Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Las periodontitis son un conjunto de patologías inflamatorias crónicas que se desencadenan en respuesta a la disbiosis polimicrobiana generada por bacterias periodonto-patógenas residentes en la bio-película sub-gingival. En este contexto, la formación de un denso infiltrado inmuno-inflamatorio en los tejidos periodontales, compuesto por una amplia variedad de leucocitos, citoquinas, quimioquinas proinflamatorias y factores ósteo-destructivos, resulta en la destrucción de los tejidos de soporte de los dientes. El receptor de quimioquinas homeostático CCR7 y sus ligandos desempeñan un rol clave en la migración de linfocitos y células dendríticas hacia los órganos linfoides secundarios, regulando el proceso de presentación antigénica. En otras enfermedades inflamatorias crónicas, se ha demostrado que la expresión ectópica de CCR7 altera la ubicación de los infiltrados de células inmunitarias, promoviendo la migración, activación y diferenciación de células naïve en la periferia, induciendo la formación de agregados linfoides ectópicos. Sin embargo, el rol de CCR7 en etiopatogenia de la periodontitis no ha sido aun completamente dilucidado. El objetivo de este estudio fue establecer la frecuencia de linfocitos T CD4+CCR7+ infiltrantes en tejidos periodontales de pacientes afectados de periodontitis crónica y sujetos sanos. A partir de biopsias gingivales obtenidas de pacientes afectados de periodontitis y sujetos sanos, se obtuvieron células totales en suspensión mediante digestión enzimática. La expresión de los marcadores CD4, CD25α, CD45RA, CD45RO, RORC2, Foxp3, T-bet y CCR7 fue analizada mediante citometría de flujo. Además, los marcadores CD4 y CCR7 fueron inmunolocalizados en los tejidos periodontales mediante inmuno-fluorescencia. Se detectó un mayor porcentaje de linfocitos T CD4+CD25α-CD45RA+CCR7+ (naïve), CD4+CD25α-CD45RO+CCR7 (memoria) y CD4+CD25+RORC2+CCR7 (Th17) en pacientes afectados de periodontitis en comparación con los sujetos sanos. En conclusión, existe un aumento en la frecuencia de linfocitos T naïve, de memoria y Th17 CCR7+ en los tejidos periodontales de sujetos afectados de periodontitis, lo que sugiere el posible rol quimiotáctico de CCR7 en la formación del infiltrado inflamatorio y de agrupaciones linfoides ectópicas durante la periodontitis. / Adscrito a Proyecto de FONDECYT regular 1140904.

Tesis Magister en Ciencias Odontológicas con Mención en Periodontologia / Las periodontitis son un conjunto de enfermedades de naturaleza inflamatoria y etiología infecciosa cuya causa es la biopelícula subgingival. Esta biopelícula está conformada por una amplia variedad de bacterias Gram-negativas anaerobias, entre ellas, Porphyromonas gingivalis y Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Sobre la base de la antigenicidad de la cápsula de P. gingivalis y del lipopolisacárido de A. actinomycetemcomitans se describen distintos serotipos bacterianos y se ha demostrado que entre estos distintos serotipos existe una potencialidad inmunogénica distinta en los linfocitos TCD4+. En particular, ante los serotipos K1 o K2 de P. gingivalis o el serotipo b de A. actinomycetemcomitans se describe un patrón de respuesta predominantemente tipo Th1 y Th17. En este estudio, linfocitos TCD4+ naïve humanos fueron activados por células dendríticas autólogas estimuladas con los serotipos K1-K6 de P. gingivalis o a-c de A. actinomycetemcomitans. Ante los serotipos K1 o K2 de P. gingivalis se detectaron mayores niveles de expresión de los factores de transcripción T-bet (Th1) y RORC2 (Th17), de secreción de RANKL y de diferenciación de osteoclastos TRAP+ en comparación a los otros serotipos bacterianos. Ante el serotipo b de A. actinomycetemcomitans se detectaron mayores niveles de expresión de T-bet y RORC2 y de secreción de RANKL en comparación a los serotipos a o c. Además, se analizó la frecuencia de proliferación de linfocitos TCD4+ de memoria obtenidos de pacientes con periodontitis y se detectó mayor respuesta ante los serotipos K1 o K2 de P. gingivalis o b de A. actinomycetemcomitans. Estos resultados confirman que los serotipos K1 o K2 de P. gingivalis o b de A. actinomycetemcomitans inducen un patrón de respuesta inmune predominantemente tipo Th1 (pro-inflamatorio) y Th17 (osteo-destructivo). Este patrón de respuesta Th1/Th17 se asoció a un incremento en la diferenciación de osteoclastos TRAP+ mediada por la producción de mayores niveles de RANKL. Finalmente, la mayor frecuencia de proliferación de linfocitos T de memoria ante los serotipos K1 o K2 de P. gingivalis o b de A. actinomycetemcomitans permite especular su participación durante la patogenia de la periodontitis, reflejada por la inducción de memoria inmunológica antígeno-específica. En conclusión, se demuestran diferencias en la respuesta de los linfocitos TCD4+ ante los distintos serotipos de P. gingivalis o A. actinomycetemcomitans y una mayor asociación de los serotipos K1 o K2 de P. gingivalis o b de A. actinomycetemcomitans a los fenómenos celulares y moleculares que explican la reabsorción ósea característica de las periodontitis.

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Las enfermedades periodontales son un conjunto de patologías de etiología infecciosa y naturaleza inflamatoria que incluyen las gingivitis y periodontitis. Durante las periodontitis, si bien las bacterias que colonizan la bio-película subgingival pueden generar un daño directo al periodonto, es su interacción con el hospedero lo que provoca la formación del infiltrado inmuno-inflamatorio que lleva a la destrucción de los tejidos de soporte de los dientes y eventualmente a la pérdida de ellos. Durante la constitución de este infiltrado immuno-inflamatorio, los linfocitos T migran desde los linfonodos hacia los tejidos periodontales siguiendo la señalización de quimioquinas inflamatorias, las que aumentan localmente durante las periodontitis. En la última década, las quimioquinas homeostáticas han sido el foco de investigación de la patogénesis de varias enfermedades inflamatorias crónicas, tal como la artritis reumatoide y el síndrome de Sjögren, en las cuales participarían en la formación de estructuras linfoides ectópicas. La presencia de quimioquinas y citoquinas homeostáticas en estas agrupaciones linfoides lleva al incremento en la migración de células indiferenciadas hacia los tejidos inflamados, favoreciendo la presentación antigénica y diferenciación linfocitaria in situ, perpetuándose el proceso inflamatorio. En este trabajo de investigación se analizó la expresión de varias quimioquinas homeostáticas y sus receptores durante la periodontitis crónica. A partir de biopsias obtenidas de pacientes con periodontitis crónica e individuos sanos, se cuantificó mediante RT-qPCR la expresión de los mRNA de las quimioquinas CXCL12, CXCL13, CCL19 y CCL21, de los receptores CCR7, CXCR4 y CXCR5, y de la citoquina IL-7. Además, se cuantificó la secreción de CCL19, CCL21 y CXCL12 en el fluido gingival crevicular mediante ELISA. Finalmente, la expresión de CCR7 fue analizada usando Western Blot en homogeneizados tisulares. En las lesiones periodontales de pacientes con periodontitis crónica se expresaron mayores niveles de CCL19, CCL21, CXCL12, CCR7, CXCR4 y CXCR5 en comparación a los tejidos periodontales de individuos sanos, lo que contribuiría a explicar, al menos en parte, la cronicidad y sitioespecificidad de las periodontitis. / Adscrito a Proyecto de FONDECYT regular 1140904.

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Grado de Magister en Ciencias Biológicas. / El sistema nervioso y el sistema inmune se encuentran íntimamente relacionados comunicándose bidireccionalmente mediante citoquinas, neuropéptidos y neurotransmisores, como la dopamina. Este neurotransmisor ejerce su efecto a través de cinco receptores dopaminérgicos que poseen diferentes grados de afinidad, contando con la mayor afinidad el receptor 3 (D3R). Su presencia se ha reportado en diferentes células del sistema inmune. La estimulación del D3R promueve la producción de IFN-γ en linfocitos T CD4+, favoreciendo su diferenciación a un perfil Th1. Sin embargo, el rol de este receptor en los linfocitos T CD8+ aún no se ha estudiado a cabalidad. En esta tesis se estudió la incidencia del D3R en la formación del perfil citotóxico en linfocitos T CD8+, que poseen un TCR transgénico específico para el péptido OVA(257-264) alojado sobre el MHC de clase I H2-Kb (linfocitos OT-I). La diferenciación in vitro muestra que la carencia del D3R en linfocitos OT-I (OT-I D3RKO) resulta en una reducción significativa en la producción de IFN-γ, TNF-α, IL-2 y en la expresión de CD25 (cadena α del receptor de IL-2) en respuesta a la estimulación con péptido OVA(257-264). Estas deficiencias se revierten al añadir IL-2 exógena a los cultivos, sugiriendo que el mecanismo de acción por el cual el D3R favorece la diferenciación hacia un fenotipo efector productor de IFN-γ y TNF- α ocurre a través de la producción de IL-2. Concordante con lo anterior, se observó que la expresión del D3R en linfocitos OT-I promueve la expansión clonal y la protección antitumoral frente a melanoma. En conjunto los resultados obtenidos en linfocitos T CD8+ sugieren que el D3R promueve la formación de un perfil citotóxico, induciendo la producción de IFN-γ y favoreciendo una alta tasa de expansión clonal, lo que conlleva a una mayor sobrevida frente a un desafío tumoral. / The nervous system and the immune system are intimately related, communicating bi-directionally through cytokines, neuropeptides and neurotransmitters. Dopamine is a neurotransmitter that exerts its effect through five dopaminergic receptors which display different degrees of affinity. The D3R, which display the highest affinity for dopamine, has been found expressed in CD4+ T cells, where its stimulation promotes high production of IFN-γ, favoring the acquisition of the Th1 profile. However, the role of this receptor in CD8+ T lymphocytes has not yet been fully studied. In this thesis the role of D3R in the acquisition of the cytotoxic profile by CD8+ T lymphocytes was studied. For this purpose, in this thesis CD8+ T-cells bearing a transgenic TCR specific for the recognition of the OVA peptide(257-264) over the class I MHC H2-Kb (OT-I lymphocytes) were used. In vitro differentiation experiments show that lack of D3R in OT-I lymphocytes (OT-I D3RKO) results in a significant reduction in the production of IFN-γ, TNF-α and on the expression of CD25 (α chain of the IL-2 receptor) in response to the stimulation with OVA peptide(257-264). These effects were reversed by adding exogenous IL-2 into the cultures, suggesting a mechanism by which D3R favors the differentiation towards an effector phenotype through the production of IL-2. In vivo experiments show that D3R expressed on OT-I lymphocytes favors a higher clonal expansion and thereby an stronger protection against melanoma tumors. The results obtained suggest that D3R promotes the formation of a more efficient cytotoxic profile capable of producing higher percentages of IFN-γ and higher rates of clonal expansion, which leads to greater survival in the face of a tumor challenge. / Junio 2020

Tesis Magister en Ciencias Odontológicas con Mención en Periodontología / Las periodontitis son un conjunto de enfermedades de naturaleza inflamatoria y etiología infecciosa. La biopelícula patogénica subgingival, constituida principalmente por bacterias anaerobias Gram-negativas, es el factor etiológico responsable del inicio y progresión de las periodontitis. Esta biopelícula está compuesta por una amplia variedad de bacterias, entre ellas, Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Sobre la base de la antigenicidad del O-polisacárido componente del LPS, en A. actinomycetemcomitans se describen distintos serotipos bacterianos y se ha propuesto que entre ellos existe una virulencia y patogenicidad distinta. Las bacterias periodonto-patógenas son reconocidas por las células dendríticas periodontales. Una vez activadas, las células dendríticas expresan moléculas co-estimuladoras y liberan citoquinas pro-inflamatorias y quimioquinas, determinantes de la presentación antigénica a los linfocitos T. Durante esta presentación antigénica, las células dendríticas inducen la activación, proliferación y diferenciación selectiva de los linfocitos TCD4+ hacia los distintos fenotipos efectores, caracterizados por la expresión y secreción de un patrón específico de citoquinas que determina el tipo de respuesta inmune en el hospedero y, finalmente, el fenotipo clínico de las periodontitis. En este estudio, se evaluó la respuesta de células dendríticas estimuladas con los serotipos a, b o c de A. actinomycetemcomitans. Ante el serotipo b se detectaron mayores niveles de expresión y secreción de IL-1β, IL-12, IL-23, IFN-γ y TNF-α en comparación a las células dendríticas estimuladas con los serotipos a o c. Adicionalmente, se analizó la activación de los linfocitos TCD4+ naïve ante células dendríticas autólogas estimuladas con los serotipos a, b o c de A. actinomycetemcomitans y se cuantificaron los niveles de expresión de los factores de transcripción y de expresión y secreción de las citoquinas fenotipo-específicas. En los linfocitos TCD4+ naïve activados por células dendríticas estimuladas con el serotipo b de A. actinomycetemcomitans se detectaron mayores niveles de expresión de los factores de transcripción T-bet y RORC2 y de producción de las citoquinas IL-1β, IL-6, IL-12, IL-17, IL-23, IFN-γ, TNF-α y RANKL, característicos de un patrón de respuesta inmune tipo Th1 (pro-inflamatorio) y Th17 (osteo- destructivo), en comparación a las mismas células estimuladas con los serotipos a o c. En conjunto, estos datos permiten establecer un mayor potencial inmuno-estimulador del serotipo b de A. actinomycetemcomitans en las células dendríticas y linfocitos TCD4+ naïve. Los mayores niveles de secreción de citoquinas propias de un patrón de respuesta tipo Th1 y Th17 se correlacionaron positivamente con la expresión de T-bet y RORC2, factores de transcripción determinantes de los fenotipos linfocitarios Th1 y Th17, respectivamente. Estos resultados nos permiten especular una asociación entre la mayor frecuencia de detección del serotipo b en lesiones periodontales de pacientes con periodontitis y la mayor respuesta inducida en las células dendríticas y linfocitos TCD4+ naïve establecida en este estudio, con una mayor patogenicidad del microorganismo, en particular, con un fenotipo de enfermedad pro-inflamatorio y osteo-destructivo. / Financiamiento: Proyecto FONDECYT 11100298

Objetivo: Determinar la principal causa de mortalidad en pacientes con VIH/SIDA en el Hospital Guillermo Almenara Irigoyen. Materiales y Méto-dos: Se realizó un estudio observacional, descriptivo, retrospectivo, median-te la revisión manual de 38 historias clínicas de todos los pacientes fallecidos en el Hospital Nacional Guillermo Almenara Irigoyen con diagnóstico de infección por VIH/SIDA durante el periodo 2012-2014. Se incluyeron todos los pacientes fallecidos con VIH positivos y se recolectó datos como edad, género, estado civil, opción sexual, recuento CD4, cantidad de carga viral, estadio clínico, causa frecuente de muerte, tiempo de enfermedad, entre otros. Resultados: Se encontró que el porcentaje de fallecimientos durante el año 2012 el 1.44% (15 pacientes) falleció por VIH, en el 2013 fue el 1.27% (14 pacientes), mientras que en el 2014 sólo fue el 0.77% (9 pacientes); el 89.5% fueron hombres y el 10.5% mujeres, la edad promedio fue 47.2 años (45-59); las enfermedades infecciosas fueron la causa más frecuente de muerte con un 81.5% (31 pacientes); el recuento promedio de linfocitos T CD4 fue menor de 200 células/ ul, con una carga viral mínima de 999 copias. La presentación clínica fue de curso subagudo, asociadas a anemia severa y diarrea crónica. Entre los síntomas más frecuentes al ingreso fueron nauseas, vómitos, deposiciones liquidas, transtorno hidroelectrolítico, tos productiva, disnea, transtorno del sensorio, hipertensión endocraneana. El 62.5% (20 pacientes) recibía tratamiento antirretroviral y el 57% (22 pacientes) tenían un tiempo de enfermedad menor de 5 años. Conclusiones: Las enfermedades infecciosas fueron una de las principales causas de muerte en pacientes con VIH, las cuales tuvieron como punto de partida el abdominal y el respiratorio en mayor proporción.

Introducción: En la actual epidemia por VIH/SIDA que vivimos se está presentando un aumento del número de pacientes con enfermedad no definitoria de SIDA, sin embargo aún no se establecen las causas de este aumento, más aún estas enfermedades presentan un comportamiento distinto en cada cohorte de estudio. En nuestro país no se ha realizado un estudio que las evalúe como tal. Objetivo: Determinar las proporciones de enfermedades no definitorias de SIDA presentes en los pacientes infectados por el VIH del Hospital Edgardo Rebagliati Martins durante el año 2014. Diseño: Estudio observacional, exploratorio, retrospectivo, de corte transversal. Mediante un muestreo aleatorio sistemático se seleccionaron 137 pacientes infectados con VIH, de entre todos aquellos diagnosticados con infección por VIH. Se recolectó información de las fichas de registro y de las historias clínicas y se registraron en fichas electrónicas codificadas, luego, con la base de datos se utilizó Microsoft Excel 2013 para el análisis exploratorio de los datos. Resultados: Se encontraron 5 pacientes (3.65%) infectaos con enfermedad vascular periférica (EVP), 2 (3.65%) con ictus, 1 (0.73%) con cirrosis hepática, 1 (0.73%) con falla renal, 1 (0.73%) con linfoma de Hodgkin y 127 (92.7%) sin enfermedad (NE). Las medianas para los valores de CD4 más bajos fueron Ic: 294.5, EHC: 282, LH: 216, EVP: 178, ERC: 78 y NE: 143.5 cel/uL. De los pacientes con SIDA y enfermedad los pacientes con EHC fueron el 100%, ERC el 100%, HTA el 92.86%, EVP el 80%, NE el 77.17% respecto de sus pares con enfermedad. Conclusiones: Entre las enfermedades no definitorias de SIDA la enfermedad vascular periférica se determinó como la más frecuente, seguida luego de ictus. Comparativamente se encontró mayor presencia de enfermedad en pacientes con mayores niveles de CD4, sin embargo hubo mayor proporción de enfermedades en pacientes con SIDA. El estudio cumplió con su objetivo de estudiar las proporciones de enfermedad, además contribuye a la generación de hipótesis y señala sus limitaciones y sugerencias para futuros trabajos. / Introduction: In the actual HIV/AIDS epidemic we live, it is being presenting an increase of the number of patients with non-aids defining illnesses, however there are not yet stablished the causes of this increase, also, these diseases have a different presentation in each study cohort. In our country it has not been performed a study that evaluate these diseases as such. bjective: To determine the frecuencies of non-aids defining illnesses in HIV patients of the Edgardo Rebagliati Martins Hospital in the 2014 year. Design: Observational, exploratory, retrospective, transversal study. Throught ramdom systematic sampling it has been selected 137 HIV patients, among all HIV diagnosed patients. It has been collected information from registration cards and medical records of HIV patients. The information was registered in codified electronical cards, then, with the database it has been used Microsoft Excel 2013 for the exploratory analysis of data. Results: It has been found 5 patients(3.65%) with peripheral vascular disease (EVP), 2 (3.65%) with stroke, 1 (0.73%) with hepatic cirrhosis, 1 (0.73%) with kidney failure, 1 (0.73%) with Hodgkin lymphoma and 127 (92.7%) without disease(NE). The medians for the lowest CD4 values were: Ic: 294.5, EHC: 282, LH: 216, EVP: 178, ERC: 78 y NE: 143.5 cel/uL. The patients with AIDS and illness who had EHC were the 100%, ERC the 100%, EVP the 80%, NE the 77.17%, IC the 50% respect of its pairs with illness. Conclusions: Among non-aids defining illnesses the vascular peripheral disease was the most frequent, followed by stroke. It has been found, comparatively, a greater presence of disease in patients with higher CD4 cells levels, however, ther was more proportion of diseases in AIDS patients. The study acomplished its objective of study the diseases proportions, moreover it contributes to the generation of hypotheses and mentions its limitations and gives suggerences for future studies. Non-aids defining illnesses; CD4-Positive T-Lymphocytes; Anti-Retroviral Agents

Doctor en Ciencias Biomédicas / Melanoma es la neoplasia cutánea más agresiva, con una incidencia ascendente a pesar de numerosos esfuerzos de prevención. En la actualidad existen diversas estrategias de tratamiento, sin embargo, no todos los pacientes responden a ellas. En nuestro laboratorio se ha ensayado una inmunoterapia basada en células dendríticas (DCs) maduradas con un lisado de líneas celulares de melanoma (TRIMEL), que ha incrementado hasta 3 veces la sobrevida en pacientes que desarrollan una respuesta inmunológica de hipersensibilidad retardada (DTH+). Hasta la fecha no se han desarrollado avances en el estudio de la fracción no peptídica de este lisado ni de su capacidad de activar células iNKT, capaces de reconocer antígenos glicolipídicas en contexto CD1d. Hipótesis: Células iNKT infiltran tumores de pacientes con melanoma avanzado y son capaces de ser activadas in vitro por células dendríticas utilizadas en inmunoterapia antitumoral. Objetivo General: Determinar el rol en pacientes con melanoma de células iNKT infiltrantes de tumor y activadas por células dendríticas maduradas ex vivo utilizadas en inmunoterapia antimelanoma. Métodos: Se determinaron células iNKT infiltrantes de tumor mediante inmunofluorescencia y se correlacionó su presencia en lesiones de melanoma primario en todos los estadios según Breslow con la sobrevida de la enfermedad. Se evaluó la capacidad de las fracciones glicolipídica y proteica de TRIMEL para inducir maduración en células dendríticas. Para este fin, las fracciones se obtuvieron mediante gradiente de densidad con MTBE (Metil-terbutil-éter) y se usaron para estimular DCs generadas en base a rhIL-4 y GM-CSF. En estas condiciones se evaluó la presencia de diversas moléculas de superficie y la producción de citoquinas. Para evaluar la capacidad de estas DCs de activar células iNKT, desde PBMC se aisló la población CD3+ mediante cell-sorting y cultivadas con distintas DCs generadas. Se analizó la proliferación celular utilizando el ensayo CFSE. También se evaluó la presencia de células iNKT mediante inmunofluorescencia en tacos de parafina de las DTH realizadas a pacientes de inmunoterapia. Resultados: Encontramos infiltración por células iNKT en todos los estadíos de la enfermedad, siendo mayor en Breslow avanzados, sin una correlación con la sobrevida global. Al evaluar la maduración de DCs, esta fue mayor en el grupo estimulada con la fracción peptídica de TRIMEL. DCs estimuladas con la fracción glicolipídica de TRIMEL no mostraron diferencias con la condición no tratada. Al evaluar mediante ensayo de proliferación realizado con CFSE, se evidenció mayor proliferación en la condición tratada con la fracción peptídica. Finalmente, sólo en 1 de 3 pacientes en los que se analizó la presencia de iNKT en las DTH se encontraron estas células. Conclusiones: unificando todos los hallazgos discutidos previamente, células iNKT infiltran tumores de melanoma, las que podrían ser inducidas a proliferar por DCs estimuladas con la fracción peptídica de TRIMEL y de esa forma migrar a sitios inflamados como representan las lesiones DTH. / Melanoma is the most aggressive skin tumor, with a growing incidence worldwide, despite of prevention strategies. Nowadays, there are several new therapies to treat it, however the overall survival continues to be low. Our lab has been studying a Dendritic Cell (DC) based immunotherapy maturated with a melanoma cell lines lysate (TRIMEL), which has increased survival up to 3 times in patients that developed a delayed type hypersensitivity response (DTH+). To this date no studies have been made regarding the non peptidic fraction of this lysate or its capability to activate a subpopulation of T Cells called iNKT cells, characterized by their ability to recognize glycolipids in a CD1d manner. Hypothesis: iNKT Cells infiltrate melanoma patient’s tumors and are capable to be activated in vitro by Dendritic cells Main Objective: To determinate the role of tumor infiltrating iNKT cells activated by matured Dendritic Cells ex vivo used in antimelanoma immunotherapy in melanoma patients Methods: The presence of tumor infiltrating iNKT Cells in primary melanoma in all of Breslow stages was evaluated by expression of TCR Vα24Jα18 by Immunofluorescence microscopy. To evaluate the capability of glycolipid and peptidic TRIMEL fraction to induce DCs maturation, they were isolated from TRIMEL using a MTBE (Metil-terbutil-ether) density gradient. Afterwards, these fractions were used to stimulate DCs generated with a rhIL-4 and GM-CSF protocol and surface molecules expression were assessed, as well as cytokine secretion. To evaluate DCs effectiveness to activate iNKT Cells’ proliferation, CD3+ population was isolated from Buffy Coats using cell-sorting technology and they were cultured with DCs. Proliferation was accessed with CFSE dye assay. Finally, DTH infiltrating iNKT cells were asessed in paraffined embedded samples by immunofluorescence microscopy. Results: We found that iNKT cells infiltrated melanoma tumors in every Breslow stage, with higher infiltration on advanced stages,with no correlation with overall survival. The peptidic fraction of TRIMEL induced higher expression of maturation related surface molecules in addition to cytokine secretion, whereas glycolipidic fraction showed no difference with the untreated condition. iNKT cell had a higher proliferation rate when cultured with DCs treated with the peptidic fraction of TRIMEL. And finally, we found the infiltration of iNKT in 1 of the 3 patients DTH. Conclusions: Taking together all the previous results, iNKT cells infiltrate melanoma Tumors, and they could be induced to proliferate by DCs stimulated with the peptidic fraction of TRIMEL and as well supporting their migration to inflamed tissues like the DTH samples. / 2021

Grado de doctor en ciencias biomédicas. / La Esclerosis Múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune y crónica que afecta al sistema nervioso central (SNC), caracterizada por una pérdida de la de tolerancia inmunológica, que incluye la inactivación funcional de los linfocitos T reguladores (Tregs). Estudios recientes han descrito diversos mecanismos por los cuales el Interferón (IFN)- γ, una citoquina conocida clásicamente como inflamatoria, posee efectos reguladores y protectores en el modelo animal de la EM, la Encefalomielitis Autoinmune Experimental (EAE). Resultados previos de nuestro laboratorio han mostrado que el tratamiento in vivo con IFN-γ en la fase crónica de la EAE induce una mejoría significativa de los síntomas, asociado con un aumento significativo de linfocitos Tregs en el SNC de los animales. En esta tesis, se investigó los mecanismos por los cuales IFN-γ induce dicho aumento de linfocitos Tregs supresores de la EAE. Los resultados obtenidos mostraron que la depleción de células expresando FOXP3 antagonizó los efectos protectores de IFN-γ, corroborando que el efecto terapéutico de esta citoquina es dependiente de los linfocitos Tregs. Ensayos realizados in vitro con linfocitos T CD4+CD25- provenientes de ratones con EAE, revelaron que IFN-γ no ejerce un efecto directo sobre la inducción ni funcionalidad de linfocitos Tregs. Además, se determinó que IFN-γ inhibe la expresión de FOXP3+ en condiciones de diferenciación de linfocitos Tregs inducibles (TGF-b + IL-2). Tampoco se observó un efecto directo de IFN- γ sobre la expresión de moléculas reguladoras, expresión de FOXP3+ o funcionalidad de linfocitos Tregs obtenidos de ratones con EAE. La administración in vivo conjunta de IFN-γ y anticuerpos neutralizantes contra IL-10, TGF-b o PD-1, mostró que el efecto terapéutico de IFN-γ en la fase crónica de la EAE depende de TGF-b y de la vía PD-1/PD-Ls, pero no así de IL-10. Análisis de la expresión de moléculas regulatorias en diferentes subpoblaciones celulares provenientes de ratones con EAE, determinó que IFN-γ indujo un incremento en la expresión de TGF-b y PD-L1 en diferentes subgrupos de células CD11b+ (células presentadoras de antígeno) y de TGF-b en linfocitos T CD8+. Además, se encontró que células CD11b+ estimuladas 9 con IFN-γ in vivo o in vitro son capaces de inducir, de manera dependiente de TGF-b y PD-L1, un aumento en la frecuencia de linfocitos Tregs a partir de linfocitos T CD4+ naïve provenientes de animales sanos (sin EAE) wild type o 2D2 (expresando un TCR específico para el péptido de mielina). En resumen, el conjunto de los resultados obtenidos en esta tesis revela que los efectos benéficos de IFN-γ en la fase crónica de la EAE se deben a un aumento de linfocitos Tregs en el SNC mediado por la expresión de FOXP3, TGF-b y la vía PD-1/PD-Ls, y asociado a un aumento en la expresión de TGF-b y PD-L1 en células CD11b+ y de TGFb en linfocitos T CD8+. / Multiple sclerosis (MS) is a chronic autoimmune disease affecting the central nervous system (CNS), characterized by a lost of immune tolerance, that includes a functional inactivation of regulatory T lymphocytes (Tregs). Recent studies have described different mechanisms by which Interferon (IFN)-γ, known classically as a proinflammatory cytokine, has regulatory and protective effects in the animal model of MS, the Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE). Previous results of our laboratory have shown that in vivo treatment with IFN-γ during the chronic phase of EAE induced a significant amelioration of symptoms, associated with a significant increase of Tregs lymphocytes in the SNC of these mice. In this thesis, the mechanisms by which IFN-γ induced the increase of Tregs suppressing EAE was investigated. The results obtained shown that depletion of cells expressing FOXP3 suppressed the protective effects of IFN-γ, supporting the notion that the therapeutic effect of this cytokine is Tregs-dependent. Assays performed in vitro with T CD4+CD25- lymphocytes obtained from EAE mice revealed that IFN-γ did not exert a direct effect on the induction or functionality of Tregs. In addition, IFN-γ inhibited FOXP3 expression in conditions of iTregs differentiation (TGF-b + IL-2). Likewise, IFN-γ did not affect the expression of regulatory molecules, FOXP3 expression, or functionality of Tregs obtained from EAE mice. The in vivo combined administration of IFN-γ and neutralizing antibodies against IL-10, TGF-b or PD-1, showed that the protective effect of IFN-γ in the chronic phase of EAE depends of TGF-b or PD-1/PD-Ls pathway, but not on IL-10. Analysis of regulatory molecules expression in different cell subpopulations obtained from EAE mice determined that IFN-γ induced an increased expression of TGF-b and PD-L1 on different subgroups of CD11b+ cells (antigen presenting cells) and TGF-b on CD8+ T cells. In addition, it was found that in vivo and in vitro IFN-γ–stimulated CD11b+ cells were able to induce, in a TGF-b and PD-L1-dependent manner, an increase of Tregs frequency starting from naïve T CD4+ cells obtained from healthy (without EAE) wild type or 2D2 (expressing a specific TCR for myelin peptide)) mice. Overall, all results obtained in this thesis reveal that the beneficial effects of IFN-γ in the chronic phase of EAE are related with an increase of Tregs in the SNC mediated by the expression of FOXP3, TGF-b and PD-1/PD-Ls pathway, and associated with an enhance in the expression of TGF-b and PD-L1on CD11b+ cells and TGF-b on T CD8+ cells.

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Introducción: Existen lesiones bucomáxilofaciales que se relacionan con la infección por VIH/SIDA. La asociación de éstas con estados específicos de inmunosupresión a través de su recuento de linfocitos TCD4 tiene gran valor en el proceso diagnóstico, monitorización de progresión y evaluación de terapia en estos pacientes. Material y Métodos: Se realizó un estudio observacional analítico de corte transversal reuniendo una muestra de pacientes del Servicio de Cirugía Máxilofacial del Hospital San Juan de Dios. Se realizó un examen clínico donde se diagnosticaron lesiones bucomáxilofaciales asociadas a VIH/SIDA. Se examinó el recuento de linfocitos TCD4 de estos pacientes, realizado por el Servicio de Infectología del hospital. Se correlacionó la presencia de lesiones con el resultado del examen, categorizado según la clasificación del Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Se utilizó el test de Chi2 de Pearson para encontrar asociación entre las variables y se determinó la magnitud del efecto de las variables independientes sobre la variable de resultado. Se determinaron las razones de prevalencia (RP) mediante modelo de regresión de Poisson robusta. Resultados: Se analizó una muestra de 79 pacientes adultos. De estos pacientes, el 83,54% fueron hombres y 16,46% fueron mujeres. El 21,52% de los pacientes tuvo un recuento de linfocitos TCD4 ≥500 células/mm3 de sangre, un 49,37% tuvo un recuento dentro del rango de 499-200 células/mm3 y un 29,11% tenía <200 células/mm3. El 70,89% de los pacientes no presentó lesiones asociadas a VIH/SIDA. El 29,11% restante presentó lesiones. Se estableció una asociación entre presencia de lesiones bucomáxilofaciales y recuento de linfocitos TCD4 (p=0,009). La RP de presentar una lesión en pacientes con un recuento de linfocitos TCD4 de 499-200 células/mm3 unidades respecto a ≥500 células/mm3 es 0,52 (IC 95% 0,18-1,49) mientras que en los pacientes de <200 células/mm3 respecto a ≥500 células/mm3 es 1,77 (IC 95% 0,77-4,11). Conclusiones: Existe una relación estadísticamente significativa entre el recuento de Linfocitos TCD4 y la presencia de lesiones bucomáxilofaciales asociadas a la infección por VIH/SIDA. Existe un mayor riesgo de presentar lesiones asociadas a la infección por VIH/SIDA en pacientes con un recuento de linfocitos TCD4 <200 células/mm3 de sangre. / Adscrito a proyecto PRIO-ODO 14/003