observamos que quando esta enzima foi silenciada, a resposta frente a quimioterápicos das células leucêmicas se tornou mais eficiente. Por outro lado, o aumento da expressão da LMWPTP em células não resistentes provocou insensibilidade das mesmas à vincristina. Nossos dados sugerem que a LMWPTP contribui com o fenótipo resistente através da ativação das quinases Src e BCR-ABL. Outro aspecto investigado neste trabalho foi a indução da diferenciação e apoptose por compostos naturais. Quercetina e a apigenina apresentaram os dois efeitos desejados a um agente quimioterápico, ou seja, expressiva indução da diferenciação das células e também apoptose. Estes efeitos foram dependentes do tempo e modulação do estado redox celular. / Abstract: Leukemia therapy efficiency, under several aspects, even with the progress of pharmacotechnology, remains as a challenge in medicine. According to this, new information about the molecular basis of leukemia and development of agents that act on specific target, present low side-effects and prevent cancer cells escaping from death induction, are extremely desirable. In this work 2 aspects were evaluated: death induction of leukemia cells by calix[6]arene, flavonoids and diterpene lactone and the contribution of the low molecular weight protein tyrosine phosphatase (LMWPTP) for leukemia cells resistance. K562, Lucena-1 and HL60 cells were used as models in this study. Calix[6]arene presented the same level of toxicity on K562 and Lucena-1 cells, displaying an IC50 value ranging 1-5 µM to K562 cells and 5-10 µM to Lucena-1 cells. Calix[6]arene induce apoptosis signaling on both K562 and Lucena cells as molecularly demonstrated by the increased Bax/Bcl-2 ratio and PARP cleavage. Protein tyrosine phosphatase PTEN from leukemia cells became more active in the presence of calix[6]arene, which is related to a decrease of survival and proliferation. Calix[6]arene enhanced the expression of antioxidant enzymes and did not affect P-Glycoprotein activity. Lucena cells, which present high expression of P-Glycoprotein also contain high level of LMWPTP. Interestingly, when this phosphatase was silenced the leukemia cells response appeared to be more efficient towards chemotherapics. On the other hand, overexpression of this enzyme in K562 (non resistant cells) provoked insensitivity to vincristine. Our findings suggest that LMWPTP contributes with the resistance phenotype by supporting the activation status of Src and BCR-ABL kinases. Another aspect examined in this study was the induction of differentiation and apoptosis by natural compounds. Quercetin and apigenin displayed both desired effects of chemotherapics: induction of differentiation and apoptosis. These effects were time- and cellular redox status dependent. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Carmino Antonio de Souza, Katia Borgia Barbosa Pagnano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T20:51:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mascarenhas_CintiadoCouto_M.pdf: 7297123 bytes, checksum: a5c6ff86609313924a25638b32816a31 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O desenvolvimento da Leucemia Mielóide Crônica (LMC) tem como característica a formação do cromossomo Philadelphia que envolve a quebra do gene BCR gerando um rearranjo molecular denominado BCR-ABL, cujo produto final é uma proteína de fusão citoplasmática que determina a patogenia da doença. Esta proteína é uma tirosina quinase (TK) que possui capacidade de auto-ativação e para a inativação desta proteína, foram desenvolvidos os inibidores da tirosina quinase (ITK), que tem a capacidade de se ligar no mesmo sítio de ligação da molécula de ATP. Esta ligação impede a transferência dos grupos fosfatos aos substratos subseqüentes, bloqueando a cascata de transdução de sinais e prevenindo a ativação das vias mitogênica dependente da quinase Bcr-Abl e anti-apoptóticas levando à morte do fenótipo BCR-ABL.Um dos principais mecanismos de resistência ao tratamento com ITK são as mutações pontuais, sendo a T315I foco de estudos mais detalhados por tornar a proteína mutante altamente insensível a todas as drogas inibidoras da proteína TK disponíveis atualmente Foi utilizado neste trabalho a técnica de D-HPLC para fazer screening de mutações nos pacientes com LMC com resposta sub ótima ou falha de tratamento de acordo com os critérios da Leukemia Net. Para o screening do éxon 6 foram selecionados 93 pacientes com LMC: 5 eram intolerantes, 67 resistentes e 21 com resposta subótima. Como controle negativo foi usado o sangue periférico doadores de sangue do Hemocentro da UNICAMP. Para o screening de mutações de todo o gene BCR-ABL foram estudados 37 pacientes com LMC e como controle negativo, usamos a linhagem celular HL60 que não possui a translocação BCR-ABL. No screening do éxon 6, 23 amostras (25%) mostraram um perfil de eluição no D-HPLC anormal em relação ao controle, o que sugeriu a presença de mutação. A sobrevida global (OS) para todo grupo foi de 80% em uma mediana de tempo de observação de 30 meses. OS para pacientes sem mutações foi de 87% e para os pacientes com mutações foi de 56% em uma mediana de tempo de observação 37 e 10 meses, respectivamente (p <0,0001, RR = 68). No screening de todo o gene BCR-ABL 17 (46%) tiveram perfil cromatográfico diferente do controle Como estávamos estabelecendo a padronização do método, procedemos com o seqüenciamento de todas as amostras e os resultados obtidos foram comparados com a seqüência depositada no banco de dados GenBank (U07563). Das 17 amostras com alteração do perfil cromatográfico, observamos a presença de mutação em 13 amostras. Acreditamos que isso se deva a sensibilidade do método de D-HPLC que é capaz de identificar tanto polimorfismos quanto mutações com maior eficiência que o seqüenciamento. Em resumo, o D-HPLC demonstrou ser um método sensível e prático para o acompanhamento do aparecimento de mutações no domínio da quinase na rotina clínica. Mutações nessa região estudada são clinicamente relevantes e podem conferir um pior prognóstico. A detecção precoce pode ser uma ferramenta importante para otimizar a terapêutica na LMC. / Abstract: The development of chronic myeloid leukemia (CML) is the formation of the characteristic Philadelphia chromosome involving breach of the BCR gene generating a molecular rearrangement called BCR-ABL, whose final product is a cytoplasmic fusion protein that determines the pathogenesis of the disease. This is a protein tyrosine kinase (TK) that has self-ativaçãoe to inactivate this protein have developed the inhibitors of tyrosine kinase (ITK), which has ability to connect on the same site of binding of molecule of ATP. This connection prevents the transfer of phosphate groups to substrates subsequent, blocking the cascade of signal transduction and preventing the activation of mitogenic pathways dependent kinase BCR-ABL and anti leading to apoptotic death phenotype of BCR-ABL.One major mechanisms of resistance to treatment with ITK are mutations off, and the T315I focus of more detailed studies by making mutant protein highly insensitive to all drugs Inhibit TK protein currently available was used in this work to D-HPLC technique to screening for mutations in patients with CML with sub-optimal response or failure of treatment according to the criteria Leukemia Net For the screening of exon 6 were selected 93 CML patients: 5 were intolerant, 67 resistant and 21 with answer sub-optimal. The negative control we used the peripheral blood donors Blood from the blood of UNICAMP. For the screening of mutations throughout the BCR-ABL gene were studied 37 patients with CML and control negative, we used the HL60 cell line that does not have the translocation BCR-ABL. In the screening of exon 6, 23 samples (25%) showed a profile of the D-HPLC elution abnormal in the control, which suggested the presence of mutation. The overall survival (OS) for whole group was 80% in a median time of observation of 30 months. OS for patients with mutations was 87% and for patients with mutations was 56% in the median observation time of 37 and 10 months respectively (p <0.0001, RR = 68). In screening the entire gene BCR-ABL 17 (46%) had chromatographic profile different from the control we were setting the standardization of methods, procedures with the sequencing of all samples and the results were compared with the sequence deposited in the GenBank database (U07563). Of the 17 samples with change the chromatographic profile, we observed the presence of mutation in 13 samples. We believe that this is due to sensitivity of the method of D-HPLC is able to identify the mutations both polymorphisms with greater efficiency to the sequencing. In summary, the D-HPLC has proved a sensitive and practical method for monitoring the appearance of mutations in the kinase domain in the clinical routine. Mutations studied in this region are clinically relevant and may confer worse prognosis. Early detection can be a tool important to optimize therapy in CML. / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Orientador: Jose Andres Yunes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T09:06:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vasconcellos_JairaFerreirade_D.pdf: 12382146 bytes, checksum: 9d05fdf79968e31e12ded32312675286 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A leucemia linfóide aguda (LLA) é a neoplasia mais freqüente na infância. As interações dos blastos da LLA com as células do estroma da medula óssea (MO) têm um impacto positivo na sobrevivência das células e resistência a quimioterapia. A LLA estimula as células do estroma da MO que reciprocamente promovem a sobrevivência da leucemia. Para identificar moléculas envolvidas na interação leucemia-microambiente foi realizada análise do perfil de expressão gênica de células mesenquimais (MSC) da MO estimuladas com células primárias da LLA. O estímulo da LLA nas MSC ativou várias quimiocinas próinflamatórias, incluindo CCL2 e IL-8. Os níveis plasmáticos de CCL2 e IL-8 em crianças com LLA ao diagnóstico foram significativamente maiores do que em controles normais. A maioria das amostras de LLA primária expressou transcritos dos receptores de CCL2 e IL-8. Ensaios funcionais in vitro demonstraram que a LLA não é afetada pela adição de CCL2, IL- 8 ou anticorpos neutralizantes. Porém ambas as quimiocinas demonstraram estimular a sobrevivência das MSC em meio sem soro e aumentar sua proliferação em meio com quantidades limitadas de soro. Para explorar o efeito da IL-8 no microambiente da MO leucêmica foi sintetizado um antagonista do receptor CXCR2 da IL-8, denominado SB225002 (N-(2-hydroxy-4-nitrophenyl)-N'-(2-bromophenyl)urea). O SB225002 demonstrou efeito deletério contra as linhagens da LLA (Nalm6, REH, Jurkat, CEM e Molt4). Mas nem todas as linhagens da LLA sensíveis ao SB225002 expressaram o receptor CXCR2, sugerindo que seu mecanismo de ação ocorreria através de receptor alternativo. Recentemente foi descrito que o SB225002 também se liga a outros receptores acoplados a proteína G, dentre eles os receptores da histamina e dos canabinóides. Ambos foram testados in vitro e o receptor CNR2 dos canabinóides demonstra desempenhar função no mecanismo de ação do SB225002. Além disso, para identificar moléculas envolvidas na resposta celular ao SB225002 foi realizada a análise do perfil de expressão gênica de células Jurkat tratadas com SB225002. Eventos celulares de resposta inicial ao SB225002 incluíram (i) ativação de phospho-p44/42 ERK e (ii) ativação de GLIPR1 que demonstrou mediar a indução de morte do SB225002. Em conclusão, este trabalho indica a importância das quimiocinas CCL2 e IL-8 no microambiente da LLA, e demonstra o potencial do SB225002 como agente antileucêmico. / Abstract: The interactions of Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) blasts with bone marrow (BM) stromal cells have a positive impact on leukemia cell survival and resistance to chemotherapy. ALL stimulates BM stromal cells, which reciprocally promote leukemia cell survival. To identify molecules critically involved in leukemia-microenvironment crosstalk, we performed gene expression profiling analyses of primary BM mesenchymal stem cells (BMMSC) following stimulation by primary ALL cells. Leukemia stimulation of BMMSC up regulated the expression of several inflammatory chemokines, including CCL2 and IL-8. Secretion of these molecules was confirmed by ELISA assays of in vitro co-culture experiments and in BM plasma samples from pediatric ALL patients. Most primary ALL samples were found to express mRNA for CCL2 and IL-8 receptors. In vitro functional studies revealed that primary ALL cells co-cultured with BMMSC were not affected by addition of CCL2, IL-8 or neutralizing antibodies to these chemokines. On the other hand, both chemokines were found to enhance BMMSC survival in serum-free medium and to increase their proliferation in serum-starved conditions. To further explore the effect of IL-8 in the ALL-BM microenvironment the CXCR2 -IL-8 receptor-antagonist SB225002 ( N - ( 2 - hydroxyl - 4 - nitrophenyl ) - N' - ( 2 - bromophenyl ) urea) was synthesized. SB225002 had a deleterious effect against ALL cell lines (Nalm6, REH, Jurkat, CEM, and Molt4). Suprisingly, not all the ALL cells lines that were sensitive to SB225002 expressed CXCR2 receptor. This find suggested that the SB225002's mechanism of action occurred through a different receptor. SB225002 was recently described to also bind histamine and cannabinoid receptors that were investigated in ALL and the CNR2 cannabinoid receptor demonstrated to play a role in SB225002 mechanism of action. To identify molecules involved in the cellular effects promoted by SB225002, gene expression profiling analyses was performed of Jurkat cells treated with SB225002. Early cellular effects enhanced by SB225002 included (i) activation of phospho-p44/42 ERK and (ii) up regulation of GLIPR1 that shown to mediate SB225002-induced apoptosis. In conclusion, this work support a significant role for the chemokines CCL2 and IL-8 in the ALL-BM microenvironment, and demonstrate SB225002's therapeutic potential. / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O esqueleto quinona foi identificado como um importante grupo farmacofÃrico para atividade citotÃxica de vÃrios compostos utilizados na clÃnica, constituindo ainda uma das maiores classes de agentes anticÃncer. A &#946;-lapachona à uma das quinonas mais estudadas nos Ãltimos anos. Suas aplicaÃÃes mais importantes estÃo relacionadas Ãs aÃÃes contra vÃrias cÃlulas tumorais. Seu derivado, nor-&#946;-lapachona (composto 1), tem atividade anticÃncer similar. Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar o mecanismo de aÃÃo envolvido na citotoxicidade do composto 1 e de seu derivado nitrofenilamino (composto 2) em cÃlulas leucÃmicas HL-60. Inicialmente foi investigado o efeito desses compostos na viabilidade de cÃlulas HL-60 apÃs 24 horas de incubaÃÃo, mostrando CI50 de 2,92 e 0,48 &#956;M para os compostos 1 e 2, respectivamente. Acerca da seletividade celular, o composto 1 mostrou forte seletividade para cÃlulas tumorais, enquanto que o seu derivado foi apenas parcialmente seletivo. Estudos feitos em cÃlulas HL-60 indicaram que o composto 2 induz morte celular por apoptose como mostrado pelas mudanÃas morfolÃgicas, fragmentaÃÃo do DNA, despolarizaÃÃo da membrana mitocondrial e externalizaÃÃo da fosfatidilserina. Ambos compostos aumentaram a geraÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio (EROs). Nossos resultados sugerem que a introduÃÃo do radical nitrofenilamino na posiÃÃo 3 do anel furano aumenta a citotoxicidade da nor-&#61538;-lapachona em cÃlulas HL-60. Esses achados apontam para o potencial dessas quinonas sintÃticas como modelo para a produÃÃo de novos compostos com propriedades anticÃncer. / The quinone moiety has been identified as an important pharmacophoric group for cytotoxic activity of several compounds clinically used, constituting just one of the major classes of anticancer agents. &#946;-lapachone is one of the most studied quinones in the last years. Its most important applications are related to its action against several cancer cells. Its derivative, nor-&#946;-lapachone (compound 1), has similar anticancer activity. Thus, the aim of this work was to evaluate the mechanism of action involved in nor-&#61538;-lapachone and its nitrophenylamino derivative (compound 2) cytotoxicity in a leukemia cells model of HL-60 cell line. Initially it was investigated the effect of both the compounds on HL-60 cells viability after 24 hours of incubation, showing IC50 values of 2.92 and 0.48 &#956;M to compounds 1 and 2, respectively. Considering the selectivity, compound 1 showed strong selectivity to cancer cells, while its derivative was only partially selective. Studies performed in HL-60 cells, after 24 hours, indicated that compound 2 induces cell death by apoptosis as showed by morphological changes, DNA fragmentation, mitochondrial membrane depolarization and phosphatidylserine externalization. Both tested compounds increased generation of reactive oxygen species (ROS). Our results suggest that a nitrophenylamino radical introduction at position 3 of the furane ring enhances the cytotoxicity of nor-&#61538;-lapachone in HL-60 cell line. These findings highlight the potential of these synthetic quinones as prototypes molecules to produce new compounds with anticancer properties.

O gene humano lysine methyltransferase 2E (KMT2E) pertence ao grupo Trithorax (TrxG) e age como proteína modificadora de histonas envolvida no controle transcricional de genes relacionados a hematopoiese. Foi previamente identificado como supressor tumoral, atuando sobre a diferenciação, proliferação e ciclo celular. DAMM et al. (2011) e LUCENA-ARAÚJO et al. (2014) descreveram a associação entre baixos níveis de expressão do gene KMT2E e desfechos desfavoráveis do tratamento de pacientes com leucemia mielóide aguda (LMA) e leucemia promielocítica aguda (LPA), respectivamente. O objetivo desse trabalho foi estudar os efeitos do aumento da expressão do gene KMT2E na leucemia mielóide aguda (LMA). Foi utilizada a linhagem celular U937, reconhecida como modelo de LMA, e o aumento da expressão do gene de interesse foi obtido por meio da transfecção das células com um vetor lentiviral contendo o cDNA codificante para a isoforma longa do gene (pCDH-MSCV-MCS-EF1-GFP+Puro, aqui chamado pMEG). As partículas lentivirais foram geradas por co-transfecção em células da linhagem HEK 293T, e posteriormente, titulados com a linhagem celular HT 1080. A expressão do gene e a presença da proteína foram confirmadas por qPCR e western blotting, respectivamente. Foram realizados ensaios funcionais de ciclo celular, proliferação, viabilidade, apoptose espontânea e induzida por trióxido de arsênico e luz ultravioleta e diferenciação celular induzida por 12-miristato 13-acetato de forbol (TPA), com as amostras U937 wild type (WT), U937 pMEG (U937 transduzidas com o vetor vazio) e U937 pMEG-KMT2E. Também foram realizadas mensurações da massa tumoral das células inoculadas em camundongos NSG. A expressão relativa do gene KMT2E na célula U937 pMEG-KMT2E foi 1000 vezes mais alta que na célula U937 sem a modificação genética. Os ensaios de diferenciação celular demonstraram que as células U937 pMEG-KMT2E apresentaram maior diferenciação em monócitos/macrófagos que as células controles, quando levada em consideração a marcação para o antígeno CD11c. A expressão induzida de KMT2E em células U937 não alterou a proliferação, viabilidade, ciclo celular, apoptose, ix espontânea ou induzida e o aspecto clonogênico in vitro, porém, foi associado a um maior crescimento tumoral em modelo animal. Nossa hipótese para justificar as diferenças entre os achados in vitro e in vivo é que o aumento da expressão de KMT2E, talvez por meio do aumento de CD11c, facilitou a interação entre as células e o microambiente, estimulando assim o crescimento tumoral in vivo. / The human lysine methyltransferase 2E (KMT2E) gene belongs to the Trithorax (TrxG) group and acts as a histone modifying protein participating in the transcriptional regulation of hematopoiesis-related genes. KMT2E has been previously described as a tumor suppressor, involved in cellular differentiation, proliferation and cell cycle progression. DAMM et al. (2011) and LUCENA-ARAÚJO et al. (2014) described the association between low levels of KMT2E gene expression and poor treatment outcomes in patients with acute myeloid leukemia (AML) and acute promyelocytic leukemia (APL), respectively. The aim of this project was to study the effects of high levels of KMT2E expression in acute myeloid leukemia (AML). For this purpose, the U937 AML cell line was used and an high expression of the gene was obtained by transfecting the cells with a lentiviral vector containing the cDNA encoding the long isoform of the gene (pCDH-MSCV-MCS-EF1- GFP + Pure, here called pMEG). The lentiviral particles were transfected into HEK 293T cells and the viral concentration was determined by titration using HT 1080 cells. The gene expression and the protein presence were confirmed by qPCR and western blotting, respectively. All experiments to determine the biological function of overexpressed KMT2E were conducted with U937 wild type, U937 pMEG (U937 transduced with the empty vector) and U937 pMEG-KMT2E cells. In-vitro the impact of overexpressed KMT2E was studied on cell cycle progression, proliferation and cell viability, spontaneous and induced apoptosis by arsenic trioxide and ultraviolet light and cell differentiation induced by 12-myristate 13-phorbol acetate (TPA). In vivo, the effect of overexpressed KMT2E was detected by comparing the tumor mass growth in NSG mice when inoculating U937 pMEG and pMEG-KMT2E cells in each flank of the same mouse. The relative expression level of the KMT2E gene in pMEG-KMT2E U937 cells was 1000 higher than in the wild type U937 strain. The cell differentiation assay revealed that U937 pMEG-KMT2E cells presented an increased monocyte/macrophage differentiation, when analyzing the CD11c antigen. Induced xi overexpression of KMT2E in U937 cells did not alter cell proliferation, cell viability, cell cycle progression, spontaneous or induced apoptosis or clonogenic appearance in vitro. However, the overexpression of KMT2E resulted in an increased tumor mass formation in vivo. Taking our discrepant in vitro and in vivo results into account, we could hypothesize that the increased expression of KMT2E, possibly caused by the enhanced expression of CD11c, favored the interaction between U937 pMEGKMT2E cells and their microenvironment, thereby stimulating tumor growth in vivo.

Orientadores: Carmino Antonio de Souza, Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T11:16:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mascarenhas_CintiadoCouto_D.pdf: 4558328 bytes, checksum: f219d85bc4e15d72a39a7d3242be9ffb (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A elucidação dos mecanismos moleculares envolvidos na fisiopatologia e tratamento das doenças hematológicas, bem como no entendimento do perfil de expressão gênica das linhagens celulares leucêmicas, tem sido objeto de numerosas investigações. Com o uso da técnica SSH (Subtractive Supression Hybridization ou Biblioteca Subtrativa Supressiva) foi possível identificar importantes genes que se encontram diferencialmente expressos em granulócitos de pacientes com Leucemia Mielóide Crônica e indivíduos controle. Foram encontrados 39 genes superexpressos e 173 com expressão diminuída em células de LMC. Ao relacionar esses genes com vias metabólicas que estão reguladas positiva (expressão aumentada) ou negativamente (expressão diminuída) nessa doença, verificou-se que a maioria dos genes estavam relacionados com a regulação de NF-kB, AKT, o Interferon e a IL-4 em células de controle. Entre os genes superexpressos encontrados na LMC, foi observado o SEPT5, RUNX1, MIER1, KPNA6 e FLT3, enquanto PAN3, TOB1 e ITCH estavam com expressão diminuída nessa doença em comparação com indivíduos controle. O TOB1 se mostrou promissor, uma vez que é um gene supressor tumoral, pode estar envolvido na proliferação de células leucêmicas e interage com vários outros genes encontrados neste estudo. Assim, devido à grande heterogeneidade de funções relacionadas com a expressão desse gene, foi investigada a relação entre a expressão de mRNA e as respostas aos ITK's na LMC. A avaliação foi realizada por PCR em tempo real em doentes com CCgR, PCgR, MINCgR e NOCgR após tratamento com TKI's e os resultados foram comparados com a expressão em granulócitos de indivíduos controle, observando que os pacientes NOCgR têm uma expressão de TOB1 significativamente inferior em comparação com doadores saudáveis e pacientes que alcançaram RCgC. Ao comparar pacientes não resistentes e resistentes a diferença foi significativa. Esses resultados sugerem que a expressão diminuída de TOB1 em pacientes NOCgR pode ser indicativo de desregulação da apoptose e de vias de sinalização importantes nessa doença incluindo a via da AKT, conduzindo assim a resistência a ITK's nesses pacientes. Outro objetivo deste trabalho foi caracterizar a função dos genes TOB1 e SEPT5 nos processos celulares e vias de sinalização de apoptose, proliferação, migração e ciclo celular em linhagens celulares leucêmicas. Ao realizar o silenciamento desses genes (utilizando partículas lentivirais) notou-se que o silenciamento de TOB1, como já descrito na literatura em outras doenças, interfere na proliferação celular, clonogenicidade, apoptose, ciclo celular e expressão de proteínas importantes da cascata de sinalização, o que salienta sua importância em células BCR-ABL positivas. Já o gene SEPT5 ao ser silenciado leva a algumas alterações como a apoptose e ciclo celular. Nesse contexto, o silenciamento destes genes chama atenção para as possibilidades de controle da proliferação celular, apoptose, ciclo celular e clonogenicidade em células BCR-ABL positivas. Foi realizada a avaliação da expressão desses genes em células de sangue periférico e medula óssea de pacientes com LMC e indivíduos controles, linhagens celulares de câncer humano e linhagens de murino. Os resultados mostraram um aumento significativo na expressão do gene SEPT5 em todos os tipos celulares analisados em pacientes com LMC. O mesmo padrão foi observado em células de murino que possuem a mutação T315I e em células humanas que possuem a translocação t(9;22) e estão relacionadas com a fase blástica da doença [K562, KU812, NALM]. Quando avaliada a expressão do gene TOB1 nota-se diminuição em todos os tipos celulares analisados em pacientes com LMC e em células BaF3T315I. Também foi observada uma baixa expressão em células com a t(9;22) e estão relacionadas com a fase blástica da doença[K562, KU812, NALM] quando comparadas a expressão em medula óssea controle. Outro resultado interessante foi obtido a partir da análise de adesão celular em granulócitos de pacientes com LMC e controles, evidenciando a diminuição da adesão em granulócitos de pacientes com LMC em relação aos de controles, levando a hipótese de que essa alteração nas propriedades adesivas dos granulócitos em pacientes com LMC pode estar diretamente ligada à liberação de células jovens pela matriz da medula óssea. A criação de estratégias que levam ao melhor entendimento da fisiopatologia da doença e avanço no tratamento da LMC deve ser focada em vários genes alvos e não apenas no BCR-ABL, pois no desenvolvimento da LMC há a ativação e desativação de várias vias de sinalização celular. Os resultados deste estudo podem ajudar na melhor compreensão dessas vias e também para identificar outros genes e vias úteis para a melhora no manejo terapêutico e criação de novas drogas para o tratamento dessa doença / Abstract: The elucidation of the molecular mechanisms involved in the pathophysiology and treatment of blood disorders, as well as the understanding of genes expression profiling of leukemia cell lines has been the focus of numerous investigations. The use of the SSH (Suppression Subtractive Hybridization Library or Suppression Subtractive) technique made available the identification of important genes which are differentially expressed in granulocytes from patients with chronic myeloid leukemia (CML) and healthy controls. 39 genes overexpressed were found, and 173 with decreased expression in CML cells. When correlating these genes with metabolic pathways that are regulated positively (increased expression) or negatively (decreased expression) in this disease, it was found that most of the genes were related to the regulation of NF-kB, AKT, Interferon and IL-4 in control cells. The following genes were found overexpressed in CML: SEPT5, RUNX1, MIER1, KPNA6 and FLT3, while PAN3, TOB1 and ITCH were found with decreased expression in this disease compared with controls. The TOB1 gene showed promising since it is a tumor suppressor, may be involved in the proliferation of leukaemic cells and interacts with several others genes found in this study. Thus, due to the great heterogeneity of functions related to this gene, was investigated the relationship between mRNA expression and TKI's responses. The evaluation was performed by real time PCR in patients with CCgR, PCgR, MINCgR and NOCgR after treatment with TKI and healthy controls. Was observed that patients that have NOCgR, the TOB1 expression is significantly lower compared with healthy donors and patients who achieved CCgR. When comparing non-resistant and resistant patients the difference also was significant. These results suggest that reduced expression of TOB1 in NOCgR patients may indicate apoptosis deregulation and changes in important signaling pathways of CML including the Akt pathway, thereby leading to TKI's resistance of these patients. Another aim of this work was to characterize the function of TOB1 and SEPT5 in cellular processes and signaling pathways of apoptosis, proliferation, migration and cell cycle in leukemic cell lines. After the silencing of these genes (using lentiviral particles), was noted that the silencing TOB1 - as described in the literature for other diseases - interferes in cell proliferation, clonogenicity, apoptosis, cell cycle and in expression of important proteins at signaling cascade, which emphasizes its importance in BCR-ABL positive cells. The SEPT5 silencing leads to some changes such as apoptosis and cell cycle. In this context, the silencing of these genes leads to attention of possibilities of control of cell proliferation, apoptosis, cell cycle and cell clonogenicity in BCR-ABL positive cells. Was assessed the expression of these genes in cells from peripheral blood and bone marrow of CML patients and controls, as well in human and murine cell lines. Results showed a significant increase in SEPT5 gene expression in patients with CML in all cell types evaluated. The same profile was observed in murine cells BAF3T315I and in human cells having the translocation t (9; 22) been related to blast crisis [K562, KU812, NALM]. When measuring expression of TOB1, was noted decrease in all cell types studied in CML patients and cells BaF3T315I. Another interesting result was obtained from the analysis of cell adhesion at granulocytes in CML patients and controls which showed decreased adhesion of granulocytes in CML patients compared to controls, leading to the hypothesis that the change in adhesive properties at CML can be directly linked to the release of young cells by bone marrow. The creation of strategies that lead to better understanding of the pathophysiology of the disease and advance in the treatment of CML should be focused on several target genes and not only in BCR-ABL, since in the development of CML there is an activation and deactivation of multiple signaling pathways . The results of this study may help to better understand these pathways and also to identify other genes and pathways useful for improving the management and development of new therapeutic drugs to treat this disease / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica

Current treatment methods for Acute Leukemia (AL) only provide temporary therapeutic efficacy as most patients will experience relapse within 2 years following first remission. Our lab has determined that vaccination with autologous cells infected with oncolytic virus MG1 can provide durable cures in a pre-clinical mouse model of AL. However, the mechanism(s) by which the infected cell vaccine (ICV) stimulates T cell dependent anti-tumour immunity and provides protection against tumour growth is unknown. This thesis was aimed to determine 1) what antigen presenting cell populations are activated post ICV immunization and 2) what T cell subsets are important in developing anti-tumour immunity during ICV immunization. My thesis has demonstrated that ICV immunization is more effective at inducing in vivo dendritic cell activation compared to irradiated L1210 cells alone and this activation may be a reason as to why we see improved anti-tumour efficacy in our ICV model. In addition, we have determined that CD4 T cells play an essential anti-leukemic role during ICV immunization and that neutralizing antibody production is a CD4 T cell dependent mechanism. Our data also demonstrates that both CD4 and CD8 T cell populations from ICV immunized mice provide a leukemia-specific anti-tumour immune response. Taken together, this data suggests that CD4 T cells may be acting as helper T cells to aid in the robust activation of leukemia-specific anti-tumour CD8 T cells. Our pre-clinical data characterizing the immune response has improved our understanding of the mechanism(s) which contribute to the efficacy of the ICV and will help provide a rationale framework with which to begin translating this treatment to clinical trials.

La formation et le développement d’une tumeur sont provoqués par une série de défauts qui se produisent à l'intérieur de la cellule cancéreuse et dans son microenvironnement. Ces anomalies permettent à la cellule de développer ses propres stratégies de croissance, de prolifération, de différenciation et de métabolisme.La modification du métabolisme respiratoire, est l'une des stratégies utilisée par les cellules cancéreuses favorisant la fermentation lactique au lieu de la phosphorylation oxydative OXPHOS (respiration). Cette adaptation métabolique porte le nom d’effet Warburg.Nous avons proposé un concept thérapeutique novateur basé sur l'induction de changements métaboliques par l'utilisation de dichloroacétate (DCA) associée avec l'immunothérapie en utilisant les cellules NK activées. Le DCA, molécule inhibitrice de la PDK, induit l'activation de la PDH, responsable de la catalyse de pyruvate en Acétylcoenzyme A (Ac-CoA), favorise alors l’oxydation du glucose dans la mitochondrie. Le DCA a déjà été utilisé depuis longtemps comme traitement hypocholestérolémiant et bloquant l’acidose lactique. Mon équipe a montré auparavant que le changement métabolique permet aux cellules tumorales d'échapper à la réponse immune.Nous avons observé que le traitement par DCA induisait, dépendante du phénotype p53, une forte up-régulation de l'expression du mRNA et des protéines de stress MICA, MICB et ULBP1, ligands spécifiques des récepteurs activateurs NKG2D des cellules NK, et induise alors une réponse cytotoxique contre les cellules tumorale.D'autre part nous avons évalué l'effet de DCA sur l'expression des transporteurs ABC qui interviennent dans l'efflux des agents anticancéreux utilisé dans la chimiothérapie. L'expression des transporteurs ABC était fortement liée aux phénotypes de chimiorésistance. Nous avons bien confirmé que le DCA provoque une diminution de l'expression de ABCB1, ABCC1, ABCC5 et ABCG2 dans les cellules wtp53 alors qu'il induit une augmentation dans les cellules mutantp53 ou nullp53.Les promoteurs des transporteurs et les protéines de stress étudiés comportent également plusieurs sites de liaison spécifique au facteur de transcription MEF2, qui est la cible d’ERK5. Nous avons bien constaté que en plus de ca capacité de changer le métabolisme tumorale, le DCA modifie l'expression ABCB1, ABCC1, ABCC5 et ABCG2 par l'activation de la voie ERK5/MEF2 .Ces résultats sont confirmé dans diverses lignées cellulaires, ainsi que dans des cellules issues de patients et dans un modèle in vivo / Tumorigenesis is caused by a series of defects that occur within the cancer cell and its microenvironment. These abnormalities allow the tumor cell to develop its own strategies for growth, proliferation, differentiation and metabolism. In the last, cancer cells favor lactic fermentation instead of oxidative phosphorylation OXPHOS (respiration). This metabolic adaptation is called the Warburg effect.We proposed an innovative therapeutic concept based on the induction of metabolic changes by the use of dichloroacetate (DCA) and this is associated with immunotherapy using activated NK cells. DCA, a pyruvate dehydrogenase kinase (PDK) inhibitor, induces the activation of pyruvate dehydrogenase (PDH), responsible for the catalysis of pyruvate to acetylcoenzyme A (Ac-CoA), promoting the oxidation of glucose/pyruvate in the mitochondria. DCA has been used for a long time as a cholesterol-lowering and anti-lactic acidosis therapy. My team has previously shown that the metabolic change allows tumor cells to escape the immune response. I have observed that DCA treatment induced a high upregulation of mRNA and protein expression of the stress ligands MICA, MICB and ULBP1. These are recognized by the NK cell activating receptor NKG2D, inducing a NK cell-mediated cytotoxic response against tumor cells. DCA-induced expression of these stress ligands depends on wtp53 expression on the tumor cell.On the other hand, we evaluated the effect of DCA on the expression of ABC carriers, which intervene in the efflux of anticancer agents used in chemotherapy. The expression of ABC carriers is strongly related to drug resistance phenotypes. We observed that DCA causes a decrease in the expression of ABCB1, ABCC1, ABCC5 and ABCG2 in wtp53 cells while it induces an increase in mutantp53 or nullp53 cells. Conversely, DCA-induced accumulation of antitumor drugs, i.e. daunorubicin, and favors chemotherapy-induced tumor death only in wtp53-expressing cancer cells. The promoters of these ABC transporters and the stress proteins presented above contain several binding sites specific to the transcription factor MEF2, which is the target of ERK5. We have found that in addition to the ability to change tumor metabolism, DCA modifies the expression ABCB1, ABCC1, ABCC5 and ABCG2 by activation of the ERK5 / MEF2 pathway. These results are confirmed in various cell lines, in cells derived from patients and in an in vivo model

Des études récentes ont mis en évidence qu’au moins 70% du génome humain est transcrit et produit une myriade d’ARN non codants. Au début de ma thèse j’ai utilisé des données de RNA-Seq sens-spécifique pour identifier les transcrits divergents dans les tissus primaires de souris. J’ai utilisé aussi des données ChIP-Seq afin d’analyser leurs caractéristiques épigénétiques. Nous avons trouvé que la transcription divergente est associée de manière significative à des gènes liés à la régulation de la transcription et le développement.Dans un deuxième temps, je me suis intéressé à l'identification et la caractérisation des lncRNA chez l'homme. J’ai appliqué des approches statistiques pour quantifier leur expression et identifier ceux qui sont (dé)régulés dans un contexte normal ou leucémique Dans un troisième temps. Au cours de ma thèse, je me suis attaché à étudier le mécanisme moléculaire épigénomique ainsi qu'à développer un pipeline bioinformatique permettant d'identifier les gènes (codant ou non codant) associés à des profils H3K4me2/3 étendus. Ainsi, j’ai mis en évidences que ces profils étendus étaient directement dépendants d'un processus transcriptionelle impliquant des nouveaux mécanismes de régulation. Cette étude a donné aussi lieu à une publication dont je suis cosignataire en premier auteur. (Zacarias, Belhocine et al. Journal of Immunology 2015). Cette nouvelle approche devrait s'avérer très utile dans d'autres modèles développementaux et/ou pathologiques et peuvent être utilisé comme outil de prioritisation des candidats les plus relevant dans des approches plus globale. / Recent studies indicate that at least 70% of the human genome is transcribed into a myriad of both coding and non-coding RNAs. at the beginning of my thesis I used RNA-Seq data to identify divergent transcripts in mouse primary tissues. I also used the ChIP-Seq data to analyze their epigenetic characteristics. The results demonstrated that divergent transcription was significantly associated with genes related to transcription regulation and development. In a second phase, I was interested in the LncRNAs identification and characterization during the development of human T lymphocytes and in T acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). I applied statistical approaches to quantify their expression and identify those that are regulated in a normal or leukemic contextSubsequently, I determined the most appropriate approach to prioritize the functional role of LncRNAs. Indeed, I focused on studying the molecular epigenomic mechanism marking and developed a bioinformatics pipeline to identify genes (coding or non-coding) associated with the extended profiles of H3K4me2/3. Evidence generated through the pipeline demonstrated that these extended profiles were directly dependent on specific transcriptional process involving new regulatory mechanisms.In conclusion, this body of work has resulted in a more comprehensive approach to determining the true functional role of LncRNAs in both normal biological context and in human disease.