Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Objetivo: Investigar a possivel participacao de celulas B-1 na inducao de tolerancia oral em camundongos submetidos a um regime de alimentacao continua com OVA. Metodos: Camundongos femeos das linhagens BALB/c e BALB/xid, entre 6 e 8 semanas, foram utilizados na formacao de 9 grupos experimentais, composto respectivamente pelos grupos de animais tratados previamente com OVA por via oral, (B/c-T e Bx-T); grupo de animais que nao receberam tratamento oral com OVA mas foram imunizados, par via s.c. com OVA emulsificada (1:1) em Adjuvante completo de Freund (B/c-I e B/x-I); grupo de animais que foram somente desafiados com OVA agregada (B/c-N e B/x-N); grupos B/x-recN, B/x-recT e B/x-recl compostos por camundongos BALB/Xid reconstituidos por transferencia adotiva com celulas B-1 do sobrenadante de cultura de celulas aderentes peritoneais de camundongos BALB/c naive; tolerizados e imunes, respectivamente. Esses animais receberam transferencia adotiva de celulas B-1 tres dias antes da imunizacao. A resposta foi avaliada por: a) reacao inflamatoria local; b) linfoproliferacao pela incorporacao de 3+[H]Timidina e c) determinacao por ELISA de imunoglobulinas anti-¬OVA das subclasses (IgG total, IgG1 e IgG2a). Resultados: Em camundongos BALB/c 0 tratamento oral com OVA previamente a imunizacao foi capaz de suprimir reacao local de hipersensibilidade e resposta celular muito embora esse efeito nao tenha sido observado em camundongos BALB/Xid submetidos ao mesmo tipo de tratamento. No entanto, quando camundongos BALB/Xid foram transferidos adotivamente com celulas de sobrenadante de cultura celular de peritoneo de camundongos BALB/c tolerizados,que esses animais desenvolveram supressao da reacao local de hipersensibilidade e supressao da resposta celular. Conclusao: Celulas B-1 da cavidade peritoneal de camundongos BALB/c doadores, submetidos ao tratamento oral com OVA, foram eficazes em promover a supressao da reacao de hipersensibilidade local e da resposta celular linfoproliferativa, mas nao a de producao de anticorpos, quando adotivamente transferidas para camundongos BALB/Xid, refratarios a inducao de tolerancia oral / Purpose: To investigate a possible participation of B-1 cells in inducing oral tolerance in mice submitted to continuous feeding with OVA. Methods: Female mice of the BALB/c and BALB/Xid lineages, aged 6 to 8 weeks, were divided into 9 groups and submitted to the following conditions: previous oral treatment with OVA (B/c-T and Bx-T); without oral treatment with OVA, but with subcutaneous immunization with OVA emulsion (1:1) in complete Freund's adjuvant (B/c-I and B/x-I); challenge with aggregated OVA only (B/c-N and B/x-N); adoptive transfer (rebuilding), to BALB/Xid mice, of B-1 cells in culture supernatant with peritoneal adherent cells from naïve BALB/c mice (B/x-recN, B/x-recT, and B/x-recI); made tolerant and immune, respectively. These animals received adoptive transfer of B-1 cells three days prior to immunization. The immune responses were evaluated by means of: a) local inflammatory response; b) lymphoproliferation by incorporation of 3+[H]Thymidine and c) determination of anti-OVA immunoglobulin (subclasses total IgG, IgG1, and IgG2a) by ELISA. Results: Oral treatment with OVA prior to immunization suppressed the local hypersensitivity reaction and cellular response in BALB/c mice, although this effect was not observed in BALB/Xid mice in the same conditions. However, when BALB/Xid mice were reconstituted with cultured cells from tolerized peritoneal BALB/c mice, the suppression of local hypersensitivity and cellular response were observed. Conclusion: B-1 cells from BALB/c mice orally treated with OVA caused phenotypic and functional changes and suppression of cellular response local and linfoproliferative and local hypersensitivity reaction when adoptively transferred to BALB/Xid mice refractory to induction of oral tolerance. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-25T21:58:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 287559.pdf: 517631 bytes, checksum: ec350fa2e545cb38f933d0b6feb4f38b (MD5) / O presente trabalho propôs desenvolver uma metodologia in vitro simples, sensível e reprodutível para a prospecção de compostos obtidos de produtos naturais ou seus derivados sintéticos com potencial atividade imunomodulatória sobre linfócitos B, principal célula efetora da resposta imune humoral, como alternativa ao uso de sistemas experimentais in vivo. O planejamento do estudo fundamentou-se na utilização da linhagem linfoblastóide B humana SKW 6.4, imortalizada via EBV, como modelo preditivo in vitro; na padronização do método ELISA para a titulação de imunoglobulinas totais secretadas em cultura, empregada como parâmetro inicial de avaliação; e na definição de condições experimentais e padrões comparativos que propiciem a análise do modelo selecionado quanto à modulação de suas funções imunes. O protocolo de cultivo celular e demais variáveis foram determinados para placas de cultura de 96 micropoços. Células SKW 6.4 foram fortemente imunoestimuladas em tratamento com PMA ou LPS nas concentrações ótimas de 100ng·mL-1 ou 100µg·mL-1, respectivamente. Condições referenciais de imunossupressão foram estabelecidas após ensaio com 25µg·mL-1 de AZA, 50ng·mL-1 de MPA ou 10ng·mL-1 de RAPA. A secreção de IL-6 pelo modelo in vitro foi claramente modulada na presença de LPS e DEX, possibilitando sua dosagem como parâmetro avaliativo adicional de resposta imunológica. A análise de diferentes extratos polissacarídicos de Agaricus subrufescens conforme o ensaio padronizado revelou significativa atividade imunoestimulatória sobre células SKW 6.4 para frações com maior peso molecular médio (~630kDa), permitindo especular sobre possíveis rotas de ativação e sugerir um método ótimo de purificação para futura aplicação biotecnológica. Os resultados globais alcançados neste estudo demonstraram a sensibilidade e eficácia do ensaio in vitro desenvolvido, viabilizando sua utilização na pesquisa e triagem de compostos com potencial atividade imunomodulatória sobre linfócitos B como possível método substitutivo ao uso de animais de experimentação.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:44:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Objetivo: Investigar se a irradiação toracoabdominal de camundongos induz bloqueio na evolução do LES em camundongos (NZB/NZW) F1 e a possível participação de células B-1 no processo. Métodos: Camundongos das linhagens (NZB/NZW) F1 fêmeos, NZB e NZW foram irradiados com 9 Gy na região toracoabdominal, a partir do terceiro mês de vida; 1 x por mês até 13 meses de idade. A dose total administrada foi de 90 Gy. Os animais foram sacrificados 48 h após a última irradiação, exceto os animais (NZB/NZW) F1 fêmeos não-irradiados (lúpicos), que vieram a óbito com 8, 9 ou 10 meses de idade. Foram realizados experimentos de citometria de fluxo e cultura de células B-1 de animais irradiados ou não. Foi também realizada análise por imunofluorescência indireta, da presença de auto-anticorpos no soro dos animais tratados e controles. Os rins dos animais foram analisados por métodos histológicos convencionais. Resultados: A sobrevida dos camundongos tratados com irradiação foi estatisticamente maior, quando comparada com aquela de camundongos não-tratados. Animais irradiados não apresentaram sinais da doença nem níveis detectáveis de auto-anticorpos circulantes. A análise histopatológica dos rins mostrou diminuição das lesões glomerulares e do infiltrado de células inflamatórias nos animais tratados, em contraposição aos glomérulos dos animais controles não tratados. Células B-1 estão normalmente presentes na cavidade peritoneal de animais (NZB/NZW) F1 e BALB/c, NZB e NZW. A irradiação seletiva desses animais resultou em diminuição significativa de células B-1 da cavidade peritoneal de camundongos BALB/c, NZB...(au). / The New Zealand Black x New Zealand White F1 [(NZB/NZW) F1] mouse develops an autoimmune condition in all similar to the systemic lupus erythematosus that occurs in humans. Among all the cellular alterations described, the number of B-1 cells increases in (NZB/NZW) F1 mice and in patients with rheumatoid arthritis and Sjögren disease. Considering evidences that B-1 cells could play a role in the development of lupus-like condition in female (NZB/NZW) F1 mice, a lead device was developed in order to deplete the animals of B-1 cells by selective irradiation. Apparatus protects the front and hind limbs of the animals against radiation, living the thoracic and abdominal region exposed. Cells were characterized by FACS. Survival of irradiated mice was significantly higher when compared with non-irradiated animals. Histological analysis of kidneys of irradiated animals showed milder lesions. Further, autoantibody was lower in irradiated mice when compared to controls. Radiation lead to marked reduction of B-1 cells in BALB/c but not in (NZB/NZW) F1 female mice. The radioresistance observed in B-1 cells from (NZB/NZW) F1 female mice is probably due to the overexpression of Bcl-2. The possible relationship between the radioresistance of these cells and the impairment of SLE is discussed. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A imunodeficiência comum variável (CVID) é caracterizada por hipogamaglobulinemia. Anteriormente identificou-se uma paciente com CVID que apresenta nível aumentado de estresse de retículo endoplasmático (ER), secundário a desregulação da via UPR. No presente trabalho, estendemos esta análise para outros pacientes e avaliamos o perfil de maturação de seus linfócitos B. Métodos: Western-blot, RT-PCR, Q-PCR, Citometria de Fluxo e cultura de células B ex vivo e imortalizadas. Resultados: A análise de 16 pacientes com CVID e 9 indivíduos saudáveis revelou três pacientes com porcentagens aumentadas de linfócitos B imaturos no sangue periférico. A análise da expressão de RNAm para BiP e XBP-1 em linfócitos B destes pacientes, após estímulo com LPS in vitro, identificou que os linfócitos B de um deles apresenta estresse de RE. Conclusão: Identificamos um subgrupo de pacientes com CVID que apresentam linfócitos B imaturos no sangue periférico. Um membro deste subgrupo apresenta estresse aumentado de ER. / Common Variable Immunodeficiency (CVID) is characterized by hypogammaglobulinemia. Previously a CVID patient was identified with increased levels of Endoplasmic Reticulum (ER) stress due to dysregulation of the UPR. In the present study these analyses were performed in other patients and healthy donors. Maturation markers of B lymphocytes were also characterized in these individuals. Methods: Western-blot, RT-PCR, Q-PCR, Flow cytometry and culturing of ex vivo and immortalized B cells. Results: The analysis of 16 CVID patients and 9 healthy donors revealed three patients that present higher percentage of immature B cells in peripheral blood. Analysis of expression of BiP and XBP1 induced by LPS treatment of B lymphocytes from these patients revealed that one patient present increased levels of ER stress.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:48:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Na ausência de estímulo antigênico, células B-1 são importantes produtoras de anticorpos naturais em camundongos e humanos e são consideradas como a primeira linha de defesa contra patógenos. Por causa disso, o papel dessas células em respostas imunes mediadas por células T é comumente negligenciado. No entanto recentemente foram descritas participações de células B-1 nas hipersensibilidades tardia e imediata. O presente trabalho verificou o papel de células B-1 na rejeição aguda de aloenxertos no camundongo, um processo orquestrado por células T. Para tal, foram transplantados coração e pele alogênicos para camundongos selvagens e camundongos deficientes em células B-1. A cinética de rejeição, as células infiltrantes no enxerto e a migração de células B-1 foram analisadas. Foi observado um atraso na cinética de rejeição do camundongo deficiente em células B-1, quando comparado com o camundongo selvagem. A transferência adotiva de células B-1 eliminou tal atraso. A sobrevida estendida do enxerto foi concomitante com menos células T CD8+ e mais mastócitos infiltrantes no enxerto. Células B-1 foram encontradas infiltrando o enxerto poucos dias após os transplantes. Os resultados deste trabalho mostram que há uma participação de células B-1 na rejeição aguda de aloenxertos e colaboram para o entendimento da biologia dessas células. / B-1 B cells are important producers of natural antibodies in mice and humans and, therefore, are considered as the first line of defense against pathogens. Because of that, their role in T-cell mediated immune responses is commonly underrated. However, recent studies have described the participation of B-1 cells in immediate and delayed-type hypersensitivity. The present work assessed the role of B-1 cells in the rejection of allografts in mice, an immune reaction mainly orchestrated by T cells. We have transplanted allogeneic skin and heart to wild-type and B-1 cell-deficient mice, and followed rejection kinetics. Skin graft-infiltrating cells were analyzed by flow cytometry. We observed a delay in rejection kinetics of B-1 cell-deficient mice when compared to wild-type mice. Adoptive transfer of B-1 cells into B-1 cell-deficient mice abrogated this delay. The longer survival observed in the absence of B-1 cells correlated with less CD8+ T cells infiltrating the grafts, as well as with more mast cells. Collectively, our results show the participation of B-1 cells in the allograft rejection process in mice, thus collaborating to the understanding of B- 1 cell biology. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-10-31 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Evidências indicam que tumores necessitam constante influxo de células mielo- monocíticas para sustentar seu comportamento maligno. Esse fato é devido a fatores derivados do tumor, os quais recrutam e induzem diferenciação funcional de células mielo-monocíticas, das quais a maioria são macrófagos. Embora os precursores clássicos de macrófagos sejam linhagens mielóides, linhagens linfóides como células B-1, subtipo de linfócitos B encontrados predominantemente nas cavidades pleural e peritoneal são também capazes de migrar para focos inflamatórios e se diferenciar em fagócitos mononucleares apresentando fenótipo semelhante ao dos macrófagos. No presente trabalho foi avaliada a interação entre células B16 de melanoma murino e células B-1 durante o co-cultivo e se esta interação influencia ativação de vias de transdução de sinal envolvidas com progressão e metástases. Utilizando sistema de co-cultura in vitro, foi mostrado que células B16 e células B-1 interagem fisicamente após 48 horas de co-cultura. Além disso, esta interação resulta em aumento da expressão de genes associados com metástases como MMP-9 e CXCR4 nas células B16 que favorecem o aumento na capacidade metastática destas células, como revelado por ensaios experimentais de metástases in vivo. Este trabalho também revela evidências de que células B16 apresentam marcado aumento na fosforilação da quinase regulada por sinais extracelulares (ERK) após contato com células B-1. A inibição da fosforilação de ERK com inibidor farmacológico da quinase ascendente de ERK, MEK1/2, suprime fortemente a expressão de MMP-9 e CXCR4 e inibe o aumento da capacidade metastática das células B16 induzido por contato com xxi células B-1. Adicionalmente, níveis constitutivos de ERK fosforilado nas células B- 1 são necessários para que estas células sejam capazes de induzir aumento no potencial metastático das células B16. Nossos resultados em conjunto mostram que células B-1 podem contribuir na aquisição de um fenótipo mais agressivo das células tumorais. / Increasing evidence indicates that tumors require a constant influx of myelomonocytic cells to support their malignant behavior. This is caused by tumor- derived factors, which recruit and induce functional differentiation of myelomonocytic cells, most of which are macrophages. Although myeloid lineages are the classical precursors of macrophages, B lymphoid lineages such as B-1 cells, a subset of B lymphocytes found predominantly in pleural and peritoneal cavities, are also able to migrate to inflammatory sites and differentiate into mononuclear phagocytes exhibiting macrophage-like phenotype. Here we examined the interplay of B-1 cells and tumor cells and checked whether this interaction provides signals to influence melanoma cells metastases. Using in vitro coculture experiments we showed that B16, a murine melanoma cell line, and B-1 cells physically interact. Moreover, interaction of B16 with B-1 cells leads to upregulation of metastasis-related genes expression (MMP-9 and CXCR-4), increasing its metastatic potential, as revealed by experimental metastases assays in vivo. We also provide evidences that B16 cells exhibit markedly upregulated phosphorylation of the extracellular signalregulated kinase (ERK) when co-cultured with B-1 cells. Inhibition of ERK phosphorylation induced by B-1 cells with an inhibitor of MEK1/2 strongly suppressed the induction of MMP-9 and CXCR-4 mRNA expression and impaired the increased metastatic behavior of B16. In addition, constitutive levels of ERK1/2 phosphorylation in B-1 cells are necessary for their commitment to affect the metastatic potential of B16 cells. Our findings show for the first time, that B-1 80 lymphocytes can contribute to tumor cell properties required for invasiveness during metastatic spread. / FAPESP: 03/05176-8 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-04-27T12:29:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 monica_chino_ioc_mest_2015.pdf: 4396839 bytes, checksum: 5ab00e786722dcd7034e91ef02840bd9 (MD5) 1_monica_chino_ioc_mest_2015.pdf: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A febre maculosa (Fm) é um grave problema de saúde pública no Brasil e no mundo, apresentando a bactéria Gram- negativa, Rickettsia ricketsii, como seu agente etiológico e transmitida pelo carrapato. Esse patógeno possui em sua superfície um conjunto de proteínas de membranas externas (OMP), sendo a OMP-A, um dos antígenos imunodominantes e exclusiva do grupo da Fm. Portanto, devido a inexistência de testes sorológicos sensíveis e específicos para o diagnóstico da Fm tivemos como objetivo mapear imunologicamente a OMP H6PGA4 usando uma biblioteca de peptídeos e soro de pacientes e cães com a doença e desenvolver testes diagnosticos mais específicos. Uma biblioteca de 84 peptideos com 15 residuos de comprimento cobrindo a extensão de 429 aminoácidos da proteína H6PGA4 e contendo sequências sobrepostas de nove aminoácidos foram sintetizadas pela técnica F-moc. Os peptídeos foram ligados quimicamente a uma membrana celulósica e feitos reagir independentemente com um \201Cpool\201D de soro de pacientes com febre maculosa (SP-Fm) e de soro de cães com febre maculosa (SC-Fm). Oito epitopos IgG foram identificados pelo soro de pacientes e três epitopos IgG pelo SC-Fm Todos os peptídeos foram análisados individualmente por ELISA-peptideo contra um painel de SP-Fm e SC-Fm. A análise realizada através da curva ROC indicou que os peptídeos E4 e E5 foram os mais imunogênicos com SP-Fm (especificidade de 90% e sensibilidade de 94%). Diferentemente os peptídeos E7 e E9 foram os que apresentaram especificidade e sensibilidade (p<0,05) acima de 90% e 94% com SC-Fm, repectivamente. Alternativamente, foi desenvolvido um imunosensor para diagnóstico da doença humana, baseado no peptídeo OMP3 e análise por voltametria cíclica. A acurácia foi demonstrada pela análise de 20 ciclos de varredura e a especificidade contra soros de indivíduos saudáveis. O chip imunosensor-peptideo foi reprodutível com um coeficiente de variação \226410,1% para SP-Fm. A sensibilidade de diluição do soro foi de até 1: 100 / Rocky Mountain spotted fever (Fm) is a serious public health problem in Brazil and in the world, presenting the Gram- negative bacteria, Rickettsia ricketsii, as its etiologic agent and transmitted by the bite of an infected tick. This pathogen has on its surface a set of outer membrane proteins (OMP), being the OMP-A one of the immunodominant and exclusive antigen of the Fm group. Therefore, due to the lack of sensitivity and specificity of the serologic tests for the diagnosis of Fm our objective was to map the immunologically OMP H6PGA4_ RICRI using a peptide library and serum of patients and dogs with the disease and develop more specific diagnostic tests. A library of 84 peptides with 15 residues in length covering the extension of 429 amino acids of the H6PGA4 protein and containing overlapping sequences of nine amino acids were synthesized by F-moc technique. The peptides were chemically bound to a cellulose membrane and reacted independently with serum from patients (n=5) with spotted fever (SP-Fm) and serum from dogs (n=5) with spotted fever (SC-Fm). Eight IgG epitopes were identified by the SP-Fm and three by the SC-Fm. All peptides were individually analyzed by ELISA-peptide using a panel of SP-Fm and SC-Fm The analysis of ROC curve indicated that the E4 and E5 peptides were the most immunogenic with a specificity of 90% and sensitivity of 94% for the SP-Fm. Unlike the E7 and E9 peptides were the most reactive for SC-Fm with a specificity of 90% and sensitivity of 94% (p <0.05). Alternatively, it was developed a cyclic voltametry E3 based immunesensor for the diagnosis of the human disease. The accuracy was demonstrated by the analysis of 20 cycles of scanning and the specificity against sera of healthy individuals. The peptide-imunosensor chip was reproducible with a coefficient of variation \2264 10,1% for SP-Fm. The sensitivity of serum dilution was 1: 100 / 2100-12-31

Resumo não disponível.

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A imunodeficiência comum variável (CVID) é caracterizada por hipogamaglobulinemia. Anteriormente identificou-se uma paciente com CVID que apresenta nível aumentado de estresse de retículo endoplasmático (ER), secundário a desregulação da via UPR. No presente trabalho, estendemos esta análise para outros pacientes e avaliamos o perfil de maturação de seus linfócitos B. Métodos: Western-blot, RT-PCR, Q-PCR, Citometria de Fluxo e cultura de células B ex vivo e imortalizadas. Resultados: A análise de 16 pacientes com CVID e 9 indivíduos saudáveis revelou três pacientes com porcentagens aumentadas de linfócitos B imaturos no sangue periférico. A análise da expressão de RNAm para BiP e XBP-1 em linfócitos B destes pacientes, após estímulo com LPS in vitro, identificou que os linfócitos B de um deles apresenta estresse de RE. Conclusão: Identificamos um subgrupo de pacientes com CVID que apresentam linfócitos B imaturos no sangue periférico. Um membro deste subgrupo apresenta estresse aumentado de ER. / Common Variable Immunodeficiency (CVID) is characterized by hypogammaglobulinemia. Previously a CVID patient was identified with increased levels of Endoplasmic Reticulum (ER) stress due to dysregulation of the UPR. In the present study these analyses were performed in other patients and healthy donors. Maturation markers of B lymphocytes were also characterized in these individuals. Methods: Western-blot, RT-PCR, Q-PCR, Flow cytometry and culturing of ex vivo and immortalized B cells. Results: The analysis of 16 CVID patients and 9 healthy donors revealed three patients that present higher percentage of immature B cells in peripheral blood. Analysis of expression of BiP and XBP1 induced by LPS treatment of B lymphocytes from these patients revealed that one patient present increased levels of ER stress.