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Estudio del rol de conexina 43 en la sinapsis inmunológica citolítica entre linfocitos t citotóxicos y células de melanomaHoffmann Vega, Francisca Alejandra 08 1900 (has links)
Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniera en Biotecnología Molecular. / El desarrollo de una respuesta inmune anti-tumoral requiere de la comunicación entre
diferentes células del sistema inmune, así como del reconocimiento de la célula
tumoral. Una vez que los Linfocitos T Citotóxicos (CTL) y las células Natural Killers
(NK) reconocen la célula tumoral, forman la Sinapsis Inmunológica Citotóxica (SIC),
una estructura supramolecular altamente especializada que resulta fundamental para la
liberación localizada de los gránulos citotóxicos y la eliminación específica de la célula
tumoral. Recientemente, se ha descrito la participación de canales Gap Junction (GJ)
formados por la isoforma Cx43 (GJ-Cx43) en la actividad citotóxica de las células NK
durante la SIC. A pesar de las similitudes funcionales y estructurales presentadas por
la SIC mediada por las células NK y por CTL, la participación de los canales GJ-Cx43
en la sinapsis mediada por CTL aún no ha sido determinada. En este trabajo se estudió
el rol de los canales GJ-Cx43 en la actividad de la SIC entre CTL obtenidos desde
ratones pMEL-1 y células de melanoma murino B16F10. Primero, se evaluó la
polarización de Cx43 hacia la zona de contacto entre CTL pMEL-1 y células B16F10,
durante la SIC. Se determinó que Cx43 se acumula en el sitio de contacto entre estas
células de manera antígeno específica y que esta polarización es dependiente de la
activación de los CTL. Luego, se disminuyó la expresión de Cx43 en células B16F10
utilizando un RNA interferente contra Cx43 y luego se evaluó la participación de Cx43
en la formación de canales GJ mediante ensayos de transferencia de calceína y en la
actividad citotóxica de los CTL, mediante ensayos de actividad de Granzima B (GrzB).
Se observó que los CTL transfieren calceína a las células B16F10 formando canales
GJ funcionales, al contrario de cuando se utilizan LT CD8+ vírgenes como células
efectoras. Además, cuando se utilizaron las células B16F10 que expresan bajos niveles de Cx43 como células blanco, se observó una disminución en la transferencia
de calceína y en la actividad de GrzB en comparación al control. Nuestros resultados
demuestran que durante el reconocimiento citotóxico se forman canales GJ-Cx43 entre
CTL y células B16F10 y que la formación de estos canales durante la SIC son
importantes para la eliminación de células tumorales mediada por CTL. / Development of antitumor immune responses requires communication between
different immune cells, and specific immune recognition of tumor cells. Upon tumor cell
recognition, CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer (NK) cells form the
“Cytotoxic Immunological Synapse (SIC)”, a specialized molecular structure
fundamental for the polarized delivery of cytotoxic granules and the specific tumor cell
killing. Recently, it has been described the participation of Gap Junction Intercellular
Communications formed by Connexin 43 (GJIC-Cx43) in the NK cell SIC activity.
Despite that CTL and NK cells present functional and structural similarities in SIC
formation, the participation of GJIC-Cx43 in CTL-mediated SIC remains unclear. In this
work we studied the role of GJIC-Cx43 in the activity of SIC formed between CTL from
pMEL-1 mice and B16F10 murine melanoma cells. First, we evaluated by
immunofluorescence the polarization of Cx43 to contact site between CTL and B16F10
during SIC. We found that this protein localizes at the contact site of SIC and this
polarization dependent on activation of CTL and is an antigenic-specific process.
Then, we decrease Cx43 expression in B16F10 cells using interference RNA against
Cx43 and we evaluated the participation of Cx43 in the formation of functional GJ
channels by calcein transfer assay and in the cytotoxic activity of CTL by Granzyme B
(GrzB) activity assay. We found that CTL transfer calcein to B16F10 forming functional
GJ in contrast with when we used a naïve CD8+ T cells as an effector cells. In addition,
when we used a B16F10 that express low levels of Cx43 as target cells, we observed a
decrease in calcein transfer and GrzB activity in comparison to the control. Our results
demonstrate that GJIC-Cx43 are formed between CTL and B16F10 during SIC, and
suggest that their formation is important for tumor cells-killing by CTL
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Células T γδ intraepiteliales intestinales y su influencia en la homeostasis intestinal: Estudio de la producción de CCL4 y flujos de calcio intracelular a través de la activación del complejo TCR γδMalinarich González, Frano Hernán January 2010 (has links)
No description available.
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Estudio de la participación de gap junctions en la activación de linfocitos T CD8+ mediante la validación del modelo Murino pMEL-1Navarrete Sánchez, Mariela Ivonne 03 1900 (has links)
Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular / Las Gap Junctions (GJs) son clústers de canales intercelulares localizados en la
membrana plasmática que permiten la comunicación directa entre células adyacentes.
Cada canal GJ está compuesto por 2 hemicanales hexaméricos conocidos como
conexones, los cuales a su vez están compuestos por seis proteínas de
transmembrana llamadas conexinas (Cxs), siendo Cx43 la más representada en el
sistema inmune. Se ha vinculado la variación de los niveles normales de expresión de
las Cxs con la patogénesis de distintas enfermedades, incluyendo sordera congénita,
arritmias cardiacas y cáncer. Dentro de esta última nuestro laboratorio ha desarrollado
proyectos de investigación que permitan determinar el papel de las GJs en la respuesta
inmune antitumoral. Por ejemplo, publicaciones previas de nuestro laboratorio han
demostrado que Cx43 participa en la transferencia directa de antígenos tumorales
entre células dendríticas (DCs). Así mismo, Cx43 polariza hacia la sinapsis entre DC y
linfocitos T (LT) CD4+, formando canales funcionales que permiten una comunicación
bidireccional requerida para la activación de LT mediada por APC. Además, se ha
encontrado que Cx43 juega un rol en la activación de células natural killer (NK) por
parte de DCs y en la regulación de la citotoxicidad de las células NK contra células
tumorales. Así mismo, resultados no publicados indican que Cx43 polariza hacia el sitio
de contacto entre LT CD8+ citotóxicos (CTLs) y células de melanoma, sugiriendo que
Cx43 participaría en la citotoxicidad de CTLs en contra de éstas. Estos antecedentes
sugieren que las GJs podría participar en el transporte de moléculas o señales que se
encuentren involucradas en el proceso de activación de LT CD8+ mediada por DCs,
tema que aún no ha sido estudiado por las investigaciones actuales. En estudios
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anteriores nuestro laboratorio ha trabajado con modelos celulares humanos, sin
embargo, dado que la obtención de LT vírgenes específicos contra el tumor a partir de
donantes sanos es improbable y engorroso, en este trabajo decidimos utilizar el
modelo murino específico para melanoma pMEL-1 y validar y optimizar su utilización
para estudios de la participación de las GJs en la activación de LT CD8+ por parte de
DCs. Nuestros resultados indican que el modelo pMEL-1 no representa alteraciones en
la expresión de Cx43 respecto a su contraparte silvestre (wild type (WT)), y que es un
modelo muy sensible, encontrando expresión del marcador de activación CD69 incluso
desde 1 hora post co-cultivo. Además, se determinó que existe transferencia de
calceína entre moDC y LT CD8+ pMEL-1 en un contexto estrictamente antígeno
específico. Sin embargo, no pudimos dilucidar si las GJs participan del proceso de
activación ya que el método de inhibición utilizado, el cual es un péptido mimético de
Cx43, presentó problemas técnicos de funcionamiento, fenómeno que fue comprobado
en modelos donde anteriormente se había determinado la comunicación mediada por
GJs. Proponemos en el futuro utilizar otros métodos de inhibición, como el uso de
siRNA contra Cx43, para determinar si estos canales juegan un rol en este proceso. / Gap Junctions are clusters of intercellular channels located in the plasma
membrane that allow direct communication between adjacent cells. Each GJ channel is
composed of 2 hexameric hemichannels known as connexions, which are composed by
six transmembrane proteins called conexins (Cxs), being Cx43 the most represented
one in the inmmune system. Variation in normal expression levels on Cxs have been
linked to the development of different diseases, including congenital deafness, cardiac
arrhythmias and cancer, being the last the one where our laboratory has developed
investigation lines that allow to determine the role of GJs in the antitumoral response. In
example, previous publications of our group have demonstrated that Cx43 participates
in the direct transfer of tumoral antigens between dendritic cells (DCs) and that
polarizes to the synapsis between DCs and CD4+ T lymphocytes, forming functional
channels that allow bidirectional communication required for the DCs mediated
activation of LT. Besides this, we have found that Cx43 plays a role in the activation of
natural killer (NK) cells mediated by DCs, and in the regulation of the cytotoxicity of NK
cells against tumor cells. Likewise, unpublished data indicate that Cx43 polarizes to the
contact site between cytotoxic CD8+ T cells (CTLs) and melanoma cells, suggesting
that Cx43 participates in the cytotoxicity of these cells. These backgrounds suggest that
GJs may participate in the transport of molecules or signals that may be involved in the
process of DC mediated activation of CD8+ T cells, subject that hasn’t been studied by
the actual investigations. In previous studies our group has worked with human cellular
models, however, given that obtaining naïve T cells from healthy donors is unlikely and
difficult, in this work we decided to use the melanoma specific murine model pMEL-1
and valid and optimize it’s use for studies of the participation of GJs in the DCs
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activation of T cells. Our results indicate that the pMEL-1 model doesn’t have
alterations in the Cx43 expression levels compared with the wild type background and
that it is a very sensible model, in which we can evaluate the activation of T cells even
an hour after co-culture. Besides, it was determined the existence of calcein transfer
between moDCs and CD8+ pMEL-1 T cells in a strictly antigen specific context.
However, we could not elucidate if the GJs participate or not in the CD8+ T cell
activation process, as our inhibition method, which is a Cx43 mimetic peptide,
presented technical problems, phenomenon that was proven in models where GJ
mediated communication has previously been determinate. We propose in the future to
use a different inhibition method, as the use of anti-Cx43 siRNA, in order to determine if
these channels play a role in this process.
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Avaliação da expressão de receptores e ligantes Notch nas populações de linfócitos T em desenvolvimento, linfócitos T reguladores naturais e células dendríticas no timo humano / Evaluation of the expression of Notch receptors and ligands in developing lymphocytes, natural regulatory T cells and dendritic cells in human thymusLuciana Bento de Souza 10 September 2012 (has links)
O timo é o órgão linfóide primário responsável pela maturação dos linfócitos T onde se observam estruturas e células especializadas. A sinalização intra-tímica durante a maturação de linfócitos T não é bem esclarecida. Entre outras, a via de sinalização Notch, composta por receptores (Notch 1 a 4) e ligantes (DLL1, 3 e 4, Jagged 1 e 2), pode regular este processo. Neste trabalho temos como objetivo avaliar a expressão gênica e proteica de receptores e ligantes Notch nas diferentes fases de maturação de linfócitos T, linfócitos T reguladores naturais (nTreg) e células dendriticas tímicas (tDC). Para tanto, timos de 10 crianças submetidas à cirurgia cardíaca corretiva foram manipulados e as populações CD4-CD8-, CD4+CD8+, CD4+CD8-, CD4-CD8+, nTreg e tDC foram purificadas por citometria de fluxo. O RNA total foi isolado e os genes NOTCH1, 2 e 3, DLL1 e 4, JAG1 e 2, FOXP3 foram amplificados por RT-PCR. Alguns fragmentos de tecido foram avaliados por imunohistoquímica, quanto a expressão dos receptres Notch 1, 2, 3 e 4 e dos ligantes, DLL1 e 4, Jagged 1 e 2 em timócitos totais, células FOXP3+ e células S100+ em cada região tímica. Todos os genes de receptores e ligantes Notch foram expressos nas populações estudadas. Na população CD4-CD8- o gene NOTCH1 é mais expresso em comparação as outras populações de timócitos imaturos. Na população CD4+CD8+ o gene NOTCH2 é menos expresso, e o gene JAG2 mais expresso quando comparados à população CD4+CD8-. Os demais genes de receptores ligantes Notch são expressos de maneira similar entre as populações de timócitos. A avaliação relativa dos genes Notch nas populações de timócitos mostrou uma maior expressão do gene DLL1 na população CD4+CD8- e JAG1 na população CD4-CD8+ em comparação à CD4-CD8-. A expressão dos receptores e ligantes Notch no tecido mostrou ser homogênea entre as regiões. As nTreg expressam o gene do ligante JAG1 em maior nível entre os avaliados. A expressão gênica relativa das nTreg mostrou uma maior expressão de NOTCH1, NOTCH2, DLL4 e JAG1 e menor expressão de NOTCH3, DLL1 e JAG2 em relação as CD4-CD8-. Quando a relação utilizou a população CD4+CD8- observamos que as nTreg expressam mais os genes NOCTH1, NOCTH2, NOTCH3, DLL4 e JAG1, e em níveis similares DLL1 e JAG2. A avaliação histológica mostrou uma maior expressão de DLL4 em nTreg em comparação às demais proteínas avaliadas, e uma distribuição homogênea entre as regiões com exceção de Notch3 e Jagged2. As tDC mostraram uma maior expressão do gene JAG1 em comparação aos demais, e uma maior expressão da proteína DLL4. A expressão do receptor Notch2 em tDC difere entre as regiões tímicas. Em conjunto, nossos resultados mostraram que os receptores e ligantes Notch são expressos de forma gênica e proteica em todos os estágios de maturação de linfócitos T, nTreg e tDC do timo humano, com algumas variações quanto ao nível de expressão e distribuição no timo. Dados que se assemelham às avaliações murinas, porém com pontos a serem discutidos. Nossa inédita avaliação em nTreg propõem uma nova abordagem ao envolvimento da via Notch em sua maturação e a avaliação das tDCs sugere sua participação direta via Notch na maturação dos timócitos humanos / The thymus is a primary lymphoid organ responsible of maturing T lymphocytes, where specialized structures and cells are observed. The intrathymic signaling during lymphocytes maturation is unclear. Among them, Notch signaling pathway, which comprises in receptors (Notch1-4) and ligands (DLL1, 2 and 3, Jaaged1 and 2), may regulate this process. In this work our aim is to evaluate the expression of Notch receptors and ligands in different phases of T lymphocytes maturation, natural T regulatory cells (nTreg), and thymic dendritic cells (tDC). For this purpose, thymuses from 10 children who underwent corrective cardiac surgery were manipulated and populations CD4-CD8-, CD4+CD8+, CD4+CD8-, CD4- CD8+, nTreg and tDC were sorted by flow cytometry. Total RNA was purified and genes NOTCH1, 2 and 3, DLL1 and 4, JAG1 and 2, FOXP3 were amplified by RT-PCR. Some thymic fragments were evaluated by immunohistochemistry and screened for expression of Notch 1, 2, 3 and 4 receptors, DLL1 and 4, Jagged and e 2 ligands in total thymocytes, FOXP3+ cells and S100+ cells in each thymic region. All Notch receptors and ligands genes were expressed in studied populations. In CD4-CD8- subset NOTCH1 gene is more expressed in comparison to others immature thymocytes. In CD4+CD8+ subset NOTCH2 gene is less expressed, and JAG2 gene is more expressed when compared to CD4+CD8- population. The other receptors and ligands genes were expressed in a similar level among developing lymphocytes subsets. The relative Notch genes evaluation in developing lymphocytes populations showed a higher expression of DLL1 gene in CD4+CD8- population and JAG1 gene in CD4-CD8+ subset in comparison to CD4-CD8- thymocytes. The Notch receptors and ligands expression in thymic tissue showed to be homogeneous between thymic regions. The nTreg cells express JAG1 ligand gene in highest level among evaluated genes. The relative gene expression in nTreg presented higher expression of NOCTH1, NOTCH2, DLL4 and JAG1 genes, and low levels of NOTCH3, DLL1 and JAG2 related to CD4-CD8- subset. When relative gene expression were performed using CD4+CD8- subset, we observed that nTreg cells expressed more NOCTH1, NOCTH2, NOTCH3, DLL4 and JAG1, and in a similar level of expression DLL1 and JAG2 genes. The histological analysis showed that DLL4 was more expressed in nTreg cells in comparison to others proteins evaluated in this work, and a homogeneous distribution in thymic regions, in exception Notch3 and Jagged2. tDC cells presented higher expression of JAG1 gene among the others, and a higher expression of DLL4 protein. Notch2 expression in tDC was different between thymic regions. All together, our results showed that both genes and proteins of Notch receptors and ligands are expressed in distinct developmental stages of the maturation of T lymphocytes and nTreg cells and in the tDC cells in human thymus, with some variations in levels of expression and distribution in the thymus. These data are similar to the murine evaluations, but with some issues to be discussed. Our unpublished assessment in nTreg propose a new approach about the involvement of Notch pathway in its maturation and the evaluation of tDC suggests its direct participation of Notch signaling in the process of human thymocytes maturation
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Avaliação da expressão de receptores e ligantes Notch nas populações de linfócitos T em desenvolvimento, linfócitos T reguladores naturais e células dendríticas no timo humano / Evaluation of the expression of Notch receptors and ligands in developing lymphocytes, natural regulatory T cells and dendritic cells in human thymusSouza, Luciana Bento de 10 September 2012 (has links)
O timo é o órgão linfóide primário responsável pela maturação dos linfócitos T onde se observam estruturas e células especializadas. A sinalização intra-tímica durante a maturação de linfócitos T não é bem esclarecida. Entre outras, a via de sinalização Notch, composta por receptores (Notch 1 a 4) e ligantes (DLL1, 3 e 4, Jagged 1 e 2), pode regular este processo. Neste trabalho temos como objetivo avaliar a expressão gênica e proteica de receptores e ligantes Notch nas diferentes fases de maturação de linfócitos T, linfócitos T reguladores naturais (nTreg) e células dendriticas tímicas (tDC). Para tanto, timos de 10 crianças submetidas à cirurgia cardíaca corretiva foram manipulados e as populações CD4-CD8-, CD4+CD8+, CD4+CD8-, CD4-CD8+, nTreg e tDC foram purificadas por citometria de fluxo. O RNA total foi isolado e os genes NOTCH1, 2 e 3, DLL1 e 4, JAG1 e 2, FOXP3 foram amplificados por RT-PCR. Alguns fragmentos de tecido foram avaliados por imunohistoquímica, quanto a expressão dos receptres Notch 1, 2, 3 e 4 e dos ligantes, DLL1 e 4, Jagged 1 e 2 em timócitos totais, células FOXP3+ e células S100+ em cada região tímica. Todos os genes de receptores e ligantes Notch foram expressos nas populações estudadas. Na população CD4-CD8- o gene NOTCH1 é mais expresso em comparação as outras populações de timócitos imaturos. Na população CD4+CD8+ o gene NOTCH2 é menos expresso, e o gene JAG2 mais expresso quando comparados à população CD4+CD8-. Os demais genes de receptores ligantes Notch são expressos de maneira similar entre as populações de timócitos. A avaliação relativa dos genes Notch nas populações de timócitos mostrou uma maior expressão do gene DLL1 na população CD4+CD8- e JAG1 na população CD4-CD8+ em comparação à CD4-CD8-. A expressão dos receptores e ligantes Notch no tecido mostrou ser homogênea entre as regiões. As nTreg expressam o gene do ligante JAG1 em maior nível entre os avaliados. A expressão gênica relativa das nTreg mostrou uma maior expressão de NOTCH1, NOTCH2, DLL4 e JAG1 e menor expressão de NOTCH3, DLL1 e JAG2 em relação as CD4-CD8-. Quando a relação utilizou a população CD4+CD8- observamos que as nTreg expressam mais os genes NOCTH1, NOCTH2, NOTCH3, DLL4 e JAG1, e em níveis similares DLL1 e JAG2. A avaliação histológica mostrou uma maior expressão de DLL4 em nTreg em comparação às demais proteínas avaliadas, e uma distribuição homogênea entre as regiões com exceção de Notch3 e Jagged2. As tDC mostraram uma maior expressão do gene JAG1 em comparação aos demais, e uma maior expressão da proteína DLL4. A expressão do receptor Notch2 em tDC difere entre as regiões tímicas. Em conjunto, nossos resultados mostraram que os receptores e ligantes Notch são expressos de forma gênica e proteica em todos os estágios de maturação de linfócitos T, nTreg e tDC do timo humano, com algumas variações quanto ao nível de expressão e distribuição no timo. Dados que se assemelham às avaliações murinas, porém com pontos a serem discutidos. Nossa inédita avaliação em nTreg propõem uma nova abordagem ao envolvimento da via Notch em sua maturação e a avaliação das tDCs sugere sua participação direta via Notch na maturação dos timócitos humanos / The thymus is a primary lymphoid organ responsible of maturing T lymphocytes, where specialized structures and cells are observed. The intrathymic signaling during lymphocytes maturation is unclear. Among them, Notch signaling pathway, which comprises in receptors (Notch1-4) and ligands (DLL1, 2 and 3, Jaaged1 and 2), may regulate this process. In this work our aim is to evaluate the expression of Notch receptors and ligands in different phases of T lymphocytes maturation, natural T regulatory cells (nTreg), and thymic dendritic cells (tDC). For this purpose, thymuses from 10 children who underwent corrective cardiac surgery were manipulated and populations CD4-CD8-, CD4+CD8+, CD4+CD8-, CD4- CD8+, nTreg and tDC were sorted by flow cytometry. Total RNA was purified and genes NOTCH1, 2 and 3, DLL1 and 4, JAG1 and 2, FOXP3 were amplified by RT-PCR. Some thymic fragments were evaluated by immunohistochemistry and screened for expression of Notch 1, 2, 3 and 4 receptors, DLL1 and 4, Jagged and e 2 ligands in total thymocytes, FOXP3+ cells and S100+ cells in each thymic region. All Notch receptors and ligands genes were expressed in studied populations. In CD4-CD8- subset NOTCH1 gene is more expressed in comparison to others immature thymocytes. In CD4+CD8+ subset NOTCH2 gene is less expressed, and JAG2 gene is more expressed when compared to CD4+CD8- population. The other receptors and ligands genes were expressed in a similar level among developing lymphocytes subsets. The relative Notch genes evaluation in developing lymphocytes populations showed a higher expression of DLL1 gene in CD4+CD8- population and JAG1 gene in CD4-CD8+ subset in comparison to CD4-CD8- thymocytes. The Notch receptors and ligands expression in thymic tissue showed to be homogeneous between thymic regions. The nTreg cells express JAG1 ligand gene in highest level among evaluated genes. The relative gene expression in nTreg presented higher expression of NOCTH1, NOTCH2, DLL4 and JAG1 genes, and low levels of NOTCH3, DLL1 and JAG2 related to CD4-CD8- subset. When relative gene expression were performed using CD4+CD8- subset, we observed that nTreg cells expressed more NOCTH1, NOCTH2, NOTCH3, DLL4 and JAG1, and in a similar level of expression DLL1 and JAG2 genes. The histological analysis showed that DLL4 was more expressed in nTreg cells in comparison to others proteins evaluated in this work, and a homogeneous distribution in thymic regions, in exception Notch3 and Jagged2. tDC cells presented higher expression of JAG1 gene among the others, and a higher expression of DLL4 protein. Notch2 expression in tDC was different between thymic regions. All together, our results showed that both genes and proteins of Notch receptors and ligands are expressed in distinct developmental stages of the maturation of T lymphocytes and nTreg cells and in the tDC cells in human thymus, with some variations in levels of expression and distribution in the thymus. These data are similar to the murine evaluations, but with some issues to be discussed. Our unpublished assessment in nTreg propose a new approach about the involvement of Notch pathway in its maturation and the evaluation of tDC suggests its direct participation of Notch signaling in the process of human thymocytes maturation
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