Les cellules différenciées peuvent changer de destin cellulaire de manière induite ou naturelle. Afin de comprendre et connaître les acteurs et mécanismes contrôlant les processus de reprogrammation, notre laboratoire étudie le changement d'identité (ou transdifférenciation, Td) naturel d’une cellule épithéliale rectale (nommée Y) en motoneurone (nommé PDA) chez Caenorhabditis elegans. Les travaux préliminaires ont montré qu’il existe une synergie entre les modifications d’histone (jmjd-3.1 et wdr-5.1) et l’ubiquitination (sel-10). SEL-10 est une ubiquitine ligase E3 possédant un domaine Fbox et une répétition de domaines WD40. Dans cette étude, nous avons pu mettre en évidence : i) une implication du domaine Fbox, des indications sur la localisation intracellulaire de SEL-10 et un rôle inattendu du protéasome au sein de la Td. ii) un rôle de SEL-10 dans la robustesse de la Td (résistance aux stress environnementaux). iii) sel-10, jmjd-3.1 et wdr-5.1 agissent sur la transcription de gènes impliqués dans la transdifférenciation (testé par smFISH). Ainsi qu’une caractérisation du motif d’expression marqueur de Td cog-1 au cours de la redifférenciation. / Differentiated cells can change their cellular fate induced or naturally. In order to understand the mechanisms controlling reprogramming processes, our laboratory is studying the natural change in identity (or transdifferentiation, Td) of a rectal epithelial cell (named Y) and motor neuron (named PDA) in Caenorhabditis elegans.Preliminary work has shown that there is a synergy between histone modifications (jmjd-3.1 and wdr-5.1) and ubiquitination (sel-10). SEL-10 is an E3 ubiquitin ligase with a Fbox domain and WD40 repeat domain.In this study, we highlight: i) the Fbox domain involvement in the Td, indications about the intracellular localization of SEL-10 and an unexpected role of the proteasome within TD. ii) a role of SEL-10 in the robustness of the Td. iii) sel-10, jmjd-3.1 and wdr-5.1 act on gene transcription in transdifferentiation. This one was tested by smFISH and allowed the characterization of the cog-1 transdifferentiation marker expression pattern during redifferentiation.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Although the RING finger protein 121 (RNF121) is a highly conserved E3 ubiquitin ligase from Caenorhabditis elegans to human, its function is poorly understood and in higher eukaryotes it has been studied only at in vitro level. RNF121 has been described to have various functions: i) it was ascribed to function as a broad regulator of NF-κB activation, ii) it was shown to control intracellular trafficking of various membrane proteins, and iii) its downregulation leads to apoptosis. Moreover, RNF121 might have a role in cancer as its expression was found to be 16.4-fold higher in patients suffering from Barrett esophagus (precancerous lesion of esophageal adenocarcinoma) and was even more increased in esophageal adenocarcinoma comparing to healthy population. In addition, RNF121 gene is localized in the candidate region containing breast cancer susceptibility genes. To gain insight into physiological functions of RNF121, Rnf121 knockout mice (Rnf121tm1b(EUCOMM)Hmgu ) were generated in the Czech Centre for Phenogenomics and further studied in our laboratory. Rnf121+ /- intercross breedings showed a prenatal lethal phenotype of Rnf121-/- embryos, which were dying prior embryonic day (E) 11.5. Preliminary experiments carried out in our laboratory showed numerous vascular defects in null mutant embryo,...

La Neuropathie à Axones Géants (NAG) est une maladie neurodégénérative rare et fatale caractérisée par une détérioration du système nerveux central et périphérique, impliquant les fonctions motrices et sensorielles. La détérioration massive du système nerveux est accompagnée d'une désorganisation générale des Filaments Intermédiaires ce qui la différencie de nombreuses maladies neurodégénératives où seuls les neurofilaments(NFs) sont affectés. La protéine déficiente, la gigaxonine, est la sous-unité d'une ubiquitine ligase E3, responsable de la reconnaissance spécifique des substrats MAP1B, MAP1S et TBCB, seuls connus à ce jour.Dans le but d'étudier le rôle de la gigaxonine sur la survie neuronale, la désorganisation du cytosquelette et d'avoir un modèle animal suffisamment fort pour envisager des tests thérapeutiques, j'ai caractérisé un modèle murin de NAG. Pour ce faire, j'ai réalisé une étude comportementale des fonctions motrices et sensorielles ainsi qu'une étude histopathologique. Les souris NAG (129/SvJ) développent un phénotype moteur modéré dès 60 semaines alors que les souris NAG (C57BL/6) présentent un phénotype sensoriel dès 60 semaines. Les données histopathologiques ne présentent pas de mort neuronale mais les NFs sont sévèrement altérés. Les NFs sont plus abondant, leur diamètre est augmenté et leur orientation hétérogène, comme c'est observé chez les patients NAG.Nos résultats montrent que l'absence de gigaxonine induit un phénotype moteur et sensoriel modéré mais par contre reproduit la désorganisation massive des NFs observée chez les patients. Ce modèle va nous permettred'étudier le rôle de la gigaxonine, une ligase E3, sur l'organisation des NFs et ainsi comprendre les processus pathologiques impliqués dans d'autres maladies neurodégénératives caractérisée par une accumulation des NFs et un dysfonctionnement du système ubiquitine-protéasome comme les maladies d'Azheimer, de Parkinson etd'huntington ou la sclérose latérale amyotrophique. / Giant Axonal Neuropathy (GAN) is a rare and fatale neurodegenerative disorder characterized by a deterioration of the peripheral and central nervous system. The broad deterioration of the nervous system is accompanied with a general disorganization of the Intermediate Filaments which makes it different from other neurodegenerative disorders wherein only neurofilaments (NFs) are affected. The defective protein, gigaxonin, is the substrate adaptator of an E3 ubiquitin ligase, in charge of the specific recognition of MAP1B, MAP1S and TBCB. In order to study the role of gigaxonin on neuronal survival, the cytoskeleton disorganization and to have a relevant GAN animal model to evaluate efficacy of GAN treatments, I have characterized a GAN mouse model. I did a motor and sensory behavioural study and an histopathologic study. The GAN mice (129/SvJ) shown mild motordeficits starting at 60 weeks of age while sensory deficits were evidenced in C57BL/6 GAN mice. No apparent neurodegeneration was evidenced in GAN mice, but dysregulation of NFs was massive. NFs were more abundant, they shown the abnormal increased diameter and misorientation that are characteristics of the human pathology. Our results show that gigaxonin depletion induces mild motor and sensory deficits but recapitulates the severe NFs dysregulation seen in patients. Our model will allow us to study the role of the gigaxonin-E3 ligase in organizing NFs and understand the pathological processes engaged in other neurodegenerative disorders characterized by accumulation of NFs and dysfunction of the Ubiquitin Proteasome System, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis, Huntington's, Alzheimer's and Parkinson's diseases.

Rift Valley fever virus (RVFV) is a negative-sense RNA virus that is classified as an overlap select agent by the USDA and the HHS. It was first discovered in the Rift Valley of Kenya in the early 1930s. RVFV is an arbovirus that is transmitted by mosquitoes and infects ruminants and humans. RVFV in humans causes an acute self-limiting febrile illness but in a small percentage of cases, a severe version is noted by ocular disease, hepatitis, hemorrhagic fever, and death. In ruminants, the disease is similar with young livestock being the most susceptible. RVFV is also known to cause "abortion storms" where infected pregnant ruminants abort their fetuses with a near 100% fatality rate. Viruses are obligate intracellular parasites utilizing host-factors to replicate. This study identified three host-protein interactors of the viral Gn and L proteins that aid in viral replication. UBR4 was determined to be an interactor of Gn via immunoprecipitation followed by either LC/MS/MS or western blot analysis. Its inhibition via siRNA or CRISPR-Cas9 knockout showed a reduction of viral titers and viral RNA production. It was determined that UBR4 specifically affects viral RNA production and not entry or egress. Conversely, CK1α and PP1α were identified as binding partners of the L protein using similar methods. CK1α, a kinase, and PP1α, a phosphatase, were chosen for further verification due to data demonstrating the L protein is phosphorylated on at least one serine residue, in addition to PP1α already being shown to impact RVFV replication. Inhibition of CK1 and PP1 via small molecule inhibitors, D4476 and 1E7-03, respectively, showed a decrease in viral titers and RNA production. Strand-specific RT-qPCR demonstrates that CK1 and PP1 impact genomic replication. Upon treatment with D4476 a decrease in L protein phosphorylation was observed. Additionally, it has already been shown that treatment with 1E7-03 increases L protein phosphorylation. These data indicate that CK1 and PP1 modulate L protein phosphorylation, contributing to changes in RVFV replication. This study identifies three host-proteins that affect viral replication, which could be used as a foundation for host-based therapeutic and vaccine development. / Doctor of Philosophy / Rift Valley fever virus (RVFV) is a major biological threat due to its ability to infect both livestock and humans and be passed by mosquito bite. RVFV was first discovered in Africa in the early 1930s. To date, there is no approved therapeutic or vaccine. RVFV usually causes very mild disease but in a small percentage of cases, it progresses to include liver disease, vision loss, swelling of the brain, bleeding, and death. A virus itself is not alive; it needs a living host in order to replicate. To do this, it utilizes things naturally occurring inside the host. The purpose of this study is to identify host-factors that the virus uses in order to efficiently make more viruses. The first viral protein of interest is the glycoprotein, Gn, which is important for viral entry and assembly of the viral particles. It was determined that the host-protein UBR4 is an interactor of Gn and that the inhibition of UBR4 decreases the amount of infectious virus being produced. Similarly, the host-proteins, CK1α and PP1α, were found to be interactors of the viral L protein. The L protein is responsible for synthesizing the building blocks of the virus. It was determined that when CK1 and PP1 are inhibited, the L protein is less efficient at making these building blocks. Understanding the host-factors the virus utilizes is important to the basic understanding of how RVFV infects the host and the development of therapeutics to combat an outbreak.

L’Hypertension Hyperkaliémique Familiale (FHHt) est une forme rare d’hypertension artérielle associée à une hyperkaliémie et une acidose métabolique hyperchlorémique. Ces troubles sont corrigés par les diurétiques thiazidiques qui inhibent le co-transporteur Na+-Cl- NCC exprimé dans le néphron distal. Cette sensibilité aux diurétiques thiazidiques a laissé́ supposer que la FHHt est causée par une activation de NCC. En 2001, des mutations, de type gain-de-fonction, responsables de la FHHt ont été découvertes dans les gènes codant les sérine-thréonine kinases WNK1 et WNK4 [With No (K) lysine]. Des études in vitro ont montré que WNK1 et WNK4 stimulent NCC de façon indirecte, via la phosphorylation et l'activation de la kinase SPAK (Ste20 like Proline-Alanine rich Kinase). In vivo, l’activation de SPAK joue un rôle central dans le développement de la FHHt due aux mutations de WNK4. L'implication de SPAK n'a pas été définie dans le cas des mutations de WNK1. Nous avons donc croisé les souris WNK1+/FHHt, porteuses d'une mutation FHHt de WNK1, avec les souris SPAK243A/243A, porteuses d’une mutation abolissant l’activation de SPAK par les WNK. L’ensemble des phénotypes observés chez les souris WNK1+/FHHt est corrigé chez les souris WNK1+/FHHt:SPAK243A/243A démontrant ainsi le rôle central de SPAK dans la FHHt causée par les mutations WNK1. En 2012, de nouvelles mutations ont été identifiées dans les gènes codant CUL3 et KLHL3, deux composants d’un complexe ubiquitine ligase. Comme les mutations de WNK1 et WNK4, ces mutations entraînent une augmentation de l’expression de WNK1 et de WNK4. De façon inattendue, les patients FHHt porteurs d'une mutation CUL3 présentent un phénotype plus sévère que les autres. Des études suggèrent que ces mutations perturbent la fonction non seulement du néphron distal mais également des artères. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons généré et comparé deux modèles de souris : les souris pgk-Cul3Δ9, exprimant la mutation Cul3 de façon ubiquitaire, comme les patients, et les souris sm22-Cul3Δ9, exprimant la mutation uniquement dans les cellules musculaires vasculaires lisses. Les deux modèles sont hypertendus, mais les souris pgk-Cul3Δ9 le sont significativement plus que les souris sm22-Cul3Δ9, ce qui prouve que l’hypertension causée par les mutations Cul3 résulte du cumul d’une atteinte rénale et vasculaire. Récemment, de nouvelles mutations faux-sens d'un domaine dit acide de WNK1 ont été identifiées dans un petit nombre de patients atteints de FHHt. Ce domaine est nécessaire à la liaison à KLHL3 et donc à l’ubiquitination des WNK. Notre étude montre que, in vitro, ces mutations entraînent une accumulation d'une seule isoforme de WNK1. Chez la souris, la mutation du domaine acide provoque le même phénotype que les patients, ainsi qu’une augmentation de la phosphorylation de SPAK et du co-transporteur NCC. Cette étude a donc permis de démontrer le rôle essentiel de ce domaine dans la régulation de l'abondance de WNK1 dans le néphron distal in vivo. En conclusion, mon travail a permis une meilleure compréhension du rôle joué par SPAK, WNK1 et CUL3 dans le développement de la FHHt et, plus largement, de la physiopathologie de la FHHt. / Familial Hyperkalemic Hypertension (FHHt) is a rare form of hypertension associated with hyperkalemia and hyperchloremic metabolic acidosis. These disorders are all corrected by thiazide diuretics that inhibit the Na+-Cl- NCC cotransporter expressed in the distal nephron. The sensitivity of FHHt patients to thiazide diuretics strongly suggested that FHHt is caused by NCC activation. In 2001, gain-of function-mutations were identified in the genes encoding the serine-threonine kinases WNK1 and WNK4 [With No (K) lysine] in a subst of FHHt patients. In vitro studies demonstrate that WNK1 and WNK4 indirectly stimulate NCC, through the phosphorylation and activation of SPAK (Ste20 like Proline-Alanine rich Kinase). In vivo, SPAK activation plays a central role in the pathogenesis of FHHt caused by WNK4 mutations. However, the implication of SPAK has never been shown for the WNK1 mutations. Thus, we crossed WNK1+/FHHt mice, bearing the WNK1-FHHt mutation, with SPAK243A/243A mice bearing a mutation abolishing SPAK activation by the WNKs. All FHHt phenotypes observed in WNK1+/FHHt were corrected in WNK1+/FHHt:SPAK243A/243A mice demonstrating the central role of SPAK in FHHt caused by WNK1 mutations. In 2012, new mutations have been identified in CUL3 and KLHL3 genes. The products of these genes are both part of a ubiquitin ligase complex. As WNK1 and WNK4 mutations, these mutations lead to an increased expression of L-WNK1 and/or WNK4. Surprisingly, patients with CUL3 mutations display a more severe phenotype. Previous studies have suggested that CUL3 could be involved not only in the regulation of ion transport in the distal nephron but also in the regulation of vascular tone. To verify this hypothesis, we generated and compared two mouse models: pgk-Cul3Δ9 mouse model bearing, as patients, an ubiquitous Cul3 mutation, and sm22-Cul3Δ9 mouse model that express the Cul3 mutation only in vascular smooth muscle cells. Both models are hypertensive, but pgk-Cul3Δ9 mice display a more severe hypertension than sm22-Cul3Δ9 mice. It demonstrates that the hypertension caused by Cul3 mutations results from both renal and vascular disorders. Recently, new missense mutations have been identified in WNK1 acidic motif in a small number of FHHt patients. This acidic motif is necessary for the liaison to KLHL3 and therefore for WNK ubiquitination. Our study shows that, in vitro, these mutations lead to the accumulation of only one isoform of WNK1. In mice, the mutation of WNK1 acidic motif leads to an increased phosphorylation of SPAK and NCC. Therefore, it demonstrates the essential role of the acidic motif in the regulation of WNK1 abundance in vivo in the distal nephron. This work contributes to a better comprehension of the role played by SPAK, WNK1 and CUL3 in FHHt and more generally in the regulation of blood pressure and Na+/K+ homeostasis.

Les modifications post-traductionnelles des protéines constituent un niveau crucial de régulation de l'expression des gènes. Parmi elles, la conjugaison peptidique impliquant l'ubiquitine intervient entre autre dans la régulation de la stabilité protéique. La fixation de ce peptide de 76 acides aminés, extrêmement conservé, sous forme de chaîne de polyubiquitine, nécessite l'intervention de trois enzymes (E1, E2 et E3) et constitue un signal de dégradation de la protéine ainsi modifiée. Cette voie de régulation intervient dans de très nombreux processus biologiques. Les complexes SCF sont impliqués dans la voie de protéolyse ciblée. Ils représentent l' une des classes les plus fréquentes d'ubiquitine ligase E3 et ils sont composés de quatre sous-unités (Rbx, Cullin, SKP1, et F-box). La structure et la fonction des complexes SCF, ont été étudiées chez la levure, l'Homme et la plante modèle A. thaliana. Cependant, peu de travaux ont été réalisés chez des plantes cultivées, en particulier les céréales, telles que le blé. Cinq gènes codant pour la sous-unité Skp1 (TSK1, TSK3, TSK6, TSK11 et TSK16), cinq gènes codant pour la sous-unité F-box (ZTL, ATFBL5, EBF, TIR1 et ABA-T), un gène codant pour la sous-unité Cullin1 et un gène codant pour la protéine RBX du complexe SCF du blé, ont été isolés et clonés. Les différents tests d'interaction entre les quatre sous-unités du complexe SCF ont été réalisés par la méthode du double-hybride dans la levure en utilisant la technologie Gateway. Ces études ont montré que les deux protéines, TSK1 et TSK3, fixent spécifiquement différentes sous-unités F-box. Parallèlement, nous avons montré que la protéine TSK11 représente une structure particulière. Des études d'insertion/délétion sur la protéine TSK11 ont permis d'identifier un nouveau domaine indispensable à l'interaction. Les analyses par PCR semi-quantitative des différents gènes codant pour la sous-unité Skp1, dans trois tissus différents (feuille tige et racine), ont mis en évidence une expression constitutive des gènes TSK3, TSK6 et TSK11. Tandis que les gènes TSK1 et TSK16 sont exprimés préférentiellement dans les racines. Les analyses par PCR semi-quantitative sur des plantules de blé à différents stades de développement, ont mis en évidence une surexpression du gène TSK11 au moment de la floraison. Ce qui suggère que TSK11 est probablement un équivalent fonctionnel d'ASK1 chez Arabidopsis thaliana.

Les modifications post-traductionnelles des protéines constituent un niveau crucial de régulation de l’expression des gènes. Parmi elles, la conjugaison peptidique impliquant l’ubiquitine intervient entre autre dans la régulation de la stabilité protéique. La fixation de ce peptide de 76 acides aminés, extrêmement conservé, sous forme de chaîne de polyubiquitine, nécessite l’intervention de trois enzymes (E1, E2 et E3) et constitue un signal de dégradation de la protéine ainsi modifiée. Cette voie de régulation intervient dans de très nombreux processus biologiques. Les complexes SCF sont impliqués dans la voie de protéolyse ciblée. Ils représentent l' une des classes les plus fréquentes d'ubiquitine ligase E3 et ils sont composés de quatre sous-unités (Rbx, Cullin, SKP1, et F-box). La structure et la fonction des complexes SCF, ont été étudiées chez la levure, l’Homme et la plante modèle A. thaliana. Cependant, peu de travaux ont été réalisés chez des plantes cultivées, en particulier les céréales, telles que le blé. Cinq gènes codant pour la sous-unité Skp1 (TSK1, TSK3, TSK6, TSK11 et TSK16), cinq gènes codant pour la sous-unité F-box (ZTL, ATFBL5, EBF, TIR1 et ABA-T), un gène codant pour la sous-unité Cullin1 et un gène codant pour la protéine RBX du complexe SCF du blé, ont été isolés et clonés. Les différents tests d’interaction entre les quatre sous-unités du complexe SCF ont été réalisés par la méthode du double-hybride dans la levure en utilisant la technologie Gateway. Ces études ont montré que les deux protéines, TSK1 et TSK3, fixent spécifiquement différentes sous-unités F-box. Parallèlement, nous avons montré que la protéine TSK11 représente une structure particulière. Des études d’insertion/délétion sur la protéine TSK11 ont permis d’identifier un nouveau domaine indispensable à l’interaction. Les analyses par PCR semi-quantitative des différents gènes codant pour la sous-unité Skp1, dans trois tissus différents (feuille tige et racine), ont mis en évidence une expression constitutive des gènes TSK3, TSK6 et TSK11. Tandis que les gènes TSK1 et TSK16 sont exprimés préférentiellement dans les racines. Les analyses par PCR semi-quantitative sur des plantules de blé à différents stades de développement, ont mis en évidence une surexpression du gène TSK11 au moment de la floraison. Ce qui suggère que TSK11 est probablement un équivalent fonctionnel d’ASK1 chez Arabidopsis thaliana. / The selective degradation of proteins is an important means of regulating gene expression and plays crucial roles in the control of various cellular processes. The Ubiquitin (Ub)–Proteasome System (UPS) is the principal non-lysosomal proteolytic pathway in eukaryotic cells and is required for the degradation of key regulatory proteins. Ubiquitin is a 76-residue protein that can be attached covalently to target proteins through an enzymatic conjugation cascade involving three enzymes denoted, E1, E2 and E3.The SCF complex is a type of ubiquitin-protein ligase (E3) that acts as the specific factor responsible for substrate recognition and ubiquitination. Some polyubiquitinated proteins are then targeted to the 26S proteasome for degradation. The SCF complex consists of four components including SKP1, Cullin1, Rbx1 and a large gene family of F-box proteins. Twenty one SKP1-related genes have been described in the Arabidopsis genome and some of these genes have been analyzed genetically. By contrast, little is known about the function and structure of SKP1 homologues in wheat. Some of the Triticum SKP1-related protein (TSKs) have been characterized in this study. Five complete sequences of SKP1 (TSK1, TSK3, TSK6, TSK11 and TSK16), five F-box (ZTL, ATFBL5, EBF, TIR1 and ABA-T), one Cullin1 and one Rbx, were successfully cloned and biochemically characterized. Yeast two-hybrid analysis showed that TSK1 and TSK3 are capable of interacting with different F-box proteins. Furthermore, TSK11 contains an additional domain that changed its interaction capabilities. In vitro analysis using a chimeric protein showed that this additional domain could modify the interaction between a SKP-like protein and two F-box proteins. Expression analyses revealed that TSK1 and TSK16 were expressed predominantly in roots. While, TSK3, TSK6 and TSK11 were expressed in several wheat organs. In addition, the TSK11 was up-regulated in the leaves at the flowering stage.