Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à l‘étude, par spectroscopie optique, des interactions que peuvent avoir des acides nucléiques entre eux ou avec des surfaces de différentes natures telles que des protéines ou des nanoparticules inorganiques. Dans une première partie, nous présentons une étude structurale, réalisée par spectroscopies UV et IR sur des séquences nucléotidiques contenues dans DsrA, un ARN non-codant. Plusieurs modèles d‘auto-association sont proposés. Dans une deuxième partie, l‘association de la protéine Hfq avec un duplexe dA₂₀-dT₂₀ est étudiée par spectroscopie IR. Cette interaction se produit via une ouverture partielle de la double-hélice et une transition conformationnelle des sucres du brin purine. Dans une troisième et quatrième partie, nous nous intéressons à la vectorisation d‘oligonucléotides et de peptides. Différentes stratégies de fonctionnalisation de surface de nanoparticules de maghémite sont explorées et l‘efficacité des nano-vecteurs est évaluée in vitro. / In this work, we were interested in the study, by optical spectroscopy, of the interactions that may have nucleic acids between them or with surfaces of various types such as proteins, or inorganic nanoparticles. In the first part, we present a structural study by UV and IR spectroscopy on nucleotide sequences contained in DsrA, a non-coding RNA. Several models of self-association are proposed. In the second part, the association of the Hfq protein with a duplex dA₂₀-dT₂₀ is studied by IR spectroscopy. This interaction occurs via a partial opening of the double-helix and a conformational transition of the sugars of the purine strand. In the third and fourth part, we are interested in the vectorization of oligonucleotides and peptides. Different strategies of maghemite nanoparticles surface functionalization are explored and the effectiveness of nano-vectors is assessed in vitro.

Le travail présenté dans ce manuscrit s’inscrit dans une stratégie de vectorisation d’agents diagnostiques et thérapeutiques, vers les protéoglycanes du chondrosarcome, via une structure chimique de reconnaissance : un ammonium quaternaire. Nous nous sommes intéressés aux deux aspects de la prise en charge du chondrosarcome : l’aspect diagnostique par imagerie scintigraphique et l’aspect thérapeutique. Pour l’imagerie, nous avons validé l’intérêt du radiotraceur 99m Tc-NTP 15-5 dans le diagnostic précoce, le staging et le suivi de la réponse au traitement dans un modèle de chondrosarcome de rat. Ce dernier démontre une accumulation spécifique et rapide au niveau du tissu tumoral, et ce, dès les stades précoces de la pathologie. Actuellement en phase de transfert vers la clinique pour la pathologie de l’arthrose, nos résultats ont permis de proposer une extension de l’application au chondrosarcome. Pour la thérapie, nous avons confirmé, in vitro, que la greffe du vecteur ammonium quaternaire, sur un agent alkylant, le melphalan, ne modifiait pas son activité cytotoxique. In vivo, les résultats obtenus avec le dérivé ammonium quaternaire du melphalan, ont mis en évidence un ralentissement net de la croissance tumorale associée à une diminution considérable du syndrome myélodysplasique associé au traitement. Ces résultats prouvent tout l’intérêt de la vectorisation pour l’amélioration de l’index thérapeutique et nous ont permis de valider la preuve de concept pour la vectorisation d’agent cytotoxique. Une autre approche de thérapie a consisté à greffer le vecteur sur des dérivés du cyclophosphamide clivables en hypoxie. Parmi les composés synthétisés, l’un d’entre eux a montré, in vitro, un différentiel de cytotoxicité hypoxie/normoxie intéressant. Son évaluation in vivo dans le modèle de xénogreffe de chondrosarcome HEMC-SS a démontré une inhibition importante de la croissance tumorale. En nous intéressant à l’environnement hypoxique de la tumeur, nous offrons ainsi une approche encore plus spécifique de la thérapie. L’ensemble de ces travaux offrent un véritable espoir pour le management du chondrosarcome, pathologie certes rare mais néanmoins redoutable. / Our strategy consists in using the quaternary ammonium function, that exhibits a high affinity for proteoglycans of extracellular matrix, as a selective carrier to chondrosarcoma of (i) radioisotopes for a targeted in vivo imaging or (i) cytotoxics for a targeted therapeutic approach. For diagnosis application, a radiotracer radiolabeled with 99m Tc ( 99m Tc-NTP 15-5) was designed and tested in vivo in an orthotopic Swarm chondrosarcoma model. For therapeutic application, a quaternary ammonium derivative of melphalan, Melphalan-AQ, was synthesized and assessed in vitro (cytotoxic activity, cell cycle distribution) and in vivo in the orthotopic Swarm chondrosarcome model (antitumor efficacy, toxicity). Since chondrosarcoma is characterized by hypoxia, research was focused on the vectorization of hypoxia-activated prodrugs. For diagnosis, 99m Tc-NTP 15-5 radiotracer highly accumulated in tumoral tissue at very early stage of pathology while no palpable nor measurable tumor could be assessed. For therapy, chondrosarcoma bearing rats treated with Melphalan-AQ showed a significant tumor growth inhibition with associated heamatological side effects being significantly reduced as compared to Melphalan. Among all phosphoramidate-AQ derivatives synthetised, one was selected on the basis of cytotoxic activity improvement under hypoxia respectively to normoxia. In vivo, this compound demonstrated a significant tumoral growth inhibition in the hypoxic HEMC-SS chondrosarcoma model. This work underlines the potential of the proteoglycans vectorization strategy developed in our lab, for a targeted management of chondrosarcoma including: (i) the first and only radiopharmaceutical able to provide in vivo a specific diagnosis and staging of the tumoral pathology of cartilage and (ii) a promising targeted antineoplastic approach exploiting both the chondrogenic and hypoxic features of chondrosarcoma.

Ce travail de thèse avait pour objectif de développer un système de vectorisation de molécules d’intérêt thérapeutique pour le traitement des pathologies ostéoarticulaires. En effet, les traitements actuels visent plus à traiter les symptômes qu’à enrayer la progression de la pathologie, la difficulté majeure étant la délivrance des molécules et leur adressage. La thématique de recherche a été développée selon deux axes de travail, (1) l’élaboration de systèmes nanoparticulaires, au sein desquels ont été encapsulées différentes molécules (traceur fluorescent, principes actifs) et (2) l’évaluation biologique des systèmes ainsi obtenus sur différents contingents cellulaires. L’originalité de ce travail repose d’une part sur le processus de préparation des nanoparticules mais également sur le recouvrement de leur surface celui-ci étant destiné à renforcer leur tropisme pour les cellules articulaires, les chondrocytes. Nous avons pu, grâce au procédé de synthèse mis au point, préparer différents lots de nanoparticules, encapsulant plusieurs types de molécules, qu’il s’agisse de dextrane FITC (traceur biologique) ou des principes actifs, comme la chondroïtine sulfate ou l’acide hyaluronique. Le choix du recouvrement de surface des nanoparticules par le hyaluronate (HA) a été déterminé par le fait que les cellules chondrocytaires expriment à leur surface un récepteur spécifique du HA, le CD44. Une fois le processus de synthèse et de recouvrement des nanoparticules établi, le travail a consisté à démontrer in vitro l’innocuité des particules (cytocompatibilité, absence d’effets pathogènes, maintien de l’activité de biosynthèse matricielle) et l’intérêt du recouvrement par le HA destiné à favoriser l’internalisation dans les chondrocytes. Après avoir montré la plus forte affinité des nanoparticules recouvertes de HA (en comparaison avec un recouvrement par le poly(alcool vinylique) pour les chondrocytes, nous avons testé le système de vectorisation en injectant nanoparticules chez des animaux sains par voie intraarticulaire infrapatellaire. Les résultats obtenus concernant la cytocompatibilité, l’absence d’effets pathogènes et le maintien de l’activité de biosynthèse ont confirmé ceux observés lors des expériences réalisées in vitro. / The aim of the present work was to develop a nanoparticular system of vectorisation of therapeutic interests molecules for the treatment of osteoarticular pathologies. Nowadays, treatments aim more at treating the symptoms that to stop the pathology progress, major difficulty being the release of molecules and their addressing. The objectives of such a research consist on two working axes, (1) the development of nanoparticulaires systems, in which we have encapsulated various molecules (fluorescent tracer, pharmacological compounds) and (2) the evaluation of systems so obtained on different cells contingents. The originality of our work is on one hand the process of preparation of nanoparticles and on the other hand the coating of nanoparticles with HA in order to increase interactions with articular cells, chondrocytes. Thanks to our technique of synthesis, we could prepare different types of nanoparticles, loading several molecules like dextran FITC (biological tracer) or active principles, as the chondroïtin sulphate or hyaluronic acid (HA). The choice of the HA for coated the nanoparticules surface was decided because it is well known that chondrocytes express in their surface a specific receptor of hyaluronique acid, CD44. Once the process of synthesis and the coating of nanoparticles established, our job consisted in showing the harmlessness of particles in vitro (cytocompatibility, lack of pathogenic effects, preservation of the matrix biosynthesis/turnover) and the interest of coating nanoparticules by HA to facilitate the internalisation by chondrocytes. We showed a stronger affinity of nanoparticles covered with HA (versus PVA-coated nanoparticles) for chondrocytes (versus synoviocytes). We also tested our cells targetting system by injecting nanoparticles by intraarticular way at healthy animals. The obtained results confirmed those observed during the in vitro experiments what allows us of validated the concept of vectorization of therapeutic molecules by means of nanoparticular systems for the osteoarticular diseases.

Utilisation de nanoparticules pour délivrer des protéines dans les épithéliums respiratoires. Caractérisation des mécanismes impliqués. L’administration de médicaments par les voies respiratoires humaines est un domaine de la recherche en pleine expansion. Un effort croissant est porté sur le développement de systèmes innovants capables d’échapper aux mécanismes de clairance des voies respiratoires, d’améliorer la biodisponibilité des molécules d’intérêt, leur absorption dans la muqueuse et leur efficacité thérapeutique. Dans ce contexte, le but de ce travail était d’évaluer le potentiel de nanoparticules polysaccharidiques cationiques et poreuses (NP+) comme vecteurs de protéines à travers les voies respiratoires humaines. Les NP+ sont utilisées avec succès in vivo, comme vecteurs mucosaux dans de nombreuses applications telles que la vaccination, l’allergie, la thérapie anticancéreuse et la délivrance de molécules thérapeutiques. Cependant, les mécanismes d’interaction de ces nanoparticules avec les cellules épithéliales des voies respiratoires sont peu connus. Nous avons étudié l’endocytose, l’exocytose et la localisation intracellulaire de ces nanoparticules dans des cellules épithéliales bronchiques humaines. Leur toxicité a été évaluée sur ces cellules et plus particulièrement leur cytotoxicité et leur génotoxicité. Enfin, nous avons étudié et caractérisé les mécanismes de délivrance intracellulaire de protéines par ces nanoparticules et l’influence de leur composition interne sur ces mécanismes. Nos travaux montrent une endocytose rapide des NP+ par la voie des clathrines, ainsi qu’une importante exocytose par des mécanismes dépendant du cholestérol. Elles sont localisées dans les vésicules de clathrines, les endosomes précoces et pas dans les endosomes tardifs, ni dans les lysosomes. De manière ces nanoparticules s’associent quantitativement aux protéines et augmentent leur délivrance intracellulaire, tout en les protégeant de l’hydrolyse enzymatique à pH physiologique. De plus, la présence de lipides anioniques dans leur structure interne influence significativement les mécanismes d’interactions avec les cellules et de délivrance intracellulaire de protéines. Enfin, les études de toxicité ne montrent aucune cytotoxicité ni génotoxicité à des concentrations < 326 µg/cm2. Ces concentrations sont toutefois très élevées et difficilement atteignables in vivo. En conclusion, les NP+ ne sont pas toxiques sur les cellules épithéliales des voies respiratoires, elles interagissant fortement avec celles-ci et augmentent significativement la délivrance de protéines. Ce travail souligne l’intérêt de développer ce type de nanoparticules pour la délivrance de molécules d’intérêt pharmaceutique à travers les voies respiratoires humaines. / Drug delivery through the human respiratory tract is a promising field under investigation. A growing effort is focused on developing innovative delivery systems able to escape the clearance mechanisms of the respiratory tract, to improve molecules bioavailability, their absorption and their therapeutic efficacy, in the respiratory mucosa. In this context, the aim of this study was to evaluate the potential of polysaccharide cationic porous nanoparticles (NP+) as airway vectors for proteins. NP+ are successfully used as mucosal vectors in vivo, in many applications, including vaccination, allergy, cancer therapy and drug delivery. However, the mechanisms of NP+ interaction with airway epithelial cells remain poorly understood. We investigated the endocytosis, the exocytosis and the intracellular localization of NP+ in human bronchial epithelial cells. We assessed their toxicity on these cells, and particularly their cyto- and genotoxicity. Finally, we studied and characterized the mechanisms of intracellular delivery of proteins by these nanoparticles, and the influence of their inner composition, on these mechanisms. Our results showed a rapid uptake of NP+ via the clathrin endocytosis pathway, and a significant exocytosis via a cholesterol-dependent mechanism. Moreover, NP+ were located in clathrin vesicles, early endosomes but not in late endosomes nor lysosomes. Interestingly, these nanoparticles quantitatively associated proteins and increased their intracellular delivery, while protecting them from enzymatic degradation at physiological pH. Moreover, the presence of anionic lipids in their inner structure significantly influences their interaction with cells and the mechanisms of intracellular delivery. Finally, toxicity studies show no genotoxicity or cytotoxicity of these nanoparticles at concentrations below 326&#956;g/cm². However, these concentrations are very high and hardly realistic in vivo. In summary, NP+ are not toxic to airway epithelial cells, they strongly interact with these cells and significantly increase protein delivery. This work highlights the importance of developing this type of nanoparticles to deliver molecules via the human respiratory tract.

Le développement de nouvelles stratégies d’immunothérapie représente de nos jours un enjeu majeur de santé publique. Dans ce contexte, les lymphocytes T Natural Killer invariant (iNKT) exercent de puissantes activités immuno-modulatrices. Ces cellules ont la particularité de reconnaitre par l’intermédiaire de leur récepteur T (TCR), des (glyco) lipides, présentés par la molécule CD1d exprimée par les cellules présentatrices d’antigènes (APC), notamment les cellules dendritiques (DC). Initialement découvert à partir d’une éponge marine pour ses activités anti-métastatiques, l’alpha-galactosylcéramide (a-GalCer ou KRN) induit rapidement une sécrétion massive, par les cellules iNKT, de cytokines immunomodulatrices telles l’IFN-g, conduisant à la transactivation de nombreuses cellules immunitaires, notamment les cellules Natural Killer (NK), les DC ou encore les lymphocytes Tgd. Cette propriété unique permet aux cellules iNKT de contrôler, chez la souris, le développement des réponses immunes, notamment la réponse anti-tumorale. Face à ces résultats encourageants, des essais cliniques chez l’homme ont été réalisés mais les résultats se sont avérés décevants. Actuellement, il existe deux stratégies pour cibler un antigène à une population cellulaire particulière : 1) le ciblage passif, basé sur la taille des particules ou leur composition et 2) le ciblage actif, basé sur les fortes interactions anticorps/antigène ou ligand/récepteur. Nous avons testé les deux types de ciblages et avons utilisé le même polymère pour constituer nos vecteurs : le PLGA ou poly(lactic coglycolic acid). Dans une première étude (ciblage passif), nous avons comparé l’efficacité de l’encapsulation de l’a-GalCer dans des particules de tailles différentes: des nano (NP) et microparticules (MP). L’a-GalCer vectorisé dans les NP et les MP est endocyté par les DC (voie des clathrines) et active les cellules iNKT in vitro et in vivo mais ne peuvent empêcher leur anergie. Ces résultats décevants nous ont conduits à opter pour le ciblage actif des DC. Dans un premier temps, étant donné les études controversées sur le rôle des DC dans l’anergie des cellules iNKT, nous avons revisité l’implication de ces dernières dans la primo-activation/anergie des cellules iNKT. Nous confirmons ainsi le rôle primordial de DC dans la primo-activation des cellules iNKT mais surtout, nous montrons qu’elles n’induisent pas leur anergie. Représentant une population hétérogène, nous montrons que parmi les DC, les DC CD8a+ sont de puissantes activatrices des cellules iNKT. Nos résultats nous ont ainsi menés à délivrer spécifiquement l’a-GalCer aux DC CD8a+. Pour cela, nous avons greffé sur les NP de PLGA un anticorps anti-DEC205, récepteur lectinique fortement exprimé par les DC CD8a+. In vitro et in vivo, les NP/DEC205/a-GalCer induisent une plus forte activation des cellules iNKT comparativement à l’a-GalCer libre. De même, la co-délivrance d’a-GalCer et d’ovalbumine (OVA) au sein des DC CD8a+ améliore les propriétés adjuvantes de l’a-GalCer en induisant des réponses humorale et cellulaire (lymphocytes T CD8+) spécifiques de l’OVA plus importantes comparativement à la délivrance des deux composés sous leur forme libre. Finalement, de façon intéressante, nous montrons que suite à une primo-activation par les NP/DEC205/a-GalCer, les cellules iNKT sont capables de répondre de nouveau à une seconde stimulation, traduisant l’absence d’anergie des cellules iNKT. En conclusion, nos résultats indiquent que la délivrance spécifique de l’a-GalCer aux DC CD8a+ amplifie la primo-activation des cellules iNKT tout en évitant la mise en place du phénomène d’anergie et ouvrent de nombreuses perspectives dans le cadre de thérapies anti-tumorales et anti-infectieuses. / Nowdays, the development of new immunotherapy strategies represent a major issuein public health. In this context, the invariant Natural Killer T lymphocytes (iNKT) have strongimmunomodulatory properties. This cell population recognizes (glycol)lipid presented by theCD1d molecule expressed by antigen presenting cell (APC) as dendritic cells (DC). Initiallyfound in a marine sponge for its anti-metastatic activities, alpha-galactosylceramide (-GalCer or KRN) induces a massive cytokine production (IFN-, IL-4, IL-17) by iNKT cells.This cytokine burst lead to downstream activation of numerous immune cells like naturalkiller cell (NK), DC or CD8+ T cells. Through this property, iNKT cells regulate numerousimmune responses, including anti-tumoral response. Based on encouraging results in themouse model, -GalCer has been used in anti-tumour therapy in human. Although the drugwas well tolerated, no or moderate clinical responses were observed in patients repeatedlyinoculated with -GalCer. As observed in the mouse system, one potential explanation forthis disappointing observation may lie in the induction of a long-term anergy of human iNKTcells, thus preventing cytokine release upon a recall stimulation. Although controversial,various studies suggest that this phenomonen should be due to a lack of delivery of -GalCer into dendritic cells (DC) and so its presentation by non adequate antigen presentingcell (APC) as B cells. The objective of our work was to optimize -GalCer activity by avoidingiNKT anergy using vectorisation approach. Actually, there are 2 strategies using nanotechnologies to target an antigen to a specific cell population: 1) passive targeting based on the size of the particles, their composition and their surface charge and 2) active targeting based on the strong interactions between an antibody and its antigen or a ligand and its receptor. We have tested the two strategies and therefore we use the same composition of our particles: PLGA or poly(lactic co glycolic acid). This biodegradable and biocompatible molecule is already used in therapy.In a first study (passive targeting), we compared the efficiency of -GalCer encapsulation inparticles with different size: nano (NP) and microparticle (MP). Vectorised -GalCer in NPand MP rapidly activates iNKT cells in vitro. Both type of particles are uptake by DC via aclathrin dependent mechanism. In in vivo approaches, NP/-GalCer and MP/-GalCeractivate iNKT cells but unfortunately could not prevent iNKT cell anergy. These disappointingresults led us to use an active targeting. In first time, because of controversial role of DC iniNKT anergy, we have revisited the role of DC in iNKT primo-activation and anergy. Weconfirm the primordial role of DC in iNKT primo-activation but especially we show that DC donot induce iNKT anergy. DC are heterogeneous and we show that among DC, CD8a+ DCsubpopulation are potent iNKT cells activation. Our results led us to deliver specifically a-GalCer to CD8+ DC. For this, anti-DEC205 antibodies were covalently linked to the surfaceof PLGA NP, DEC205 being highly expressed by CD8+ DC. In vitro and in vivo,NP/DEC205/-GalCer induce a stronger iNKT cell activation relative to free -GalCer (or NPIgG/-GalCer). Moreover, -GalCer and ovalbumin co-delivery in CD8+ DC improve -GalCer adjuvanticity leading to more important humoral and cellular responses. Interestingly,after a primo-activation by NP/DEC205/-GalCer, iNKT cells are able to respond to secondstimulation thus avoiding iNKT cell anergy.In conclusion, our results indicate that specific -GalCer delivery to CD8+ DC improve iNKT cells primo-activation and avoid anergy phenomenon. These findings open several perspectives in anti-tumoral and anti-infectious therapies.

Les dérivés de porphyrines sont impliqués dans de nombreux processus d'oxydoréduction. Ces composés conduisent à de nombreuses applications, dont la Thérapie Photodynamique (PDT). Il existe deux générations de dérivés de porphyrines qui sont actuellement remplacés par des composés de 3ème génération, plus actifs et entraînant moins d'effets secondaires. Ces composés sont capables de reconnaître spécifiquement et directement (par adressage) ou indirectement (par vectorisation) les cellules cancéreuses. Nous avons orienté notre travail vers la synthèse et l'évaluation biologique de composés tétrapyrroliques associés à des modules tels que des sucres ou des motifs peptidiques de type -RGD- qui permettent une reconnaissance spécifique des cellules cancéreuses, via les lectines ou les intégrines, respectivement. De plus, dans le cadre d'un programme européen Cost-Chemistry intitulé "New molecular systems with therapeutic applications in photodynamic therapy of cancer and microbial infections", nous avons étudié les propriétés photophysiques de nombreux photosensibilisants synthétisés par une équipe roumaine / Derived of porphyrins are tetrapyrrolic macrocycles involved in several redox processes. These compounds are used for different biological applications, like photodynamic therapy (PDT). Many teams in the world seek to synthesize compounds able to directly recognize specifically and (by targeting) or indirectly (by vectorization) cancer cells. These compounds are known as of 3rd generation. We are involved in the synthesis and the biological evaluation of tetrapyrrolic compounds associated to recognition and/or transport agents such as sugars or RGD-like peptide sequences. These moieties allow a specific recognition of the cancerous cells, via the lectins for the sugar moieties and the integrins for the RGD type moieties, respectively. Within the framework of an European Cost-Chemistry program entitled "New mo/ecu/ar systems with therapeutic applications in photodynamic therapy of cancer and microbia/ infections", we also studied the photophysical properties of photosensitizers synthesized by a Rumanian team

Le mélanome est la forme la plus rare et la plus grave des cancers de la peau. Il présente un fort pouvoir métastatique et à l'heure d'aujourd’hui, il n'y a pas de traitement efficace contre le mélanome disséminé. Le travail présenté dans ce mémoire s'inscrit dans la continuité d'une stratégie de d'adressage spécifique de pro-drogues vers le mélanome initiée au sein de notre laboratoire. Notre concept repose sur la conjugaison d'ICF01012, vecteur à fort tropisme pour les mélanines, avec un principe actif modèle (IUdR) sous forme de pro-drogues à espaceurs clivables de type disulfure d'éthyle carbonate ou pnitrobenzylcarbonate pour une double spécificité (i.e. distribution tumorale et libération spécifique de la tumeur). Un premier travail de fonctionnalisation d'ICF01012 a abouti à la synthèse de sept nouveaux vecteurs qui ont été radio-marqués à l'iode 125 afin d'évaluer leur comportement in vivo chez des souris C57Bl/6J porteuses de mélanome B16F0 par scintigraphie plane gamma et biodistribution ex vivo. Le vecteur radio-iodé présentant le profil pharmacocinétique le plus favorable (fixation tumorale forte, spécifique et durable) a été ensuite sélectionné en vue d'une première validation de notre concept de prodrogues vectorisées. Les entités "IUdR-espaceurs clivables" et leurs analogues non clivables à base d'espaceurs de type mercaptoéthylcarbonate ou benzylcarbonate ont également été synthétisés. L'étude de leur comportement au contact de 2S,3S-dithiothreitol et d'hydrosulfite de sodium (mimant l'action du glutathion et de conditions hypoxiques, respectivement) a montré que la libération de l'IUdR est quasitotale et qu'elle est bien induite par la présence du pont disulfure et du groupement nitré. Sur la base de ces résultats, deux pro-drogues ainsi que leurs analogues non clivables ont été synthétisés par association de la partie vectrice avec l'IUdR et les espaceurs clivables ou non clivables. Les études de biodistribution in vivo de l'IUdR et de la pro-drogue à espaceur disulfure radio-marquées à l'iode 125 ont démontré une absence de vectorisation, imputable à une métabolisation très rapide de la pro-drogue par la suite d'un clivage extrêmement rapide de l'espaceur disulfure in vivo provoquant la libération instantanée de l'IUdR dès les premières minutes qui suivent l'injection de la pro-drogue. Néanmoins, des voies de synthèse et des méthodes de suivi de clivages chimiques transposables ont été mises au point et peuvent être utilisées dans les futures études s'inscrivant dans le cadre d'une chimiothérapie vectorisée du mélanome. / Melanoma is the rarest and the most serious form of skin cancer. It has a high metastatic potential and in today's time, there is no effective treatment against disseminated melanoma. The present work is a continuation of a melanoma targeted prodrug therapy approach initiated in our laboratory. Our concept is based on the combination of ICF01012, vector that displays a high tropism for melanin, with IUdR, a drug model, as cleavable prodrugs containing a disulfide ethyl carbonate or a pnitrobenzylcarbonatespacer type for a dual specificity (i.e. tumoral distribution and specific delivery to the tumor). Functionalization of ICF01012 led to the synthesis of seven new vectors that were 125Iradiolabeled in order to evaluate their behavior in vivo (planar gamma scintigraphy and ex vivo biodistribution) in B16F0 melanoma-bearing mice. The radioiodinated vector having the most favorable pharmacokinetic profile (high, specific and long lasting tumoural uptake) was then selected for a first validation of our targeted prodrugs concept. Entities "IUdR-cleavable spacers" and their analogs with noncleavable spacers (mercaptoéthylcarbonate or benzylcarbonate kind) were also synthesized. The study of their behavior in contact with 2S,3S-dithiothreitol and sodium hydrosulfite (mimicking glutathione and hypoxic conditions actions, respectively) showed that the release of IUdR is almost complete and it is induced by the presence of the disulfide bridge and the nitro group. Based on these results, two prodrugs and their non-cleavable analogs were synthesized by combining the vector part with IUdR and cleavable or non-cleavable spacers. The in vivo biodistribution studies of 125I-radiolabeled IUdR and disulfide spacer based-prodrug showed no vectorization due to a very rapid metabolism of the prodrug following extremely rapid cleavage of the disulfide spacer in vivo causing instantaneous IUdR release in the firstminutes after prodrug injection. However, transposable synthetic routes and cleavage studies have been developed and can be used in future studies within the framework of melanoma targeted prodrug therapy

Le mélanome est un cancer dont l'incidence est toujours en augmentation et dont la mortalité ne faiblit pas, malgré les dispositifs de prévention et de détection précoce. Ce constat peut être principalement imputé au caractère invasif très marqué de cette pathologie, associé à un manque de traitements efficaces face à la maladie disséminée. Le travail présenté dans ce mémoire s'inscrit dans l'initiation d'une stratégie d'adressage tumoral actif de prodrogues, qui s'appuie sur un vecteur ciblant les mélanines (ICF01012) posédant un profil pharmaco-cinétique favorable (fixation tumorale forte, spécifique et durable). Une première génération de quatre prodrogues constituées par un principe actif anticancéreux modèle (l'IUdR) conjugué au vecteur via diverses fonctions espaceurs (ester, acétal, carbonate et carbamate) a été synthétisée et évaluée in vitro sur des critères métabolique et physico-chimique. Les études de biodistribution in vivo après radiomarquage des deux composés les plus pertinents ont démontré une absence de vectorisation, principalement imputable à une métabolisation très rapide des prodrogues conduisant à la perte de l'édifice vecteur. Ainsi, une seconde génération de trois prodrogues variant la nature des espaceurs (chaînes pegylées, pour l'amélioration de ce dernier point et fonction cétal) a été synthétisée. Les résultats biologiques indiquent que l'insertion d'une chaîne pegylée courte augmente la stabilité métabolique par encombrement de la fonction amine tertiaire, conduisant à une faible fixation tumorale. De plus, un espaceur sensible au pH acide constitué par une fonction cétal a été identifié et devrait permettre une libération sélective du principe actif au sein de la tumeur grâce au pH intramélanosomal acide. La libération sélective d'un principe actif par l'action d'une enzyme propre aux mélanosomes, la tyrosinase, a également été abordée par la synthèse de huit "prosondes" constituées par un substrat de l'enzyme (phénol ou catéchol), un espaceur auto-clivable et une sonde permettant d'étudier le mécanisme de libération. Une prosonde vectorisée incluant le vecteur a également été préparée. Des voies d'accès versatiles ont été conçues pour faciliter l'insertion ultérieure de principes actifs. L'aboutissement de cette étude devrait conduire à des prodrogues doublement spécifiques (i.e. distribution tumorale et libération spécifiques) conçues pour le traitement du mélanome métastasé. / Despite prevention campaigns and early detection, incidence and mortality of cutaneous melanoma are still increasing, due to its high invasiveness and the lack of efficient treatments against disseminated disease. This work is the starting point of a melanoma targeted prodrug therapy approach based on a melanin-targeting ligand (ICF01012) which displays an appropriate in vivo kinetic profile (strong, specific and long-lasting tumor uptake). A first generation of four prodrugs with varied spacers (ester, acetal, carbonate and carbamate) was synthesized and evaluated in vitro onphysicochemical and metabolic stability criteria. Two of them were selected and radiolabelled for in vivo evaluation which demonstrated non-specific distribution, mainly because of early metabolism leading to the loss of the targeting moeity. Taking into account these results, a second generation of three prodrugs varying the properties of spacers (pegylated chain for improving this last point and ketal function) was synthesized. Insertion of a short pegylated chain improved the metabolic stability by structural hindering of the tertiary amine fonction and led to a weak tumor uptake. Moreover, the ketal fonction was identified as a pH-sensitive linker able to selectively release the drug into the tumor due to the acidic intramelanosomal pH. The enzymatic drug release by tyrosinase, a specific melanosomal enzyme, was also explored. Eight "pro-probes" including an enzyme substrate moiety (phenol or catechol), a self-immolative spacer and a probe allowing the release mechanism were synthesized. A proprobe which includes the targeting moiety was also developed. During these studies, versatile synthetic pathways were designed for further easy incorporation of drugs. Achievement of this study should lead double specific prodrugs (i.e. specific tumor distribution and release) designed for metastatic melanoma treatment.

Cette thèse aborde les difficultés de mise au point de codes multicibles - c'est-à-dire de codes dont performances sont portables entre différentes cibles matérielles. Nous avons identifié deux principales difficultés à surmonter : l'unification de l'expression du parallélisme d'une part et la nécessité d'adapter le format de stockage des données d'autre part. Afin de mettre au point une version multicible de la bibliothèque d'algèbre linéaire Legolas++ mise au point à EDF R&D, nous avons conçu MTPS (MultiTarget Parallel Skeleton), une bibliothèque dédiée à la mise au point de codes multicible. MTPS permet d'obtenir une implémentation multicible pour les problèmes appliquant une même fonction aux différents éléments d'une collection. MTPS prend alors en charge l'adaptation du format de stockage des données en fonction de l'architecture ciblée. L'intégration des concepts de MTPS dans Legolas++ a conduit à l'obtention d'un prototype multicible de Legolas++. Ce prototype a permis de mettre au point des solveurs dont les performances sont proches de l'optimal sur différentes architectures matérielles / This thesis addresses the challenges of developing multitarget code - that is to say, codes whose performance is portable across different hardware targets. We identified two key challenges : the unification of the the parallelism expression and the need to adapt the format for storing data according to the target architecture. In order to develop a multitarget version of Legolas++, a linear algebra library developed at EDF R&D, we designed MTPS (Multi-Tatget Parallel Skeleton), a library dedicated to the development of multitarget codes. MTPS allows for multitarget implementations of problems that apply the same function to all the elements of a collection. MTPS then handles the adaptation of the format for storing data according to the targeted architecture. Integrating the concepts of MTPS in Legolas++ has led to the production of a multitarget prototype of Legolas++. This prototype has allowed the development of solvers whose performances near the harware limits on different hardware architectures

Problème de santé mondial, le cancer tue chaque année des milliers de personnes en France, malgré de réels progrès dans les traitements médicaux. Parmi ceux-ci, l'immunothérapie qui vise à stimuler le système immunitaire afin qu'il reconnaisse et élimine les cellules tumorales, fait l'objet de nombreuses études, notamment depuis la découverte de lymphocytes T spécifiques d'antigènes tumoraux.<br />Bien que les premiers essais d'activation de lymphocytes T cytotoxiques réalisés in vitro et in vivo chez l'animal avec des peptides tumoraux ou des cellules tumorales aient été encourageants, les essais cliniques de vaccination qui ont succédé ont globalement échoué. Un nouvel axe de recherche est apparu avec l'amélioration des connaissances sur la biologie des cellules dendritiques myéloïdes (mDC), dont le rôle est primordial. En effet, les mDC sont capables d'initier les réponses immunes spécifiques car elles peuvent activer les lymphocytes T naïfs et restimuler les lymphocytes mémoires avec une grande efficacité. Les mDC sont, dès lors, devenues les candidates idéales pour l'immunothérapie anti-tumorale et les essais se sont multipliés. A nouveau, alors que les expériences réalisées in vitro et in vivo chez l'animal étaient très encourageantes, les essais cliniques ont été décevants ; l'injection de mDC chargées avec des antigènes tumoraux sous différentes formes n'induit que peu de réponses cliniques. Notre hypothèse est que l'efficacité de la vaccination anti-tumorale pourrait être améliorée par une optimisation du ciblage des antigènes tumoraux vers les DC in vivo. Dans ce travail, nous avons développé de nouvelles stratégies visant à vectoriser les antigènes tumoraux pour les délivrer efficacement, voire spécifiquement aux cellules dendritiques.<br />Dans un premier temps, nous avons ciblé le récepteur au mannose, exprimé par les mDC, grâce à un vecteur chimique (le RAFT) qui permet d'accrocher à la fois des résidus mannose et des antigènes tumoraux (melan-A). Nous avons montré que le RAFT(Man)16-melan-A était efficacement endocyté par les mDC et que le peptide tumoral était cross-presenté aux lymphocytes T spécifiques.<br />Dans un second temps, nous avons opté pour une stratégie permettant d'améliorer la stabilité de l'antigène tumoral et de le délivrer dans le cytosol des cellules en utilisant des virosomes. Les virosomes sont des particules dérivées du virus de l'Influenza, dont le matériel génétique a été retiré mais qui ont conservé les protéines membranaires du virus, et qui ont la particularité de pouvoir encapsuler des peptides ou des protéines. Grâce à la présence de l'hémagglutinine, ils peuvent être endocytés et ainsi délivrer leur contenu dans le cytoplasme de la cellule. Nous avons testé un virosome encapsulant le peptide tumoral melan-A et nous avons montré que les mDC étaient capables de présenter l'antigène tumoral aux lymphocytes T et de les activer efficacement. Parallèlement, nous avons réalisé la même étude sur une autre population de cellules dendritiques, les cellules dendritiques plasmocytoïdes (pDC). Ces cellules, encore largement méconnues, jouent un rôle unique dans l'immunité anti-virale grâce à la sécrétion d'IFN-. Dans ces expériences, réalisées avec une lignée de pDC développée dans notre laboratoire à partir des cellules d'un patient atteint d'une leucémie à pDC (lignée GEN2.2), nous avons montré que les pDC sont également capables de présenter un antigène encapsulé dans un virosome et d'activer efficacement les lymphocytes T spécifiques. <br />Nous avons, par ailleurs, approfondi notre étude sur les fonctions biologiques des pDC dans l'immunité antivirale, notamment leur capacité à cross-présenter des antigènes issus de l'endocytose de cellules traitées par un virus. Dans notre modèle, nous avons montré que des lymphocytes B incubés avec le virus de l'Influenza inactivé étaient phagocytés par les pDC, que les pDC étaient alors activées et que les antigènes viraux cross-présentés activaient des lymphocytes T spécifiques. Cette caractéristique confère un rôle potentiel dans l'initiation des réponses immunes au même titre que son homologue myéloïde, et un rôle intéressant dans l'immunité anti-tumorale.<br />Ainsi, à travers ce travail, nous avons développé des stratégies innovantes de vectorisation d'antigènes sur les cellules dendritiques en utilisant de nouveaux outils chimiques, viraux ou cellulaires. La validation in vitro de ces outils devra permettre, dorénavant, de mettre en place des expérimentations chez l'animal pour démontrer l'efficacité in vivo de ces stratégies.