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Titulo Ingeniero en Biotecnología Molecular

Ingeniería en Biotecnología Molecular / Actualmente, el uso de enzimas corresponde a un área de la biotecnología de gran crecimiento y desarrollo, la cual ha buscado dar solución a problemas de tipo industriales, biomédicos y domésticos; representando una solución específica, sustentable y ecológicamente amigable. En el ámbito de la innovación, como parte de una mejora tecnológica se ha buscado obtener enzimas estables y que puedan ser utilizadas en condiciones extremas de pH, temperatura, salinidad etc. Los microorganismos provenientes de ambientes extremos representan una buena fuente de este tipo de enzimas, ya que generalmente estos microorganismos precisan de este tipo de enzimas para la sobrevida en las condiciones hostiles de su hábitat. Un ambiente extremo que ha sido poco explorado en este sentido es el Desierto de Atacama. Conocido por ser el desierto más antiguo y árido del planeta, presenta condiciones ambientales que hacen que sea considerado como un ambiente extremo único en el mundo. Pese a estas condiciones adversas, diversos microorganismos han podido ser aislados desde este ambiente tan particular. Entre ellos esta Streptomyces leeuwenhoekii C34 que presenta varios grados de tolerancia a condiciones extremas. En este trabajo se realizó la búsqueda bioinformática de enzimas de interés comercial en el genoma de S. leeuwenhoekii C34. Teniendo en cuenta el gran potencial biotecnológico y diversidad de aplicaciones de las enzimas lipasas, se seleccionó el gen sle_62990 que codifica para una lipasa putativa GDSL- SGNH. Con el fin de estudiar este gen se generó la cepa LIP de S. leeuwenhoekkii C34 que sobre expresa el gen sle_62990. Con esta cepa se pudo comprobar que el gen sle_62990 codifica para una lipasa extracelular funcional y que presenta actividad contra p-nitrofenil palmitato. También se intentó la expresión heteróloga de la enzima en el medio intracelular de E. coli. Sin embargo, no se obtuvieron los resultados esperados, ya que se encontró en cuerpos de inclusión. / Currently, the use of enzymes corresponds to a growing area in the biotechnology field which has sought to solve industrial, biomedical, and domestic problems. These represent a specific, sustainable and ecologically friendly solution. Stable enzymes that can be used under extreme conditions such as high pH, temperature and salinity are of particular interest for biotechnological improvement. Microorganisms from extreme environments require these types of enzymes in order to survive under the harsh conditions of their habitat. Therefore, they represent a good source of interesting enzymes. An extreme environment that has been little explored is the Atacama Desert. The Atacama Desert is known as the oldest and driest desert on Earth. It presents extreme a environmental conditions. Despite these harsh conditions, various microorganisms have been isolated from this particular environment. Among them Streptomyces leeuwenhoekii C34, that shows several degrees of tolerance to extreme conditions. In this work, possible commercial enzymes were searched in the genome of S. leeuwenhoekii C34. Considering the great biotechnological potential and the diversity of applications of the lipases enzymes the gene sle_62990 that encoded for a putative lipase was selected. In order to study this gene, the LIP strain of S. leeuwenhoekii C34 that over-expressed the sle_62990 was generated. The over-expression allowed to confirm that the sle_62990 gene encodes for a functional extracellular lipase and it has activity against p-nitrophenyl palmitate. Attempts to heterologously express this gene in E. coli were unsuccessful.

Doctora en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / Las nuevas industrias han incorporado el uso de enzimas psicrófilas dentro de sus procesos de producción, lo que les ha permitido reducir tanto el consumo de sustratos como la producción de compuestos tóxicos, además de ahorrar energía, permitiendo una disminución de costos e impacto ambiental y por ello un aumento en la rentabilidad del proceso. Estas enzimas tienen un alto potencial a nivel industrial biotecnológico, y dentro de éstas, las lipasas son foco de atención dada su alta capacidad de sintetizar e hidrolizar enlaces ésteres y su exquisita selectividad de sustratos. Sus aplicaciones involucran la producción de alimentos, detergentes, fármacos, cosméticos, síntesis de compuestos químicos como biopolímeros y agroquímicos y su uso como biosensores, entre otras. En este trabajo, se determinó el modelo tridimensional de una lipasa activa a bajas temperaturas mediante modelamiento por homología. Este modelo presentó una evaluación positiva lo que permitió trabajar con él para caracterizar a esta enzima. Con este modelo se logró identificar y estudiar la participación de tres aminoácidos en la triada catalítica: Ser 239, His 391 y Asp 361, los cuales presentaban una acertada distribución espacial. Mediante docking molecular se estudió la unión y acoplamiento de estos tres aminoácidos con 4 tipos de sustratos diferentes, presentando preferencia por sustratos con cadenas aciladas de 6 carbonos. Se generaron mutaciones para cada uno de los aminoácidos candidatos, se realizaron modelos de su estructura tridimensional y se analizaron las distribuciones de cargas y energías. Así mismo, las mutaciones fueron sometidas a docking molecular para conocer la interacción de la triada mutada con estos cuatro sustratos. En todos los casos, las energías de interacción fueron drásticamente menores a la energía presentada por la lipasa nativa, demostrando la importancia de esta triada específica. Para validar estos resultados, cada uno de los residuos fue reemplazado utilizando mutagénesis sitio dirigida y se estudio su efecto en la actividad enzimática. Todas las mutaciones presentaron perdidas de la actividad, probando que ser239-asp361-his391 corresponde a la triada catalítica. Finalmente, se estudió el fenómeno de activación interfacial que acompaña a la actividad catalítica en gran parte del grupo de lipasas y esterasas. La comparación con modelos de enzimas que presentaron estructuras secundarias tipo tapas, reveló dos posibles estructuras α8 y G2 en la lipasa estudiada, que podrían estar participando en este fenómeno. Se concluye entonces, que la estructura de esta lipasa que fue predicha en base al alineamiento con otras lipasas de estructuras tridimensionales conocidas, corresponde al tipo α/β hidrolasa. Además, este trabajo logró predecir correctamente que los aminoácidos que forman la triada catalítica son Ser239, Asp361, e His391 lo cual fue validado mediante mutagénesis sitio-dirigida, reflejando la falta de actividad de mutantes con la triada modificada. Finalmente, los análisis del modelo tridimensional creado mostraron dos posibles estructuras que podrían mediar la activación interfacial.

El presente trabajo se realizó con el objetivo de inmovilizar la lipasa sobre el quitosano por medio de un enlace covalente usando la base de Schiff como unión entre la enzima, glutaraldehído y quitosano. El quitosano es un derivado de la quitina, ambos presentan múltiples áreas de aplicación. El quitosano se ha obtenido en el laboratorio a partir de la cubierta de “cangrejo” Cancer setosus por el método químico, siendo modificado en el proceso de desacetilación usando la autoclave. El quitosano obtenido presenta un alto grado de desacetilación 67,06 determinado por espectroscopía infrarroja y bajo porcentaje de proteína 0,5445 % determinado por el método de Bradford, siendo el soporte para la inmovilización de la lipasa con un rendimiento del proceso de inmovilización de 49,55 % y el rendimiento de reciclado de la enzima inmovilizada fue de 79,40 %, según el modelo basado en la generación de ácido oleico a partir de la hidrólisis del aceite de oliva. Palabras claves: Quitosano, autoclave, lipasa inmovilizada, espectroscopía infrarroja, actividad específica enzimática, ácido oleico. / Tesis

Tesis de Magíster en Alimentos, Mención Gestión, Calidad e Inocuidad de los Alimentos / La literatura describe métodos para el análisis posicional sn-2 en triacilgliceroles. El más usado se basa en la ruptura de los ácidos grasos en las posiciones sn-1 y sn-3 utilizando una lipasa pancreática, sin embargo, es un método laborioso y caro. De ahí, nace la necesidad de desarrollar un método más simple para el análisis de rutina. El objetivo de esta tesis es determinar indirectamente los ácidos grasos ubicados en la posición sn-2, con especial énfasis en los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga mediante un método enzimático alternativo utilizando la lipasa Rhizomucor miehei. En el desarrollo de la optimización del método se seleccionó el proceso más adecuado para purificar los triacilgliceroles utilizando una columna cromatográfica de vidrio, donde el óxido de aluminio actuó como compuesto adsorbente y el dietil éter como eluyente. Por otro lado, se optimizaron las condiciones de reacción enzimática con la lipasa del Rhizomucor miehei en manteca de cacao dada su composición de ácidos grasos (25,3; 36,8 y 33,4 g/100g para el ácido palmítico, esteárico y oleico, respectivamente) y su conocida distribución SOS, donde el ácido oleico insaturado ocupa preferentemente la posición sn-2. La optimización se realizó mediante un diseño estadístico donde las variables independientes fueron la temperatura, tiempo de reacción y cantidad de enzima, mientras que la dependiente fue la capacidad de desesterificación, expresada como porcentaje de corte de los ácidos grasos en posición sn-1 y sn-3. Los resultados indicaron que las condiciones óptimas para la actividad de la enzima fueron una temperatura de reacción de 61 °C, tiempo 10 min y la máxima cantidad de enzima que fue de 150 mg. Posteriormente, una muestra patrón de aceite de girasol enriquecida con trieicosapentanoina y tridocosahexanoina y un triacilglicerol estructurado con ácido caprílico y ácidos grasos poliinsaturados de origen marino fueron analizados en las condiciones de reacción óptimas previamente determinadas para la lipasa del Rhizomucor miehei. Los resultados obtenidos indicaron que la lipasa es capaz de cortar ácidos grasos en las posiciones sn-1 y sn-3, sin embargo, la velocidad de desesterificación está altamente influenciada por la composición en ácidos grasos de la matriz lipídica evaluada y por el posible efecto de equilibrio que provocan los productos que se generan en el transcurso de la reacción. En las matrices manteca de cacao y triacilglicerol estructurado fue posible determinar los ácidos grasos presentes en la posición sn-2 en forma indirecta, a partir de la determinación de los ácidos grasos presentes en las posiciones sn-1 y sn-3, mediante un método enzimático menos tóxico, simple y más rápido que el método oficial AOCS Ch 3-91 / The literature describes methods for positional analysis sn-2 triacylglycerols. The most used is based on the breakdown of fatty acids in the sn-1 and sn-3 positions using a pancreatic lipase, according to the official AOCS method Ch 3-91, however, is a laborious and expensive. Hence, it comes the need to develop a simpler method for routine analysis. The aim of this thesis is indirectly determining fatty acids located at the sn-2 position, with special emphasis on the long-chain polyunsaturated fatty acids by alternative enzymatic method using Rhizomucor miehei lipase. In the development of the optimization method the most suitable process to purify selected triacylglycerols using a glass chromatography column, where the aluminum oxide was the adsorbent and the eluent was diethyl ether. Furthermore, the enzyme reaction conditions were optimized with Rhizomucor miehei lipase cocoa butter given its fatty acid composition (25.3, 36.8 and 33.4 g / 100g for palmitic acid, stearic and oleic respectively) and known distribution SOS where unsaturated oleic acid preferably occupies the sn-2 position. The optimization was performed using a statistical design in which the independent variables were temperature, reaction time and amount of enzyme, while the dependent variable was the ability to des-esterification, expressed as a percentage cut of fatty acids in position sn-1 and sn -3. The results indicated that the optimum conditions for enzyme activity were a reaction temperature of 61 °C, time 10 min and the maximum amount of enzyme was 150 mg. Subsequently, a standard sample of sunflower oil and enriched with tri-eicosapentanoic and tri-docosahexanoic and a structured triacylglycerol with caprylic acid and polyunsaturated fatty acids of marine origin were analyzed in the optimal reaction conditions previously determined for the Rhizomucor miehei lipase. The results showed that the lipase is able to cut fatty acids in the sn-1 and sn-3 positions, however, the rate of des-esterification is highly influenced by the fatty acid composition of the lipid matrix and evaluated for the potential effect causing equilibrium products generated during the reaction. In cocoa butter and structured triacylglycerol it was possible to determine the fatty acids present in the sn-2 position indirectly from the determination of the fatty acids in the sn-1 and sn-3 positions, by an enzymatic method less toxic, simple and faster than the AOCS Official Method Ch 3-91 / Fondecyt

En aquest treball es presenten el resultats obtinguts en l'estudi de la producció de lipases per Candida rugosa amb l'objectiu de definir estratègies d'operació que millorin la productivitat. A més s'han desenvolupat metodologies de treball que poden ser aplicables a un ampli ventall de processos biotecnològics.La selecció del medi de cultiu i mode d'operació adients han permès millorar en 25 vegades el rendiment lipasa/substrat original. Aquesta millora ha estat possible gràcies a la definició o selecció d'estratègies d'operació utilitzant tècniques tals com el monitoratge, estimació i modelització del procés amb tècniques avançades.S'han dut a terme estudis per investigar els possibles millors inductors de la producció de lipases per Candida rugosa. D'aquesta manera, s'han provat àcids grassos de diferent longitud de cadena i s'ha pogut concloure que, des del punt de vista d'una aplicació industrial, l'àcid oleic és el millor substrat testat.S'ha investigat l'efecte de la font de nitrogen sobre el creixement i la producció de lipases. Malgrat que per a cultiu en discontinu tan sols s'observen petites diferències, en el cas de cultiu en continu la utilització d'una font de nitrogen alternativa a la de treballs previs ha estat crítica, la qual cosa ha permès solucionar els problemes operatius observats amb anterioritat.S'ha desenvolupat un model matemàtic, de caràcter dinàmic, que aglutina i organitza tota la informació del sistema. Aquest model és útil per a la simulació del procés, el seu control i eventualment el seu canvi d'escala, així com per la definició d'estratègies d'operació més adients.D'altra banda, s'han posat a punt les eines necessàries i l'entorn per a un sistema intel·ligent capaç de realitzar, en un procés de fermentació i en temps real, el processament de dades, actuació en tots els elements del procés, estimació de paràmetres i variables no mesurables directament, l'ús de coneixement heurístic del procés i aplicació d'estratègies de control avançat. Tot això permet la millora de las productivitats i rendiments en la producció de lipases, pas previ a una possible implementació del procés a nivell industrial. / En este trabajo se presentan los resultados obtenidos en el estudio de la producción de lipasa por Candida rugosa con el objetivo de definir estrategias de operación que mejoren la productividad. Se trataba, además, de desarrollar metodologías de trabajo que fueran aplicables a una amplia gama de procesos típicos de la biotecnología.En el presente trabajo la selección del medio de cultivo y modo de operación adecuado han permitido mejorar en 25 veces el rendimiento lipasa/substrato original. Esta mejora ha sido posible a partir de la definición o selección de estrategias de operación utilizando técnicas como la monitorización, estimación y modelización del proceso con técnicas avanzadas.Se han hecho estudios sobre los mejores inductores posibles de la producción de lipasas por Candida rugosa. Se han probado ácidos grasos de diferente longitud de cadena, concluyendo que desde el punto de vista de aplicación industrial, el ácido oleico es el mejor substrato investigado.Se ha investigado el efecto de la fuente de nitrógeno sobre el crecimiento y la producción de lipasas ha sido investigado. Si bien en cultivo en discontinuo tan sólo se han observado pequeñas diferencias, en cultivo en continuo ha sido decisiva la utilización de una fuente de nitrógeno alternativa a la de trabajos previos, lo que ha permitido solucionar los problemas operativos anteriormente observados.Se ha desarrollado un modelo matemático, de carácter dinámico, que aglutina y organiza toda la información del sistema. Este modelo es útil para la simulación del proceso, su control y, eventualmente, el cambio de escala, así como en la definición de las estrategias de operación más adecuadas.Por otro lado, se han puesto a punto las herramientas necesarias y el entorno para un sistema inteligente capaz de realizar, en un proceso de fermentación y en tiempo real, el procesamiento de datos, actuar en todos los elementos del proceso, estimar parámetros para variables no medibles directamente, el uso de conocimiento heurístico del proceso y aplicar estrategias de control avanzado. Ello permite la mejora de la productividad en la producción de lipasas, paso previo para una posible implementación a nivel industrial. / In this work, the results obtained in lipase production by Candida rugosa are presented. In order to increase the productivity of the process, different operational strategies were defined and tested. The general purpose has been to develop methodologies able to be implemented in a wide range of typical biotechnological processes.The selection of culture medium and a suitable operational mode has allowed to obtain 25 times fold higher the original enzyme yield. This improvement has been possible using engineering approaches such as the selection and definition of operational strategies by using advanced techniques as monitoring, estimation and process modelling. In order to know the best inducers of lipase production by Candida rugosa different short chain fatty acids have been tested. From the point of view of industrial application, oleic acid has been considered as the best substrate tested.The effect of nitrogen sources on the growth and lipase production has been investigated. In batch culture, only slight differences have been observed. However, the use of an alternative nitrogen source in continuous culture has been critical in order to solve the operational stability problems appeared.A mathematical model with dynamic characteristics that compiles, organizes and structures all the information of the system has been developed. This model is useful for simulation, control and even scale-up of the process, including the definition of the most suitable operational strategies.Moreover, it has been developed the shell and necessary tools for an intelligent system capable to perform real-time fermentation data processing, actuate all the elements of the process, estimate parameters for non-measurable variables, use heuristic knowledge of the process and apply advanced control strategies. It allowed the improvement of the lipase productivity as a previous step in order to establish industrial implementation.

El presente trabajo investigó la adición de un inóculo de Pseudomonas aeruginosa en ciertos efluentes grasos recolectados de locales de expendio de comida rápida. Se consideró evaluar el comportamiento del inóculo en un medio apropiado que estimule o facilite la biodegradación de lípidos como parte de un futuro proceso de tratamiento de desechos. Para esto se utilizó el método de titulación con NaOH 0.05 N mediante el cual se cuantificó la cantidad de ácidos grasos liberados debido a la actividad de las lipasas de Pseudomonas. Los parámetros a evaluar fueron: temperatura, tiempo de incubación, pH inicial, concentración de sales y cantidad de inóculo (% V/V). Se comprobó que los mejores resultados (0,823, 0,747 y 0,781 U) se dieron con una temperatura de 37 ºC, un tiempo de 24 h y un pH inicial de 7. Los resultados mostraron que con tiempos mayores a 24 h (48 y 72 h) la actividad de enzima decrece y esto puede ser debido a la acción de otras enzimas por medio de los cuales Pseudomonas consume también los ácidos grasos liberados y por consiguiente se reduce la cantidad de NaOH usada para el punto final. Palabras clave: Efluentes grasos, Tratamiento de desechos grasos, Pseudomonas aeruginosa, lipasas.

Inmoviliza por adsorción interfacial la lipasa producida por Marinobacter sp en el soporte hidrofóbico octadecilo-sepabead. Para ello, se empleó la lipasa extracelular producida por Marinobacter sp en medio agua de sales conteniendo extracto de levadura al 0,5%, NaCl al 5%, aceite de olivo al 1 %, triton x-100 al 0,1 % a 37 ° C. Para optimizar la actividad de la enzima y entender la significancia de la interacción de los factores que afectan la actividad de la lipasa tanto libre como inmovilizada se utilizó la metodología de superficie respuesta. La lipasa de Marinobacter sp expreso máxima actividad específica de hidrólisis del para-nitrofenil palmitato (p-NPP) en buffer fosfato pH 7,0 a 37 °C y 30 min en ausencia de NaCl y CaCl2. El diseño experimental Box-Behnken a 3 factores y 3 niveles se empleó para evaluar el efecto de los parámetros de inmovilización tales como pH a 6,0; 7,0; y 8,0; tiempo a 30, 60 y 120 min; fuerza iónica a 2,5, 5,0 y 10,0 mM. El proceso de inmovilización óptimo se realizó a pH 6,62, 30 min y fuerza iónica 10 mM, los datos se ajustaron al modelo polinomial cuadrático. Las condiciones óptimas de inmovilización fueron 15 mg de proteína total conteniendo la lipasa por gramo de soporte de octadecilosepabead, cuyo rendimiento fue 74 %. Además, se evaluó el efecto de la temperatura y el pH en la actividad enzimática de la lipasa inmovilizada según el diseño compuesto central a dos factores y 3 niveles. Así, la máxima actividad se obtuvo a pH 7,0 y 50 °C. Finalmente, la estabilidad térmica de la lipasa inmovilizada de Marinobacter sp retuvo 80 % de su actividad después de 24 horas a pH 7,0 y 40 °C. / Tesis