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Estudio del rol de conexina 43 en la sinapsis inmunológica citolítica entre linfocitos t citotóxicos y células de melanoma

Hoffmann Vega, Francisca Alejandra 08 1900 (has links)
Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniera en Biotecnología Molecular. / El desarrollo de una respuesta inmune anti-tumoral requiere de la comunicación entre diferentes células del sistema inmune, así como del reconocimiento de la célula tumoral. Una vez que los Linfocitos T Citotóxicos (CTL) y las células Natural Killers (NK) reconocen la célula tumoral, forman la Sinapsis Inmunológica Citotóxica (SIC), una estructura supramolecular altamente especializada que resulta fundamental para la liberación localizada de los gránulos citotóxicos y la eliminación específica de la célula tumoral. Recientemente, se ha descrito la participación de canales Gap Junction (GJ) formados por la isoforma Cx43 (GJ-Cx43) en la actividad citotóxica de las células NK durante la SIC. A pesar de las similitudes funcionales y estructurales presentadas por la SIC mediada por las células NK y por CTL, la participación de los canales GJ-Cx43 en la sinapsis mediada por CTL aún no ha sido determinada. En este trabajo se estudió el rol de los canales GJ-Cx43 en la actividad de la SIC entre CTL obtenidos desde ratones pMEL-1 y células de melanoma murino B16F10. Primero, se evaluó la polarización de Cx43 hacia la zona de contacto entre CTL pMEL-1 y células B16F10, durante la SIC. Se determinó que Cx43 se acumula en el sitio de contacto entre estas células de manera antígeno específica y que esta polarización es dependiente de la activación de los CTL. Luego, se disminuyó la expresión de Cx43 en células B16F10 utilizando un RNA interferente contra Cx43 y luego se evaluó la participación de Cx43 en la formación de canales GJ mediante ensayos de transferencia de calceína y en la actividad citotóxica de los CTL, mediante ensayos de actividad de Granzima B (GrzB). Se observó que los CTL transfieren calceína a las células B16F10 formando canales GJ funcionales, al contrario de cuando se utilizan LT CD8+ vírgenes como células efectoras. Además, cuando se utilizaron las células B16F10 que expresan bajos niveles de Cx43 como células blanco, se observó una disminución en la transferencia de calceína y en la actividad de GrzB en comparación al control. Nuestros resultados demuestran que durante el reconocimiento citotóxico se forman canales GJ-Cx43 entre CTL y células B16F10 y que la formación de estos canales durante la SIC son importantes para la eliminación de células tumorales mediada por CTL. / Development of antitumor immune responses requires communication between different immune cells, and specific immune recognition of tumor cells. Upon tumor cell recognition, CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer (NK) cells form the “Cytotoxic Immunological Synapse (SIC)”, a specialized molecular structure fundamental for the polarized delivery of cytotoxic granules and the specific tumor cell killing. Recently, it has been described the participation of Gap Junction Intercellular Communications formed by Connexin 43 (GJIC-Cx43) in the NK cell SIC activity. Despite that CTL and NK cells present functional and structural similarities in SIC formation, the participation of GJIC-Cx43 in CTL-mediated SIC remains unclear. In this work we studied the role of GJIC-Cx43 in the activity of SIC formed between CTL from pMEL-1 mice and B16F10 murine melanoma cells. First, we evaluated by immunofluorescence the polarization of Cx43 to contact site between CTL and B16F10 during SIC. We found that this protein localizes at the contact site of SIC and this polarization dependent on activation of CTL and is an antigenic-specific process. Then, we decrease Cx43 expression in B16F10 cells using interference RNA against Cx43 and we evaluated the participation of Cx43 in the formation of functional GJ channels by calcein transfer assay and in the cytotoxic activity of CTL by Granzyme B (GrzB) activity assay. We found that CTL transfer calcein to B16F10 forming functional GJ in contrast with when we used a naïve CD8+ T cells as an effector cells. In addition, when we used a B16F10 that express low levels of Cx43 as target cells, we observed a decrease in calcein transfer and GrzB activity in comparison to the control. Our results demonstrate that GJIC-Cx43 are formed between CTL and B16F10 during SIC, and suggest that their formation is important for tumor cells-killing by CTL
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Células T γδ intraepiteliales intestinales y su influencia en la homeostasis intestinal: Estudio de la producción de CCL4 y flujos de calcio intracelular a través de la activación del complejo TCR γδ

Malinarich González, Frano Hernán January 2010 (has links)
No description available.
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Estudio de la participación de gap junctions en la activación de linfocitos T CD8+ mediante la validación del modelo Murino pMEL-1

Navarrete Sánchez, Mariela Ivonne 03 1900 (has links)
Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular / Las Gap Junctions (GJs) son clústers de canales intercelulares localizados en la membrana plasmática que permiten la comunicación directa entre células adyacentes. Cada canal GJ está compuesto por 2 hemicanales hexaméricos conocidos como conexones, los cuales a su vez están compuestos por seis proteínas de transmembrana llamadas conexinas (Cxs), siendo Cx43 la más representada en el sistema inmune. Se ha vinculado la variación de los niveles normales de expresión de las Cxs con la patogénesis de distintas enfermedades, incluyendo sordera congénita, arritmias cardiacas y cáncer. Dentro de esta última nuestro laboratorio ha desarrollado proyectos de investigación que permitan determinar el papel de las GJs en la respuesta inmune antitumoral. Por ejemplo, publicaciones previas de nuestro laboratorio han demostrado que Cx43 participa en la transferencia directa de antígenos tumorales entre células dendríticas (DCs). Así mismo, Cx43 polariza hacia la sinapsis entre DC y linfocitos T (LT) CD4+, formando canales funcionales que permiten una comunicación bidireccional requerida para la activación de LT mediada por APC. Además, se ha encontrado que Cx43 juega un rol en la activación de células natural killer (NK) por parte de DCs y en la regulación de la citotoxicidad de las células NK contra células tumorales. Así mismo, resultados no publicados indican que Cx43 polariza hacia el sitio de contacto entre LT CD8+ citotóxicos (CTLs) y células de melanoma, sugiriendo que Cx43 participaría en la citotoxicidad de CTLs en contra de éstas. Estos antecedentes sugieren que las GJs podría participar en el transporte de moléculas o señales que se encuentren involucradas en el proceso de activación de LT CD8+ mediada por DCs, tema que aún no ha sido estudiado por las investigaciones actuales. En estudios 2 anteriores nuestro laboratorio ha trabajado con modelos celulares humanos, sin embargo, dado que la obtención de LT vírgenes específicos contra el tumor a partir de donantes sanos es improbable y engorroso, en este trabajo decidimos utilizar el modelo murino específico para melanoma pMEL-1 y validar y optimizar su utilización para estudios de la participación de las GJs en la activación de LT CD8+ por parte de DCs. Nuestros resultados indican que el modelo pMEL-1 no representa alteraciones en la expresión de Cx43 respecto a su contraparte silvestre (wild type (WT)), y que es un modelo muy sensible, encontrando expresión del marcador de activación CD69 incluso desde 1 hora post co-cultivo. Además, se determinó que existe transferencia de calceína entre moDC y LT CD8+ pMEL-1 en un contexto estrictamente antígeno específico. Sin embargo, no pudimos dilucidar si las GJs participan del proceso de activación ya que el método de inhibición utilizado, el cual es un péptido mimético de Cx43, presentó problemas técnicos de funcionamiento, fenómeno que fue comprobado en modelos donde anteriormente se había determinado la comunicación mediada por GJs. Proponemos en el futuro utilizar otros métodos de inhibición, como el uso de siRNA contra Cx43, para determinar si estos canales juegan un rol en este proceso. / Gap Junctions are clusters of intercellular channels located in the plasma membrane that allow direct communication between adjacent cells. Each GJ channel is composed of 2 hexameric hemichannels known as connexions, which are composed by six transmembrane proteins called conexins (Cxs), being Cx43 the most represented one in the inmmune system. Variation in normal expression levels on Cxs have been linked to the development of different diseases, including congenital deafness, cardiac arrhythmias and cancer, being the last the one where our laboratory has developed investigation lines that allow to determine the role of GJs in the antitumoral response. In example, previous publications of our group have demonstrated that Cx43 participates in the direct transfer of tumoral antigens between dendritic cells (DCs) and that polarizes to the synapsis between DCs and CD4+ T lymphocytes, forming functional channels that allow bidirectional communication required for the DCs mediated activation of LT. Besides this, we have found that Cx43 plays a role in the activation of natural killer (NK) cells mediated by DCs, and in the regulation of the cytotoxicity of NK cells against tumor cells. Likewise, unpublished data indicate that Cx43 polarizes to the contact site between cytotoxic CD8+ T cells (CTLs) and melanoma cells, suggesting that Cx43 participates in the cytotoxicity of these cells. These backgrounds suggest that GJs may participate in the transport of molecules or signals that may be involved in the process of DC mediated activation of CD8+ T cells, subject that hasn’t been studied by the actual investigations. In previous studies our group has worked with human cellular models, however, given that obtaining naïve T cells from healthy donors is unlikely and difficult, in this work we decided to use the melanoma specific murine model pMEL-1 and valid and optimize it’s use for studies of the participation of GJs in the DCs 4 activation of T cells. Our results indicate that the pMEL-1 model doesn’t have alterations in the Cx43 expression levels compared with the wild type background and that it is a very sensible model, in which we can evaluate the activation of T cells even an hour after co-culture. Besides, it was determined the existence of calcein transfer between moDCs and CD8+ pMEL-1 T cells in a strictly antigen specific context. However, we could not elucidate if the GJs participate or not in the CD8+ T cell activation process, as our inhibition method, which is a Cx43 mimetic peptide, presented technical problems, phenomenon that was proven in models where GJ mediated communication has previously been determinate. We propose in the future to use a different inhibition method, as the use of anti-Cx43 siRNA, in order to determine if these channels play a role in this process.
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Avaliação da expressão de receptores e ligantes Notch nas populações de linfócitos T em desenvolvimento, linfócitos T reguladores naturais e células dendríticas no timo humano / Evaluation of the expression of Notch receptors and ligands in developing lymphocytes, natural regulatory T cells and dendritic cells in human thymus

Luciana Bento de Souza 10 September 2012 (has links)
O timo é o órgão linfóide primário responsável pela maturação dos linfócitos T onde se observam estruturas e células especializadas. A sinalização intra-tímica durante a maturação de linfócitos T não é bem esclarecida. Entre outras, a via de sinalização Notch, composta por receptores (Notch 1 a 4) e ligantes (DLL1, 3 e 4, Jagged 1 e 2), pode regular este processo. Neste trabalho temos como objetivo avaliar a expressão gênica e proteica de receptores e ligantes Notch nas diferentes fases de maturação de linfócitos T, linfócitos T reguladores naturais (nTreg) e células dendriticas tímicas (tDC). Para tanto, timos de 10 crianças submetidas à cirurgia cardíaca corretiva foram manipulados e as populações CD4-CD8-, CD4+CD8+, CD4+CD8-, CD4-CD8+, nTreg e tDC foram purificadas por citometria de fluxo. O RNA total foi isolado e os genes NOTCH1, 2 e 3, DLL1 e 4, JAG1 e 2, FOXP3 foram amplificados por RT-PCR. Alguns fragmentos de tecido foram avaliados por imunohistoquímica, quanto a expressão dos receptres Notch 1, 2, 3 e 4 e dos ligantes, DLL1 e 4, Jagged 1 e 2 em timócitos totais, células FOXP3+ e células S100+ em cada região tímica. Todos os genes de receptores e ligantes Notch foram expressos nas populações estudadas. Na população CD4-CD8- o gene NOTCH1 é mais expresso em comparação as outras populações de timócitos imaturos. Na população CD4+CD8+ o gene NOTCH2 é menos expresso, e o gene JAG2 mais expresso quando comparados à população CD4+CD8-. Os demais genes de receptores ligantes Notch são expressos de maneira similar entre as populações de timócitos. A avaliação relativa dos genes Notch nas populações de timócitos mostrou uma maior expressão do gene DLL1 na população CD4+CD8- e JAG1 na população CD4-CD8+ em comparação à CD4-CD8-. A expressão dos receptores e ligantes Notch no tecido mostrou ser homogênea entre as regiões. As nTreg expressam o gene do ligante JAG1 em maior nível entre os avaliados. A expressão gênica relativa das nTreg mostrou uma maior expressão de NOTCH1, NOTCH2, DLL4 e JAG1 e menor expressão de NOTCH3, DLL1 e JAG2 em relação as CD4-CD8-. Quando a relação utilizou a população CD4+CD8- observamos que as nTreg expressam mais os genes NOCTH1, NOCTH2, NOTCH3, DLL4 e JAG1, e em níveis similares DLL1 e JAG2. A avaliação histológica mostrou uma maior expressão de DLL4 em nTreg em comparação às demais proteínas avaliadas, e uma distribuição homogênea entre as regiões com exceção de Notch3 e Jagged2. As tDC mostraram uma maior expressão do gene JAG1 em comparação aos demais, e uma maior expressão da proteína DLL4. A expressão do receptor Notch2 em tDC difere entre as regiões tímicas. Em conjunto, nossos resultados mostraram que os receptores e ligantes Notch são expressos de forma gênica e proteica em todos os estágios de maturação de linfócitos T, nTreg e tDC do timo humano, com algumas variações quanto ao nível de expressão e distribuição no timo. Dados que se assemelham às avaliações murinas, porém com pontos a serem discutidos. Nossa inédita avaliação em nTreg propõem uma nova abordagem ao envolvimento da via Notch em sua maturação e a avaliação das tDCs sugere sua participação direta via Notch na maturação dos timócitos humanos / The thymus is a primary lymphoid organ responsible of maturing T lymphocytes, where specialized structures and cells are observed. The intrathymic signaling during lymphocytes maturation is unclear. Among them, Notch signaling pathway, which comprises in receptors (Notch1-4) and ligands (DLL1, 2 and 3, Jaaged1 and 2), may regulate this process. In this work our aim is to evaluate the expression of Notch receptors and ligands in different phases of T lymphocytes maturation, natural T regulatory cells (nTreg), and thymic dendritic cells (tDC). For this purpose, thymuses from 10 children who underwent corrective cardiac surgery were manipulated and populations CD4-CD8-, CD4+CD8+, CD4+CD8-, CD4- CD8+, nTreg and tDC were sorted by flow cytometry. Total RNA was purified and genes NOTCH1, 2 and 3, DLL1 and 4, JAG1 and 2, FOXP3 were amplified by RT-PCR. Some thymic fragments were evaluated by immunohistochemistry and screened for expression of Notch 1, 2, 3 and 4 receptors, DLL1 and 4, Jagged and e 2 ligands in total thymocytes, FOXP3+ cells and S100+ cells in each thymic region. All Notch receptors and ligands genes were expressed in studied populations. In CD4-CD8- subset NOTCH1 gene is more expressed in comparison to others immature thymocytes. In CD4+CD8+ subset NOTCH2 gene is less expressed, and JAG2 gene is more expressed when compared to CD4+CD8- population. The other receptors and ligands genes were expressed in a similar level among developing lymphocytes subsets. The relative Notch genes evaluation in developing lymphocytes populations showed a higher expression of DLL1 gene in CD4+CD8- population and JAG1 gene in CD4-CD8+ subset in comparison to CD4-CD8- thymocytes. The Notch receptors and ligands expression in thymic tissue showed to be homogeneous between thymic regions. The nTreg cells express JAG1 ligand gene in highest level among evaluated genes. The relative gene expression in nTreg presented higher expression of NOCTH1, NOTCH2, DLL4 and JAG1 genes, and low levels of NOTCH3, DLL1 and JAG2 related to CD4-CD8- subset. When relative gene expression were performed using CD4+CD8- subset, we observed that nTreg cells expressed more NOCTH1, NOCTH2, NOTCH3, DLL4 and JAG1, and in a similar level of expression DLL1 and JAG2 genes. The histological analysis showed that DLL4 was more expressed in nTreg cells in comparison to others proteins evaluated in this work, and a homogeneous distribution in thymic regions, in exception Notch3 and Jagged2. tDC cells presented higher expression of JAG1 gene among the others, and a higher expression of DLL4 protein. Notch2 expression in tDC was different between thymic regions. All together, our results showed that both genes and proteins of Notch receptors and ligands are expressed in distinct developmental stages of the maturation of T lymphocytes and nTreg cells and in the tDC cells in human thymus, with some variations in levels of expression and distribution in the thymus. These data are similar to the murine evaluations, but with some issues to be discussed. Our unpublished assessment in nTreg propose a new approach about the involvement of Notch pathway in its maturation and the evaluation of tDC suggests its direct participation of Notch signaling in the process of human thymocytes maturation
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Avaliação da expressão de receptores e ligantes Notch nas populações de linfócitos T em desenvolvimento, linfócitos T reguladores naturais e células dendríticas no timo humano / Evaluation of the expression of Notch receptors and ligands in developing lymphocytes, natural regulatory T cells and dendritic cells in human thymus

Souza, Luciana Bento de 10 September 2012 (has links)
O timo é o órgão linfóide primário responsável pela maturação dos linfócitos T onde se observam estruturas e células especializadas. A sinalização intra-tímica durante a maturação de linfócitos T não é bem esclarecida. Entre outras, a via de sinalização Notch, composta por receptores (Notch 1 a 4) e ligantes (DLL1, 3 e 4, Jagged 1 e 2), pode regular este processo. Neste trabalho temos como objetivo avaliar a expressão gênica e proteica de receptores e ligantes Notch nas diferentes fases de maturação de linfócitos T, linfócitos T reguladores naturais (nTreg) e células dendriticas tímicas (tDC). Para tanto, timos de 10 crianças submetidas à cirurgia cardíaca corretiva foram manipulados e as populações CD4-CD8-, CD4+CD8+, CD4+CD8-, CD4-CD8+, nTreg e tDC foram purificadas por citometria de fluxo. O RNA total foi isolado e os genes NOTCH1, 2 e 3, DLL1 e 4, JAG1 e 2, FOXP3 foram amplificados por RT-PCR. Alguns fragmentos de tecido foram avaliados por imunohistoquímica, quanto a expressão dos receptres Notch 1, 2, 3 e 4 e dos ligantes, DLL1 e 4, Jagged 1 e 2 em timócitos totais, células FOXP3+ e células S100+ em cada região tímica. Todos os genes de receptores e ligantes Notch foram expressos nas populações estudadas. Na população CD4-CD8- o gene NOTCH1 é mais expresso em comparação as outras populações de timócitos imaturos. Na população CD4+CD8+ o gene NOTCH2 é menos expresso, e o gene JAG2 mais expresso quando comparados à população CD4+CD8-. Os demais genes de receptores ligantes Notch são expressos de maneira similar entre as populações de timócitos. A avaliação relativa dos genes Notch nas populações de timócitos mostrou uma maior expressão do gene DLL1 na população CD4+CD8- e JAG1 na população CD4-CD8+ em comparação à CD4-CD8-. A expressão dos receptores e ligantes Notch no tecido mostrou ser homogênea entre as regiões. As nTreg expressam o gene do ligante JAG1 em maior nível entre os avaliados. A expressão gênica relativa das nTreg mostrou uma maior expressão de NOTCH1, NOTCH2, DLL4 e JAG1 e menor expressão de NOTCH3, DLL1 e JAG2 em relação as CD4-CD8-. Quando a relação utilizou a população CD4+CD8- observamos que as nTreg expressam mais os genes NOCTH1, NOCTH2, NOTCH3, DLL4 e JAG1, e em níveis similares DLL1 e JAG2. A avaliação histológica mostrou uma maior expressão de DLL4 em nTreg em comparação às demais proteínas avaliadas, e uma distribuição homogênea entre as regiões com exceção de Notch3 e Jagged2. As tDC mostraram uma maior expressão do gene JAG1 em comparação aos demais, e uma maior expressão da proteína DLL4. A expressão do receptor Notch2 em tDC difere entre as regiões tímicas. Em conjunto, nossos resultados mostraram que os receptores e ligantes Notch são expressos de forma gênica e proteica em todos os estágios de maturação de linfócitos T, nTreg e tDC do timo humano, com algumas variações quanto ao nível de expressão e distribuição no timo. Dados que se assemelham às avaliações murinas, porém com pontos a serem discutidos. Nossa inédita avaliação em nTreg propõem uma nova abordagem ao envolvimento da via Notch em sua maturação e a avaliação das tDCs sugere sua participação direta via Notch na maturação dos timócitos humanos / The thymus is a primary lymphoid organ responsible of maturing T lymphocytes, where specialized structures and cells are observed. The intrathymic signaling during lymphocytes maturation is unclear. Among them, Notch signaling pathway, which comprises in receptors (Notch1-4) and ligands (DLL1, 2 and 3, Jaaged1 and 2), may regulate this process. In this work our aim is to evaluate the expression of Notch receptors and ligands in different phases of T lymphocytes maturation, natural T regulatory cells (nTreg), and thymic dendritic cells (tDC). For this purpose, thymuses from 10 children who underwent corrective cardiac surgery were manipulated and populations CD4-CD8-, CD4+CD8+, CD4+CD8-, CD4- CD8+, nTreg and tDC were sorted by flow cytometry. Total RNA was purified and genes NOTCH1, 2 and 3, DLL1 and 4, JAG1 and 2, FOXP3 were amplified by RT-PCR. Some thymic fragments were evaluated by immunohistochemistry and screened for expression of Notch 1, 2, 3 and 4 receptors, DLL1 and 4, Jagged and e 2 ligands in total thymocytes, FOXP3+ cells and S100+ cells in each thymic region. All Notch receptors and ligands genes were expressed in studied populations. In CD4-CD8- subset NOTCH1 gene is more expressed in comparison to others immature thymocytes. In CD4+CD8+ subset NOTCH2 gene is less expressed, and JAG2 gene is more expressed when compared to CD4+CD8- population. The other receptors and ligands genes were expressed in a similar level among developing lymphocytes subsets. The relative Notch genes evaluation in developing lymphocytes populations showed a higher expression of DLL1 gene in CD4+CD8- population and JAG1 gene in CD4-CD8+ subset in comparison to CD4-CD8- thymocytes. The Notch receptors and ligands expression in thymic tissue showed to be homogeneous between thymic regions. The nTreg cells express JAG1 ligand gene in highest level among evaluated genes. The relative gene expression in nTreg presented higher expression of NOCTH1, NOTCH2, DLL4 and JAG1 genes, and low levels of NOTCH3, DLL1 and JAG2 related to CD4-CD8- subset. When relative gene expression were performed using CD4+CD8- subset, we observed that nTreg cells expressed more NOCTH1, NOCTH2, NOTCH3, DLL4 and JAG1, and in a similar level of expression DLL1 and JAG2 genes. The histological analysis showed that DLL4 was more expressed in nTreg cells in comparison to others proteins evaluated in this work, and a homogeneous distribution in thymic regions, in exception Notch3 and Jagged2. tDC cells presented higher expression of JAG1 gene among the others, and a higher expression of DLL4 protein. Notch2 expression in tDC was different between thymic regions. All together, our results showed that both genes and proteins of Notch receptors and ligands are expressed in distinct developmental stages of the maturation of T lymphocytes and nTreg cells and in the tDC cells in human thymus, with some variations in levels of expression and distribution in the thymus. These data are similar to the murine evaluations, but with some issues to be discussed. Our unpublished assessment in nTreg propose a new approach about the involvement of Notch pathway in its maturation and the evaluation of tDC suggests its direct participation of Notch signaling in the process of human thymocytes maturation

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