L’administration intraveineuse d’ADN thérapeutique rencontre de nombreux obstacles liés à sa dégradabilité, ainsi qu’à sa difficulté à pénétrer les cellules en raison de sa taille importante et de son hydrophilie. Des lipoplexes conjugués à de l’acide hyaluronique (HA) de haut poids moléculaire ont été développés afin de délivrer de l’ADN plasmidique à l’intérieur de cellules cancéreuses exprimant le récepteur membranaire CD44, récepteur clé du développement tumoral. L’emploi d’HA conjugué au phospholipide DOPE (HA-DOPE) et d’un plasmide modèle GFP a permis d’obtenir des lipoplexes d’environ 250 nm, chargés négativement, protégeant efficacement l’ADN contre les nucléases et activant peu la fraction C3 du système du complément. Dans un modèle cellulaire exprimant CD44, la transfection optimale a été obtenue par l’utilisation de lipides avec 10% d’HA-DOPE complexés à de l’ADN selon un rapport 2:1. Ces lipoplexes sont internalisés par la voie des cavéoles et de façon dépendante du récepteur CD44. Cette formulation a été appliquée à la vectorisation d’un gène thérapeutique, codant pour le récepteur des estrogènes β (ERβ), qui est un potentiel suppresseur de tumeur. Sur un modèle in vivo de xénogreffes de cellules humaines de cancer du sein estrogéno-dépendant et exprimant CD44, la diminution du volume tumoral, ainsi que de l’indice de prolifération Ki67 ont permis de montrer l’effet anticancéreux par voie intraveineuse des lipoplexes conjugués à l’HA. / Intravenous administration of therapeutic DNA faces many obstacles related to its degradability and its difficulty to penetrate into the cells due to its large size and its hydrophilicity. Lipoplexes conjugated with high molecular weight hyaluronic acid (HA) have been designed in order to deliver plasmid DNA inside cancer cells expressing the membrane receptor CD44, a key receptor in the development of tumors. The use of HA conjugated to the phospholipid DOPE (HA-DOPE) and of the GFP model plasmid lead to obtain lipoplexes around 250 nm, negatively charged, which efficiently protect the DNA against nucleases and slightly stimulate the C3 fraction of the complement system. In a cellular model expressing CD44, the optimal transfection was obtained by using lipids containing 10% of HA-DOPE complexed to DNA at a 2:1 ratio. Internalization of these lipoplexes is mediated by the caveolae pathway and involves the CD44 receptor. This formulation was applied to the delivery of a therapeutic gene encoding the estrogen receptor β (ERβ), which is a potential tumor suppressor. On an in vivo xenograft model of estrogen-dependent breast cancer cells expressing CD44, decrease of the tumor volume, as well as decrease of the Ki67 proliferation index, have shown the anticancer activity of the lipoplexes conjugated to HA following intravenous administration.

L'administration intraveineuse d'ADN thérapeutique rencontre de nombreux obstacles liés à sa dégradabilité, ainsi qu'à sa difficulté à pénétrer les cellules en raison de sa taille importante et de son hydrophilie. Des lipoplexes conjugués à de l'acide hyaluronique (HA) de haut poids moléculaire ont été développés afin de délivrer de l'ADN plasmidique à l'intérieur de cellules cancéreuses exprimant le récepteur membranaire CD44, récepteur clé du développement tumoral. L'emploi d'HA conjugué au phospholipide DOPE (HA-DOPE) et d'un plasmide modèle GFP a permis d'obtenir des lipoplexes d'environ 250 nm, chargés négativement, protégeant efficacement l'ADN contre les nucléases et activant peu la fraction C3 du système du complément. Dans un modèle cellulaire exprimant CD44, la transfection optimale a été obtenue par l'utilisation de lipides avec 10% d'HA-DOPE complexés à de l'ADN selon un rapport 2:1. Ces lipoplexes sont internalisés par la voie des cavéoles et de façon dépendante du récepteur CD44. Cette formulation a été appliquée à la vectorisation d'un gène thérapeutique, codant pour le récepteur des estrogènes β (ERβ), qui est un potentiel suppresseur de tumeur. Sur un modèle in vivo de xénogreffes de cellules humaines de cancer du sein estrogéno-dépendant et exprimant CD44, la diminution du volume tumoral, ainsi que de l'indice de prolifération Ki67 ont permis de montrer l'effet anticancéreux par voie intraveineuse des lipoplexes conjugués à l'HA.

Des progrès récents dans l’utilisation préclinique et clinique des petits ARN interférents (siRNA) ont montré leur potentiel en tant qu’inhibiteur de la synthèse protéique dans de nombreuses pathologies comme le cancer. L’administration des siRNA rencontre un certain nombre de problèmes liés à leur dégradation rapide dans les milieux biologiques, ainsi qu’à leur difficulté à pénétrer au sein des cellules cibles en raison de leur hydrophilie et de leur charge négative. Une des clés de l’amélioration de l’efficacité thérapeutique de ces molécules repose sur l’emploi de vecteurs. Au cours de cette thèse, des lipoplexes capables de protéger les siRNA contre la dégradation et de favoriser leur transport jusqu’aux cellules cibles ont été développés et optimisés. Pour ce faire, des lipoplexes recouverts d’HA ont été formulés pour la vectorisation active de siRNA vers des cellules tumorales surexprimant le récepteur CD44. Dans la première partie de cette thèse, la formation des lipoplexes a été étudiée, ainsi que les paramètres influençant leur organisation supramoléculaire. L'insertion de l'HA dans la structure du liposome au moment de la formation des vésicules a entraîné une augmentation de la taille des liposomes en fonction de la concentration d’HA. Leur complexation avec les siRNA a encore augmenté la taille des particules obtenues. L’ajout des acides nucléiques lors de la formation des lipoplexes a provoqué un déplacement d'une partie du conjugué HA-DOPE de la structure des lipoplexes, comme montré par électrophorèse capillaire. La titration calorimétrique isotherme et les études de diffraction des rayons X ont démontré que, sous l’effet des interactions électrostatiques avec les siRNA, un réarrangement des bicouches lipidiques a lieu, conduisant à la formation de vésicules oligolamellaires, confirmé visuellement par cryo-microscopie. Enfin, le positionnement convenable de l’HA sur la surface des lipoplexes et sa capacité de se lier spécifiquement aux récepteurs de CD44 ont été démontrés par la technique de résonance plasmonique de surface. Dans la deuxième partie de cette thèse, la capture cellulaire et localisation intracellulaire des lipoplexes-HA ont été évalués par cytométrie en flux et microscopie de fluorescence, et ont montré que les lipoplexes modifies par l’HA sont internalisés plus rapidement que les lipoplexes non modifiés, et une fois dans des cellules, ils sont localisés principalement à l’intérieur des endosomes. La capacité des lipoplexes à transporter des molécules de siRNA intactes au cytoplasme a été confirmée par 81 % d'inhibition d'expression de luciferase in vitro sur la lignée cellulaire de cancer du poumon A549-luc. In vivo, le traitement avec les lipoplexes-HA transportant un siRNA anti-luciferase a mené à une diminution statistiquement significative de l’expression de luciferase, ce qui a été confirmé par la réduction de l'expression d’ARNm de la luciferase dans le poumon des animaux traités avec les lipoplexes-HA. L'analyse de la distribution des lipoplexes dans les poumons a montré que les lipoplexes modifiés par l’HA sont distribués de façon plus importante et plus homogène dans le tissu pulmonaire que les lipoplexes non modifiés. Dans la troisième partie de cette thèse, la diffusion des lipoplexes-HA de siRNA dans le mucus a été étudié, afin d’évaluer la faisabilité de l’administration pulmonaire de ces particules. Les études utilisant la technique de « multiple particle tracking (MPT) » ont montré que la présence d’HA combinée à l'ajout de siRNA ont permis l’obtention de deux formulations de lipoplexes présentant une pénétration efficace dans le mucus, les lipoplexes-HA and les lipoplexes-PEG/HA. En conclusion, un système efficace de lipoplexes utilisant siRNA pour l'inhibition de l'expression génique ciblant les récepteurs CD44 a été développé. Les résultats obtenus confirment que les HA-lipoplexes sont capables de libérer efficacement le siRNA dans le cytoplasme des cellules in vitro et in vivo. / Recent progresses in the preclinical and clinical use of small interfering RNA (siRNA) have shown their potential as an inhibitor of protein synthesis in many diseases such as cancer. The administration of siRNA encounters a number of problems related to their rapid degradation in biological media, and their difficulty in penetrating targeted cells due to their hydrophilicity and negative charge. A key to improving the therapeutic efficacy of these molecules is based on the use of vectors. In this thesis, lipoplexes that can protect siRNA against degradation and facilitate their transport into target cells were developed and optimized. To do this, lipoplexes covered with HA were formulated for active vectorization of siRNA to tumor cells overexpressing the receptor CD44.In the first part of this thesis, the formation of lipoplexes was studied, and the parameters influencing their supramolecular organization. Insertion of HA within the liposome structure during vesicle formation resulted in the increase in liposome size as a function of HA concentration. Their complexation with siRNA has further increased the size of the particles obtained. The addition of siRNAs when forming lipoplexes caused a displacement of a portion of the HA-DOPE conjugate from the lipoplexes structure, as shown by capillary electrophoresis. The isothermal titration calorimetry and X-ray diffraction studies showed that a rearrangement of the lipid bilayers occur under the effect of electrostatic interactions with siRNAs, leading to the formation of oligolamellar vesicles, which was visually confirmed by cryo-microscopy. Finally, the proper positioning of the HA on the surface of the lipoplexes and its ability to specifically bind to the CD44 receptors has been demonstrated by the surface plasmon resonance technique.In the second part of this thesis, cellular uptake and intracellular localization of HA-lipoplexes were assessed by flow cytometry and fluorescence microscopy, and showed that lipoplexes modified by HA are internalized more rapidly than unmodified lipoplexes, and once in the cells, they are mainly localized within the endosomes. The ability of lipoplexes to transport intact siRNA molecules to the cytoplasm was confirmed by 81% of luciferase in vitro expression inhibition on the lung cancer cell line A549-luc. In vivo, treatment with HA-lipoplexes carrying anti-luciferase siRNA led to a statistically significant decrease in expression of luciferase, which was confirmed by reducing the mRNA expression of luciferase in lungs of animals treated with HA-lipoplexes. The analysis of the distribution of lipoplexes in the lungs showed that lipoplexes modified with HA are distributed more evenly in the lung tissue than unmodified lipoplexes.In the third part of this thesis, the movement of siRNA HA-lipoplexes in the mucus was studied to assess the feasibility of administering these particles directly to the lungs. Studies using the technique of "multiple particle tracking (MPT)" showed that the presence of HA combined with the addition of siRNA allowed the preparation of two lipoplexes formulations with efficient mucus-penetration, HA-lipoplexes and PEG/HA-lipoplexes.In conclusion, an efficient siRNA lipoplex system for inhibiting gene expression targeted TO the CD44 receptorS has been developed. The results confirm that the HA-lipoplexes are able to effectively release in vitro and in vivo the siRNA molecules in the cytoplasm of cells.

Les travaux présentés dans ce mémoire portent sur la synthèse et à l'étude physico-chimique et biologique de nouveaux tensioactifs fluorés pour la conception de vecteurs non-viraux ayant un intérêt dans le domaine de l'interférence ARN. Dans un premier temps, en se basant sur l'expérience du laboratoire et sur l'étude des vecteurs existants, nous avons proposé un design moléculaire pour la synthèse d'amphiphiles bicaténaires géminis et monocaténaires. La synthèse a été réalisée par des méthodes simples et offre de bons rendements. Les tensioactifs préparés comportent des chaines grasses fluorées pour leurs propriétés spécifiques et des motifs polyaminés ou oxyéthylènique comme partie polaire. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés aux propriétés physico-chimiques de ces familles de molécules. Les tensioactifs géminis sont insolubles dans l'eau et forment des monocouches de Langmuir stables à l'interface air/eau. L'étude de ces monocouches révèle que l'organisation à l'interface est fortement dépendante du bras espaceur entre les deux chaines grasses fluorées. Les molécules monocaténaires quant à elles sont solubles dans l'eau, montrent une forte activité de surface et forment spontanément des vésicules en solution. Nous avons ensuite étudié l'interaction entre les produits synthétisés et un petit monobrin d'ADN de 23 bases. Une interaction relativement forte a été mise en évidence pour la plupart des molécules et nous avons essayé de relier la structure de ces molécules aux propriétés physico-chimiques et biologiques observées. Enfin, des tests préliminaires de viabilité cellulaire ont été effectués sur des cellules issues de poumon humain et montrent une bonne viabilité cellulaire pour des concentrations d'utilisation clinique classiques et une bonne stabilité dans le temps. Ces travaux laissent entrevoir un bon potentiel de vectorisation pour ces tensioactifs fluorés mais cela nécessite encore des études complémentaires comme la caractérisation complète des complexes formés avec l'ADN ainsi que des tests de toxicité cellulaire avant le moindre essai de transfection. / The work presented in this paper focus on the synthesis and characterization of physico-chemical properties of original fluorocarbon surfactants for obtaining nanovectors models to determine the qualifications required for efficient transport of oligonucleotides in the field of RNA interference. Building on the extensive work reported in the literature and the laboratory expertise in the field of fluorinated amphiphiles, we are interested in the synthesis of two major families of compounds. One corresponds to compounds of Géminis type with two fluorocarbon chains, two polar head groups derived from carboxylic acids and an oxyethylene or polyamine spacer arm. The structure of these compounds is conducive to the formation of stable Langmuir films that used to study interactions with the oligonucleotide. The second family corresponds to monocatenar counterparts who spontaneously self-assembled in vesicles, that is to say 3D models nanovectors. The characterization of the behavior at the air / water interface or in solution of these different molecules in the presence and absence of oligonucleotide allowed us to establish a number of relationships between molecular structure, physicochemical properties and complexation of the oligonucleotide. Preliminary tests of cell viability were performed on cells from human lung and have shown good cell viability at conventional clinical used concentrations and good stability over time. These studies suggest good potential for vectorization of these fluorinated surfactants but that still requires further study as the full characterization of complexes formed with DNA as well as tests for toxicity before testing cell transfection.

Several approaches have been employed for directing the intracellular trafficking of DNA to the nucleus. Cationic polymers have been used to condense and deliver DNA and a few specific examples using chitosan as cationic polymer have been described. The concerted efforts in gene therapy to date have provided fruitful achievements toward a new era of curing human diseases. A number of obstacles, however, still must be surmounted for successful clinical applications. Therefore, chitosan-plasmid and quaternised chitosan-plasmid complexes (polyplexes) were investigated for their ability to transfect COS-1 cells and the results were compared with Transfectam/DNA lipoplexes for transfection efficiency. All of the chitoplexes utilised in this study proved to transfect COS-1 cells, however to a lesser extent than the Transfectam/DNA lipoplexes, which served as a positive control. Complexes formed with quaternised trimethyl and triethyl chitosan oligomers, specifically TMO L and TEO L, proved to be superior transfecting agents compared to other chitosans. The molecular mass of chitosan is considered to influence the stability of the chitosan/DNA polyplex, the efficiency of cell uptake and the dissociation of DNA from the complex after endocytosis. In literature it was shown that the toxicity of the chitosan1DNA polyplexes is relatively low compared to viral gene and lipid non-viral delivery vectors. This study showed that the percentage viable COS-1 cells when transfected with the chitosan polymers, oligomers, quaternised chitosan polymers and quaternised chitosan oligomers (chitoplexes) was higher than the percentage viable cells when transfected with lipoplexes prepared with Transfectam with the MTT assay. The Transfectam/DNA lipoplexes induced cell damage and a decreased viability of COS-1 cells were found. Chitosan/DNA and quaternised chitosan/DNA complexes did not affect the viability of the cell line. The degree of quaternisation of the polymers and oligomers and molecular size proved to be two important factors when considering effective non-viral gene delivery. It can be concluded that chitosan, especially quaternised oligomeric derivatives are polysaccharides that demonstrate much potential as a gene delivery system. The high solubility and low toxicity of chitosan allow its use in a wide variety of applications in the pharmaceutical industry and, as shown in this study, in gene delivery. / Thesis (Ph.D. (Pharmaceutics))--North-West University, Potchefstroom Campus, 2006.

Several approaches have been employed for directing the intracellular trafficking of DNA to the nucleus. Cationic polymers have been used to condense and deliver DNA and a few specific examples using chitosan as cationic polymer have been described. The concerted efforts in gene therapy to date have provided fruitful achievements toward a new era of curing human diseases. A number of obstacles, however, still must be surmounted for successful clinical applications. Therefore, chitosan-plasmid and quaternised chitosan-plasmid complexes (polyplexes) were investigated for their ability to transfect COS-1 cells and the results were compared with Transfectam/DNA lipoplexes for transfection efficiency. All of the chitoplexes utilised in this study proved to transfect COS-1 cells, however to a lesser extent than the Transfectam/DNA lipoplexes, which served as a positive control. Complexes formed with quaternised trimethyl and triethyl chitosan oligomers, specifically TMO L and TEO L, proved to be superior transfecting agents compared to other chitosans. The molecular mass of chitosan is considered to influence the stability of the chitosan/DNA polyplex, the efficiency of cell uptake and the dissociation of DNA from the complex after endocytosis. In literature it was shown that the toxicity of the chitosan1DNA polyplexes is relatively low compared to viral gene and lipid non-viral delivery vectors. This study showed that the percentage viable COS-1 cells when transfected with the chitosan polymers, oligomers, quaternised chitosan polymers and quaternised chitosan oligomers (chitoplexes) was higher than the percentage viable cells when transfected with lipoplexes prepared with Transfectam with the MTT assay. The Transfectam/DNA lipoplexes induced cell damage and a decreased viability of COS-1 cells were found. Chitosan/DNA and quaternised chitosan/DNA complexes did not affect the viability of the cell line. The degree of quaternisation of the polymers and oligomers and molecular size proved to be two important factors when considering effective non-viral gene delivery. It can be concluded that chitosan, especially quaternised oligomeric derivatives are polysaccharides that demonstrate much potential as a gene delivery system. The high solubility and low toxicity of chitosan allow its use in a wide variety of applications in the pharmaceutical industry and, as shown in this study, in gene delivery. / Thesis (Ph.D. (Pharmaceutics))--North-West University, Potchefstroom Campus, 2006.

Endosome is a major barrier to efficient gene transfection by synthetic vectors because if the vectors are trapped in the endosome, they will traffic to the lysosome where the DNA is enzymatically degraded. Our hypothesis which serves as the rationale for the design of ortho ester-based lipids and lipoplexes is that cationic lipids which can quickly hydrolyze into membrane-destabilizing fragments in response to a small drop of pH should improve the gene transfection efficiency by facilitating the endosome escape. We designed and synthesized five ortho ester-based acid-labile cationic lipids ( 1-5 ) and developed nine lipoplexes comprising the five lipids. HPLC and LC/MS studies revealed that the ortho ester linkage in lipids ( 1-5 ) hydrolyzed at mildly acidic endosomal pH 5.5. Dioleyl glycerol was identified to be the major hydrolysis product of lipids 1, 2, and 3 . Oleoyl alcohol and 1-oleyloxy-2-trimethylamionium-3-propanol were identified to be the major hydrolysis products of lipids 4 and 5 . Photon Correlation Spectrometry (PCS) studies revealed that acidic endosomal pHs triggered the aggregation of lipoplexes comprising 1, 2, and 3 . Lipoplexes comprising 4 and 5 retained their size over 50 hours at acidic pHs. The fluorescence assay indicated that the ortho ester-based lipoplexes comprising lipids 1, 2, and 3 quickly destabilized a model biomembrane in response to the acidic pH. Acidic pH did not cause the membrane destabilization by lipoplexes comprising 4 and 5 . These results demonstrate that ortho ester-based lipoplexes comprising lipids 1, 2, and 3 hydrolyze into membrane-destabilizing fragments in response to acidic pH. Luciferase gene transfection was conducted on CV-1cultured cells. The lipoplexes comprising ortho ester-based cationic lipids 1, 2, and 3 significantly enhanced the luciferase gene expression. Two lipoplexes 2 /DOPE/DNA and 3 /DOPE/DNA mediated 45-fold and 116-fold, respectively, higher luciferase expression in CV-1 cells compared to the pH-insensitive lipoplex DOTAP/DOPE/DNA. The gene transfection efficiency correlates well with the pH-triggered membrane-destabilization by the ortho ester-based lipoplexes.

Le sujet de cette thèse concerne l'élaboration de vecteurs fonctionnels de transfert de gènes destinés à la thérapie génique de tumeurs.<br />Deux familles de vecteurs synthétiques fonctionnels ont été synthétisées afin d'améliorer d'une part la biodisponibilité des vecteurs dans les applications in vivo et d'autre part leur spécificité de ciblage des tissus tumoraux. <br />La première famille de composés est constituée de télomères et de cotélomères « furtifs » issus des réactions de (co)télomérisation. Le design des télomères est basé sur un squelette « diblock » composé d'une partie polyaminée de degré de télomérisation aléatoire et d'une partie hydrophile (polyéthylène glycol). Le design des cotélomères est basé sur un squelette aléatoire de motifs aminés et de structures hydrophiles (tétraéthylène glycol et trishydroxyméthyl). La deuxième famille de vecteurs synthétiques est issue de la synthèse de lipides et polymères cationiques conjugués à un ligand dérivé de l'antagoniste des récepteurs à chimiokines CXCR-4, l'AMD3100 ou bicyclame.<br />Le potentiel des (co)télomères « furtifs » en tant qu'agents de condensation et de transfert de gènes a été évalué in vitro sur des cellules de carcinome pulmonaire humain A549.<br />Le potentiel des conjugués ciblés lipidiques et polymériques à compacter l'ADN et à transfecter de manière spécifique des cellules par la voie récepteur médiée a été évalué à la fois sur des cellules n'exprimant pas le récepteur CXCR-4 (A549, T98G) et sur des cellules l'exprimant (Jurkat).<br />Certains des (co)télomères « furtifs » testés (PEG2000-[NH2]n) ont démontré des efficacités de transfection comparables à des formulations lipidiques de référence (pcTG90/DOPE) tout en étant moins toxiques. Parmi les conjugués ciblés, le cotélomère iBu-[NH]80-[AMD]4 s'est révélé être un agent de transfert de gènes spécifique sur les cellules Jurkat sous certaines conditions de formulations, par rapport aux lipides et polymères conventionnels.<br />Mots clés : thérapie génique, transfert de gènes, lipoplexes, polyplexes, polyéthylène glycol, biodisponibilité, AMD-3100, ciblage, transfection.<br />Discipline : Chimie.

Une nouvelle approche thérapeutique est de moduler l'expression d'un gène en ciblant l'ARN messager par des oligonucléotides antisens et des siRNA. Nous avons étudié des formulations à base de lipides cationiques, formant des complexes particulaires avec les acides nucléiques (lipoplexes) et aux propriétés transfectantes. Nous avons l'unique possibilité dans notre laboratoire de formuler les oligonucléotides dans des lipoplexes soit chargés positivement, soit chargés négativement. Nous avons démontré qu'ils protégent et vectorisent efficacement les acides nucléiques dans les cellules in vitro ainsi in vivo. Ces vecteurs synthétiques possèdent de nombreux avantages : particules homogènes et de faible taille, reproductibilité, faible toxicité, stabilité au cours du temps et efficacité en présence de sérum. Nous avons appliqué ces vecteurs à la délivrance d'oligonucléotides antisens et de siRNA in vitro, respectivement dans un modèle de correction de l'épissage alternatif contenant l'intro aberrant de la B-thalassémie et dans un modèle de cancer du sein. Nos résultats démontrent une grande efficacité de délivrance des oligonucléotides via nos vecteurs lipidiques dans les 2 modèles, à faible concentration et en présence de sérum. Enfin, nous avons étudié le mécanisme d'entrée dans les cellules in vitro et évalué la proportion de transport actif (principalement endocytose), de transport passif (principalement fusion) et de fixation à la membrane des lipoplexes : celles-ci semblent dépendre du temps et du milieu de transfection, du type de formulation, de la charge ainsi que de la taille des complexes. Des études in vivo doivent être poursuivies pour évaluer l'efficacité et les propriétés respectives des différentes formulations développées, dans les modèles de correction de l'épissage alternatif et de cancer du sein.

Orientador: Maria Helena Andrade Santana / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-08T14:24:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Torre_LucimaraGazioladela_D.pdf: 28769884 bytes, checksum: 485f026c87d2f5b4fb99e642474200d0 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Este trabalho visa o desenvolvimento tecnológico de uma vacina gênica, destinada ao combate à tuberculose, na qual o DNA encontra-se veiculado em lipossomas. Foram enfocados três aspectos principais: 1.A preparação e caracterização de estruturas lipídicas funcionais veiculando o DNA, projetadas para atenderem aos requisitos de imunização contra a tuberculose; 2. Complexação do DNA com peptídio sintético promotor de transporte nuclear e veiculação na estrutura lipossomal que se mostrou mais promissora nos ensaios in vitro e in vivo realizados no CPT-RP. 3. Análise do escalonamento da produção da estrutura lipossomal mais promissora para subsequente veiculação do DNA. Duas estruturas lipossomais foram compostas por lipídios com as seguintes funcionalidades: estrutural, de incorporação do DNA e atração eletrostática com a superfície das células, de intensificação da liberação do DNA no citoplasma celular. Foram preparadas pelo método da desidratação-rehidratação, gerando DRVs (¿dehydrated-hydrated vesicles¿). O DNA foi associado à essas estruturas, localizando-se no interior, [DRV(DNA)] ou prefencialmente na sua superfície [DRV-DNA]. A terceira estrutura, um agregado lipídico não lipossomal designado por lipoplexo, foi preparado na ausência do lipídio estrutural, contendo o DNA associado em toda a sua superfície. As estruturas foram caracterizadas através do seu diâmetro hidrodinâmico e distribuição de tamanhos, razão de cargas para completa incorporação do DNA, carga superficial, transição de fases, acessibilidade de sonda de fluorescência ao DNA e morfologia. O peptídio sintético com seqüência não convencional foi associado à estrutura DRV-DNA. O escalonamento da produção de lipossomas foi analisado através de dados experimentais e simulação matemática da cinética de produção de lipossomas em sistema multitubular. Dos resultados conclui-se que a estrutura DRV-DNA é promissora para a produção de vacina contra a tuberculose tanto pela sua efetividade biológica quanto do ponto de vista tecnológico / Abstract: This work contributes to the technological development of a gene vaccine against tuberculosis, where DNA is transported within liposomes. The three main aspects focused on were: 1. Functional lipid structures for DNA delivery were prepared and characterized in the attempt to obtain immunization standards against tuberculosis; 2. The best lipid structure was chosen from in vitro and in vivo assays performed in the ¿Centro de Pesquisas em Tuberculose de Ribeirão Preto¿ ¿ CPT-RP. A synthetic peptide that promotes nuclear transport was complexed to DNA and included into the best lipid structure. 3. Scale up analysis for the production of the best lipid structure that was used for DNA delivery. Two types of liposomes were composed by lipids with the following properties: (i) structure, (ii) DNA incorporation and electrostatic attraction with cell surface, and (iii) helper, that facilitates the DNA release to the citosol. These structures were prepared by the dehydrated-hydrated method, generating DRVs (dehydrated-hydrated vesicles). The DNA was associated in the inner compartment, [DRV(DNA)], or mostly at the surface [DRV-DNA] of these structures. The third structure, a lipid aggregate that does not form liposomes and was named lipoplex, was prepared in the absence of the structural lipid, used in previous preparations, which contained DNA associated with all of the aggregate¿s surface. The physico-chemical characterization of the structures were based on the hydrodynamic diameter and size distribution of the lipid particles, charge ratio for DNA incorporation into the lipid structure, surface charge, phase transition temperatures, the fluorescent probe accessibility to DNA and morphology of the particles. A synthetic peptide, with non-conventional sequence was associated to the DRV-DNA structure. The scale up for the liposome production was analyzed through the acquisition of experimental data and mathematical simulation of the liposomes production in a multitubular system. The results demonstrate that the incorporation of DNA into a lipid structure is very promising as a tuberculosis vaccine, especially in regards to the complexation of DNA with empty DRVs. The technological aspects of scaling up also confirm the viability of preformed liposomes production / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química