Introducción: El fracaso de la osteosíntesis constituye una complicación de efectos devastadores en el paciente anciano con fractura de cadera. En el caso de los pacientes tratados mediante tornillo-placa deslizante (DHS), la migración intraarticular del tornillo cefálico o “cut-out” constituye la complicación mecánica más frecuente. Las opciones de rescate tras el cut-out incluyen la revisión de la osteosíntesis o bien el reemplazo del fémur proximal mediante artroplastia total o parcial de cadera. Hipótesis: El tratamiento de rescate del cut-out de DHS en fracturas pertrocantéreas de fémur mediante revisión de la osteosíntesis o artroplastia de cadera no presenta diferencias en el resultado funcional. Objetivos: Analizar los resultados radiográficos; evolución del nivel de independencia para actividades de la vida diaria (AVD); calidad de vida percibida; tasa de complicaciones postoperatorias agudas y evolutivas; tasa de reintervención quirúrgica y tasa de mortalidad al año de la cirugía en pacientes intervenidos por cut-out de DHS mediante revisión de la osteosíntesis o artroplastia de cadera. Material y métodos: Entre los años 2000 y 2010, 71 pacientes (67 mujeres y 4 hombres) con una edad media de 80,4 años fueron intervenidos en nuestro centro por cut-out de DHS en fractura pertrocantérea. En 30 casos se practicó una re-osteosíntesis: 14 mediante un nuevo DHS, 7 con tornillo condíleo dinámico (DCS), 5 mediante enclavado intramedular y 4 mediante placa de Gottfried. Los 41 pacientes restantes fueron tratados mediante artroplastia de cadera, 34 mediante artroplastia total y 7 mediante hemiartroplastia bipolar cementada. No hallamos diferencias significativas en cuanto a edad media, distribución por sexos, estado físico prequirúrgico o comorbilidad asociada entre ambas cohortes a estudio. Comparamos los resultados funcionales de ambos grupos mediante la utilización de la escala de valoración de la cadera de Harris, la escala visual analógica del dolor (EVA) y la escala de valoración de la marcha de Holden. El grado de dependencia para AVD se calculó mediante el índice de Barthel y la calidad de vida postoperatoria utilizando el cuestionario Short-Form 36 (SF-36). Conclusión principal: El tratamiento de rescate del cut-out de DHS en fracturas pertrocantéreas mediante artroplastia de cadera presenta mejores resultados funcionales (mayor puntuación en la escala de Harris, menor dolor y una mayor independencia para la marcha) respecto a la revisión de la osteosíntesis. Conclusiones sobre los objetivos: Los pacientes tratados con artroplastia de cadera presentan: menor discrepancia de longitud de miembros inferiores; mayor calidad de vida percibida; mayor nivel de independencia para AVD y un menor número de complicaciones evolutivas y de necesidad de reintervención quirúrgica que los tratados con una nueva osteosíntesis. No existen diferencias significativas en la tasa de complicaciones agudas y la mortalidad durante el primer año postquirúrgico entre ambos grupos / Background: Osteosynthesis failure is a devastating complication in elderly patients with hip fracture. For patients treated with sliding hip screw (DHS), intra-articular migration of the cephalic screw or "cut-out" is the most common mechanical complication. Salvage options after cut-out include revision internal fixation or replacement of the proximal femur with hemi or total hip arthroplasty. Hypothesis: Salvage treatment after cut-out of DHS in intertrochanteric femoral fractures with revision internal fixation or hip arthroplasty does not show differences in functional results. Objectives: To analyze radiographic results; changes in the level of independence in activities of daily living (ADL); perceived quality of life; rate of acute postoperative and evolutive complications; reoperation rate and one-year mortality rate of patients who underwent surgery for cut-out with revision osteosynthesis or hip arthroplasty. Materials and methods: Between 2000 and 2010, 71 patients (67 women and 4 men) with a mean age of 80.4 years underwent surgery in our center due to cut-out of DHS. In 30 cases a re-fixation was performed: 14 with new DHS, 7 with dynamic condylar screw (DCS), 5 with intramedullary nailing and 4 with Gottfried plate. The remaining 41 patients were treated with hip arthroplasty, 34 with total hip arthroplasty and 7 with bipolar cemented hemiarthroplasty. We found no significant differences in mean age, sex distribution, preoperative physical status or comorbidities between the two study cohorts. We compared the functional outcomes of both groups using the Harris hip score, visual analogue scale (VAS) for pain, and Holden functional ambulation classification score. The level of dependence for ADLs was graded using the Barthel index. Postoperative quality of life was measured using the Short-Form 36 (SF-36) questionnaire. Main conclusion: Hip arthroplasty as salvage treatment after cut-out of DHS in intertrochanteric femoral fractures shows better functional results (higher Harris hip score, less pain and greater independence for ambulation) than revision internal fixation. Conclusions on the objectives: Patients treated with hip arthroplasty presented: lower leg length discrepancy; higher perceived quality of life; greater level of independence for ADL; fewer evolutive complications and lower reoperation rate than those treated with a new fixation. There were no significant differences in the rate of acute complications and mortality during the first postoperative year between the two groups.

L’activitat de la plasmina és clau en el procés de regeneració muscular després d’una lesió. Aquesta proteasa d’ampli espectre de substrat afavoreix l’eliminació de fibrina i col∙lagen extracel∙lulars, i indueix la migració de cèl∙lules del sistema inflamatori a l’àrea danyada, però no es coneix si afecta a les cèl∙lules musculars directament. Estudis previs del grup han identificat l’alfa‐enolasa com a principal receptor del plasminogen en els mioblasts murins i han determinat que la generació i focalització de l’activitat proteolítica de la plasmina a través d’alfa‐enolasa a la superfície dels mioblasts és clau pel procés de miogènesi i regeneració muscular. En aquesta tesi, inicialment s’ha determinat la unió del plasminogen i de la plasmina a la superfície dels mioblasts murins C2C12 i dels cultius primaris de MPCs (Muscle Precursor Cells), i s’ha confirmat la implicació de l’alfa‐enolasa com a principal receptor del plasminogen involucrat. Per fer‐ho s’ha generat un anticòs específic per la isoforma alfa‐enolasa que inhibeix la seva unió al plasminogen. Els estudis realitzats amb aquest nou anticòs, anomenat MAb872, no només han confirmat l’alfa‐enolasa com a principal receptor involucrat en la unió del plasminogen als mioblasts sinó que han demostrat que la inhibició de la unió alfa‐enolasa/plasminogen impedeix la diferenciació i fusió miogènica dels mioblasts murins in vitro i in vivo. Seguidament, s’ha observat que la presència de plasmina unida a la membrana dels mioblasts a través d’alfa‐enolasa indueix l’activació de les vies MAPK/Erk i PI3K/Akt de forma depenent de la seva activitat proteasa. L’alfa‐enolasa no posseeix un domini transmembrana i es desconeix com es localitza a la membrana plasmàtica. La manca de domini intracel∙lular de l’alfa‐enolasa, suggereix la participació de receptors col∙laboradors per poder transduir la senyal a l’espai intracel∙lular. Entre diversos receptors candidats analitzats, observem indicis de la participació de les integrines β1/β3 i l’activació de la via MAPK/Erk a través de Src i FAK. A nivell cel∙lular, la unió de la plasmina als mioblasts provoca canvis en la reorganització del citoesquelet d’actina afavorint la desadherència del substrat i induint la migració cel∙lular. Alhora s’ha demostrat que l’activació de la via PI3K/Akt en presència de plasmina incrementa la supervivència dels mioblasts en situacions d’estrès cel∙lular. Per altra banda, seguint indicis previs del grup que suggerien la participació de EGFR en el procés miogènic, s’ha analitzat l’expressió de EGFR en el múscul esquelètic d’animals wt i animals distròfics mdx, així com durant el procés de regeneració in vivo i el procés de miogènesi in vitro. Els resultats obtinguts mostren una molt baixa expressió i activació de EGFR en el múscul esquelètic adult i un notable increment després d’una lesió muscular o en un múscul adult distròfic. L’anàlisi in vitro ha permès determinar la participació de EGFR en la proliferació i supervivència dels mioblasts i la pèrdua de l’expressió d’aquest receptor a l’inici del procés miogènic. També s’ha observat que la inhibició de l’activitat tirosina quinasa de EGFR estimula la fusió miogènica obtenint més fibres musculars i de major tamany. Aquests resultats suggereixen la inhibició de EGFR com a possible diana terapèutica per estimular els processos miogènics en situacions patològiques, com és el cas de la distròfia muscular de Duchenne. Estudis preliminars de l’administració de AG1478, inhibidor de l’activitat tirosina quinasa de EGFR, en animals mdx indiquen que AG1478 podria millorar el fenotip distròfic d’aquests animals. / Plasmin activity is necessary for muscle regeneration process after an injury. This broad‐spectrum protease is the major enzyme responsible for the dissolution of fibrin and most of the components of ECM and it also promote and lead the migration of inflammatory cells to injured area. However, it is unknown if it plays also a role in muscle cells directly. Pervious results of the group identified alpha‐enolase as the major plasminogen receptor in murine myoblast. Our group also described alphaenolase dependent generation and focalization of plasmin on the myoblasts surface as an essential event in myogenesis and muscle regeneration process. Firstly, in this thesis we have analyzed the capacity of murine myoblast (C2C12 and primary culture of Muscle Precursor Cells or MPCs) to bind plasminogen and plasmin in an alpha‐enolase dependent way, as well the participation of alpha‐enolase in myogenic process. In order to address this question we generated a monoclonal antibody (MAb872) that inhibits plasminogen binding to alpha‐enolase. The results using this antibody corroborate the role of alpha‐enolase as a major plasminogen receptor in myoblast and confirm the impairment of satellite‐cells‐derived myoblast differentiation and fusion in vitro and in vivo, when alpha‐enolase/plasminogen interaction is abrogated. We further observed plasmin binding to alpha‐enolase induces MAPK/Erk and PI3K/Akt pathways in a plasmin activity dependent way. It is unknown how alphaenolase reaches the membrane as it lacks transmembrane domain. Moreover, the absence of intracellular domain suggests that alpha‐enolase collaborates with other receptors to transduce plasmin‐dependent signaling. Among several receptors, we have identified the participation of integrins β1/β3 in the plasmin‐induced MAPK/Erk signaling upstream Src and FAK in myoblasts. The cellular effect of plasmin binding to alpha‐enolase is the reorganization of actin filaments promoting cellular migration. Moreover plasmin activation of PI3K protects murine myoblast from apoptosis in stress conditions suggesting a protective role of this protease. Other previous results in our group suggested the participation of EGFR in myogenic process as well. To address this hypothesis we have analyzed the expression of EGFR in skeletal muscle from wt mice, dystrophic mdx mice and in cardiotoxininjured mice, as well as during myogenesis in vitro. Our results show a reduced basal expression and activation of EGFR in adult non‐injured muscle but high levels of active EGFR in injured and dystrophic muscle. In vitro analysis has revealed that EGFR participates in proliferation and surviving of non‐diferentiated myoblasts and the inhibition and downregulation of EGFR at the beginning of differentiation process. Moreover, EGFR inhibition with AG1478 induces myoblasts differentiation and fusion generating bigger muscle fibers. These results point the inhibition of EGFR as a therapeutic tool in deficient myogenic process as in dystrophic muscles. Preliminary work administrating AG1478 in mdx mice suggest a possible therapeutic effect of this EGFR inhibitor.

El Balonmano es uno de los deportes de equipo más practicados en Europa, España y Cataluña. Este deporte, presenta valores altos en cuanto a incidencia y riesgo de lesiones. El análisis respecto al patrón de lesiones, incidencia y algunos factores de riesgo, en ocasiones hallan conclusiones controvertidas, y son muy escasos los estudios que analizan ésta problemática en las etapas formativas tomando en consideración el proceso madurativo como un condicionante. Por ello se plantea la presente investigación con un trabajo inicial retrospectivo (primer artículo) durante cinco temporadas sobre el estudio de la epidemiologia de las lesiones del balonmano de elite en las diferentes categorías de edad, comparando los jugadores profesionales con aquellos en etapas formativas. Si bien no se encuentran diferencias significativas en la incidencia lesional por edades ni categorías, si se encuentran diferencias en el patrón lesional: las estructuras más afectadas son tobillo y rodilla y las lesiones musculares son más prevalentes en adultos profesionales y las ligamentarias en jóvenes en formación. Continúa el proyecto con un estudio prospectivo durante dos temporadas consecutivas que generan dos artículos originales: un segundo artículo que forma parte del trabajo principal de ésta tesis y un tercer artículo, complementario, que se incorpora en el anexo. El segundo artículo, analiza las variables de maduración en todas sus variantes respecto a incidencia de lesiones por mil horas de exposición total, y durante entrenamientos o competiciones. Si bien no se detectaron diferencias significativas en la incidencia lesional por categoría de edad o estado madurativo, sí se constatan diferencias significativas durante la competición según la categoría de edad, y durante los entrenamientos según el estado madurativo del jugador. En el tercer artículo, se analiza el rol de la posición de juego en la incidencia de lesiones según sucedan en adultos o jóvenes, y en éstos últimos según sean maduros o inmaduros. No se encontraron diferencias significativas. Sin embargo si se encontró que los jugadores de segunda línea presentaban más problemas de rodilla y en concreto lesiones de cartílago y que los jóvenes inmaduros presentaban un mayor riesgo de sufrir apofisitis. En conclusión parece que el riesgo lesional por horas de exposición no parece ser determinante en el Balonmano, sin embargo el patrón lesional si es diferente por categorías de edades y estados madurativos. Ello debe ser considerado por entrenadores y resto de profesionales implicados, para poder desarrollar programas de entrenamiento y protocolos lesionales preventivos más específicos durante cada etapa de formación hasta la elite del balonmano profesional. / Handball is one of the most popular team sports in Europe, Spain and Catalonia. This sport shows high values for incidence and risk of injuries. The analysis regarding pattern of injuries, incidence, and risk factors, results in controversial findings, and very few studies analyze this problem in the academy period, considering the maturity process as a variable. We proposed this line of research with a first study (retrospective study design). We analyzed the epidemiology of injuries in elite handball in different age categories, comparing the professional and academy players, over five seasons. There was no difference in total injury incidence nor by age nor by category, but we found differences in injury pattern; the most affected parts being ankle and knee, and muscle injuries were more frequent in professional adults, and ligament injuries in youth. This was followed by a prospective study, over two consecutive seasons, which generated two original manuscripts (second and third). The second manuscript being a main part of this thesis, and a third manuscript being incorporated in the annex. The second manuscript analyzes the relationship between maturity stage and injury incidence (per 1000 hours of total exposure, training and match). There is no difference by age category or biological maturity compared to the total injury incidence, but there is a significant difference in competition between injury incidence and age category or during training between injury incidence and biological maturity. The third manuscript, studies the role of playing position and injury incidence in adults versus young people, and in this last group with respect to biological maturity. There is no difference in total injury incidence. However, we found that second line players had more knee problems and specifically cartilage injuries and the immature youth players a higher injury risk of suffering apophyisitis. In conclusion, it seems that the injury risk per exposure hours is not determinant in handball, however the injury pattern is different by age and maturity stage. This should be taken into account by coaches and technical staff when developing training programs and preventive protocols for each formative stage up to professional elite handball

PSYCHOLOGICAL SYMPTOMS IN ANKYLOSING SPONDYLITIS. STUDY OF THEIR PREVALENCE AND DETERMINANTS INTRODUCTION: In recent years the importance of psychological factors in inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis or systemic lupus erythematosus has been recognized. However, in Ankylosing Spondylitis (AS) little attention has been paid to these factors; few studies have evaluated the presence of psychological disorders in this disease. OBJECTIVE: To establish the prevalence of symptoms of anxiety and depression in patients with AS and to identify demographic, clinical, analytical, metrological and radiological data that may predict their presence.PATIENTS AND METHODS: Cross-sectional study performed in 160 AS patients attended in accordance with a standard protocol. The following variables were evaluated: age, sex, marital status, educational level, employment status, time of evolution, age of onset, presence of peripheral arthritis, visual analogue scale (VAS) of pain, night pain, disease activity evaluated by patient (VAS), presence of uveitis, previous surgery, comorbidity, smoking habit, BASFI, HAQEA, BASDAI, HLA B27, ESR, RCP, modified Schober test, thoracic expansion, occiput-wall distance, radiological sacroileitis and BASRI of cervical and lumbar spine and hips. Depression was assessed with the adapted Spanish language version of Beck's Depression Inventory (BDI). Scores of 18 or above were taken as representative of depression. Anxiety was assessed by the State Trait Anxiety Inventory (STAI) including the subscales of Trait (T) and State (S). Scores of 8 or above on either subscale were considered to reflect presence of Anxiety symptoms. In the statistical study, we performed a descriptive study and an analytical study including bivariate and multivariate analyses with logistic regression models for qualitative variables and linear regression models for quantitative variables.RESULTS: Symptoms of Depression were found in 23.1% of patients, State Anxiety in 23.1% and Trait Anxiety in 24.4%. BDI and STAI S and T scores were associated with pain, night pain, disease activity evaluated by the patient, BASFI, HAQEA, BASDAI and BASRI in lumbar spine. BDI scores were associated with Anxiety. STAI S scores were also associated with BDI and STAI T and STAI T scores with comorbidity, ERS, Modified Schober's test, BDI and STAI S. In Hierarchical Regression Analysis, BASFI was the only independent variable associated with Depression and Anxiety. Variables included in this analysis explained 26.4% of values for Depression, 24.4% for STAI S and 23.7% for SRAI T.CONCLUSIONS: Psychological symptoms of Depression and Anxiety are frequent in patients with AS and are related fundamentally to activity and functional capacity. The functional capacity observed by BASFI is the only independent determinant of the presence of psychological symptoms. An association was found between symptoms of Depression and symptoms of Anxiety.

The human body is an over-actuated multibody system, as each joint degree of freedom can be controlled by more than one muscle. Usually, optimization techniques are used to solve the muscle force sharing problem, that is, finding out how the resultant joint torque is shared among the muscles spanning that joint. The reduction of muscle force redundancy can be achieved in several ways. Although the strategy followed by the central nervous system (CNS) to activate the muscles is not completely clear, one of the most used hypotheses to overcome this redundancy is to consider that the CNS minimizes a physiological variable. In the first study presented in this thesis, the solution to the muscle force sharing problem was approached by minimizing the sum of squared normalized muscle forces. For this purpose, a weighted cost function was designed to evaluate which muscles were more penalized in a subject with anterior cruciate ligament (ACL) deficiency during walking. The results showed that the cost function that best fitted normalized electromyography signals with muscle activations did not treat all muscles equally. Another way to reduce muscle redundancy is using the idea that muscles are activated synergistically when performing a task. In the second study, a muscle synergy analysis was carried out to compare the muscle activation information at two levels: onset-offset activation patterns and muscle synergy components of a sample of 18 ACL-deficient subjects and a sample of 10 healthy subjects. Some differences were found at both levels, what suggests that ACL-deficient subjects alter the muscle activations of their injured leg to stabilize the joint. Finally, in the third study, muscle synergies were used in a two-step optimization method to predict physiologically consistent muscle and knee contact forces, while calibrating muscle parameters. In the outer level, muscle parameters were calibrated; while, in the inner level, muscle activations were calculated using the current muscle parameters. The results showed that a set of muscle parameters were able to reproduce knee contact forces with high accuracy when knee contact forces were used during the calibration process. This study shows the main differences when these forces are available for calibrating muscle parameters and when they are not. The most important differences in the muscle parameter calibration affected lateral muscles. Therefore, this fact suggests that trials where lateral muscles play a more important role should be used to obtain a better calibration when no contact forces are available. / El cos humà és un sistema multisòlid sobreactuat, ja que cada grau de llibertat pot estar controlat per més d’un múscul. Per resoldre el problema d’indeterminació en el càlcul de les forces musculars, es sol utilitzar un mètode d’optimització. Consisteix en distribuir els moments articulars resultants entre els diferents músculs que actuen a l’articulació, i per tant, estimar la força que aquests realitzen. La reducció de la indeterminació en el càlcul de les forces musculars es pot aconseguir de diferents maneres. Malgrat que l’estratègia que fa servir el sistema nerviós central (SNC) per activar els músculs no es coneix amb exactitud, una de les hipòtesis més utilitzades per solucionar la indeterminació és el fet de considerar que el SNC minimitza una variable fisiològica. El primer estudi presentat en aquesta tesi tractava de resoldre el problema del repartiment muscular minimitzant la suma de les forces musculars normalitzades al quadrat. Per a tal fi, es va utilitzar una funció de cost ponderada per avaluar quins músculs es penalitzen més en la marxa d’un subjecte amb el lligament creuat anterior trencat. Els resultats mostren que la funció de cost que millor aproximava les activacions musculars amb el senyal d’EMG mesurat no tractava tots els músculs per igual. Una altra manera de reduir la indeterminació en el càlcul de les forces muscular és utilitzar la idea que els músculs s’activen sinèrgicament quan l’ésser humà realitza un moviment. En el segon estudi, es presenta una anàlisi de les sinergies musculars que compara la informació de les activacions a dos nivells: en els patrons d’activació-desactivació i en els components de les sinergies musculars d’una mostra de 18 subjectes amb ruptura del lligament creuat i una mostra de 10 subjectes sans. Es van observar diferències als dos nivells, el qual suggereix que els subjectes amb ruptura al lligament creuat alteren les activacions musculars de la seva cama lesionada per tal d’estabilitzar l’articulació lesionada, en aquest cas el genoll. Per últim, en el tercer estudi, es van utilitzar les sinergies musculars junt amb un problema d’optimització de dues etapes per tal de predir les forces musculars i de contacte al genoll de manera fisiològicament consistent, alhora que es calibren els paràmetres musculars. En el nivell exterior de l’optimització, es calibren els paràmetres musculars, mentre que en el nivell interior, es calculen les activacions musculars amb els corresponents paràmetres musculars. Els resultats indiquen que un conjunt de paràmetres musculars pot predir les forces de contacte al genoll amb alta precisió quan es disposa de les forces experimentals de contacte al genoll durant el procés de calibratge. Aquest estudi presenta les diferències entre el cas en què s’utilitzen les forces experimentals de contacte al genoll per calibrar els paràmetres i quan no s’utilitzen. A més, suggereix que si s’utilitzessin captures biomecàniques de moviments on els músculs laterals tinguessin un rol més important que en la marxa, el calibratge dels paràmetres seria més acurat. Per tant, es podrien predir les forces de contacte al genoll amb més precisió quan no es disposa d’aquestes.

El objetivo principal de esta tesis es el estudio de la aplicación de microindentación del hueso en la clínica. El uso de la densidad mineral ósea para evaluar la calidad ósea no es suficiente. De hecho, hay pacientes con densidad mineral ósea normal o casi normal que presentan fracturas. Se ha publicado que la capacidad predictiva de la densidad mineral ósea para el riesgo de fractura oscila entre el 65-70%. Esto podría explicarse por el hecho de que con la densidad mineral ósea estamos midiendo uno de los elementos de la resistencia ósea, pero quedan otros componentes sin medir. La microindentación es una nueva técnica que puede medir las propiedades del material del hueso directamente in vivo. Esta técnica permite determinar la dureza de un material, considerando dureza la resistencia a la penetración del indentador. La técnica de la microidentación consiste, por tanto, en aplicar una fuerza sobre la superficie ósea y medir la resistencia del material a la penetración en la superficie. Esta nueva técnica nos permite medir las propiedades intrínsecas del hueso in vivo. Hemos publicado dos artículos principales que validan la técnica. El primero de ellos muestra la validez de la técnica y su aplicabilidad clínica. En este primer trabajo, se estudian las diferentes propiedades materiales del hueso de dos grupos: uno de mujeres con fracturas osteoporóticas y el otro sin fracturas. Tras ajustar por edad encontramos que los pacientes con fracturas osteoporóticas tienen peores propiedades materiales, medidos por microindentación, en comparación con el grupo control. Y eso era, además, independiente de la densidad mineral ósea. Asimismo, en un estudio con microscopía electrónica hemos observado que tras la microindentación se ha producido la apertura de microcracks en la cortical ósea. Esto es muy similar a lo observado en fracturas inducidas en el laboratorio. En este estudio, la variabilidad interobservador fue baja. En el segundo artículo se estudiaron las propiedades materiales del hueso en pacientes que presentaron fracturas femorales atípicas tras tratamiento prolongado con bisfosfonatos (más de cinco años). Estos pacientes presentaron peores propiedades materiales que los controles a pesar de tener densidad mineral ósea normal o casi normal. Y, además, sus propiedades materiales no fueron diferentes a aquellos pacientes con fracturas femorales típicas. Asimismo, aunque, no encontramos diferencias con otro grupo de pacientes que han estado largo tiempo en tratamiento con bifosfonatos (más de cinco años) los valores de microindentación estaban en otro orden de magnitud sugieriendo peores propiedades materiales del hueso en el grupo de las fracturas femorales atípicas. En conclusión, hemos validado una nueva herramienta de diagnóstico para enfermedades óseas que mide un componente diferente de la calidad del hueso respecto de la densidad mineral ósea. La microindentación permite la medición de las propiedades materiales del hueso in vivo, y representa un progreso importante en la comprensión de enfermedades óseas. Su aplicación no sólo será para el diagnóstico, sino también para la evaluación de las propiedades materiales del hueso en otras condiciones clínicas. / The main objective of this thesis is to study the application of microindentation of the bone by in clinics. Bone mineral density, measured clinically to assess bone quality, is not enough. There are many patients with normal or near normal bone mineral density that have fractures to accurately predict bone’s risk of fracture. It was found to predict 65-70% of fracture risk. This could be explained by the fact that with bone mineral density we are measuring one of the elements of bone strength. Microindentation is a new technique which can measure bone material properties directly in vivo. The indentation technique allows us to determine the hardness of a material. The hardness is the resistance to the penetration of a hard indenter. This test consists of applying a force on the indenter and then measuring the material’s resistance to the surface penetration. With this new technique we are able to measure intrinsic bone material properties in vivo. We have published two main articles validating the techinque. The first of them shows the reliability of the technique and its applicability. In this first paper, we study the bone material properties differences between two groups of women with osteoporotic fractures and without fractures, after adjusting by age we found that patients with osteoporotic fractures had worse material properties measured by microindentation when compared with control patients. And that was independent of bone mineral density. In the paper we also studied what is going on on bone at microscale structure, and we described the existence of cracks induced by microindentation. The interobserver variability was low. In the second article we studied the bone material properties in patients that have atypical femoral fractures after long term bisphosphonates treatment. We reported that those patients had worse material properties than controls, eventhough they had normal or near normal bone mineral density. And their bone material properties were not different to those patients with typical femoral fractures. And, although, we did not find differences with another group of patients that have been long time in bisphosphonate treatment the microindentation values were in a different order of magnitude suggesting a worse material properties in the atypical femoral fractures group. In conclusion we have validated a new diagnostic tool for bone that measures a different side of bone quality than bone mineral density. Microidnetation allows the measurement of bone material properties in vivo, and without harm to patients, and it represents a major progress in understanding bone diseases and could be applied not only for diagnostic but also to the assessment of bone material properties in other clinical conditions.

El recién nacido prematuro y los bebés de bajo peso al nacer frecuentemente presentan retrasos/anomalías en el desarrollo motor, cognitivo y emocional(1). Son una población que será clasificada como niños con riesgo de retraso en el desarrollo psicomotor(2). Uno de los diagnósticos más frecuentes en esta población es el de parálisis cerebral (PC)(3), que suele establecerse a partir de los 12 meses de edad del niño(4). El tapiz rodante se ha utilizado en población pediátrica con diferentes diagnósticos para estimular la adquisición de la marcha autónoma, como aspecto clave del desarrollo motor del niño, dada la relación que tiene con aspectos cognitivos y emocionales(5). Estudios en niños con PC(6,7) han resultado en una mejora de sus capacidades globales de desarrollo después de recibir la intervención. El impacto del entrenamiento con el tapiz rodante se desconoce en el caso de población clasificada como con riesgo. Esta tesis, que se presenta como compendio de publicaciones, plantea dos objetivos principales en relación a esta población: (1) explorar el estado actual de la evidencia científica respecto a la respuesta al tapiz rodante de los niños con riesgo de retraso en el desarrollo motriz, y (2) estudiar los efectos del entrenamiento de la marcha con el tapiz, en relación al desarrollo motriz y a la adquisición de la marcha autónoma. Para responder al primero de los objetivos, se realizó una revisión sistemática de la literatura publicada sobre las intervenciones con tapiz rodante en niños con riesgo de retraso en el desarrollo motriz, con edades comprendidas de los 0 hasta los 6 años. Las conclusiones principales encontradas en esta revisión fueron que faltaban ensayos clínicos controlados con muestras mayores en población con riesgo, sobre todo en relación al estudio de los efectos del entrenamiento de la marcha con el tapiz. En relación al segundo de los objetivos de esta tesis, se presentan los resultados de un ensayo clínico controlado realizado con una muestra de 28 niños con riesgo de retraso en el desarrollo motriz. Aproximadamente la mitad recibieron un entrenamiento protocolizado de la marcha con el tapiz. Al inicio del estudio los niños tenían edades comprendidas entre los 8 y los 11 meses. En este estudio no se observaron diferencias entre grupos en cuanto a la edad de inicio de la marcha autónoma, pero sí se vio una mejora en la calidad de los pasos en el tapiz, en aquellos sujetos que habían recibido el entrenamiento. Asimismo, se estableció una relación significativa entre la frecuencia de pasos en el tapiz y la edad de inicio de la marcha autónoma. Finalmente, se hizo un tercer estudio de caso con unas mellizas con antecedentes de prematuridad leve, en el cual se implementó un entrenamiento individualizado a partir de los 8 meses de edad, a la melliza que mostró mayor retraso motriz. Las conclusiones de este estudio fueron que, posiblemente, el entrenamiento con el tapiz tuvo un impacto positivo sobre la velocidad de desarrollo motriz de la melliza entrenada. En relación a aspectos de locomoción y la respuesta al tapiz rodante, se observó una mejora en la calidad de los pasos, y un aumento en la frecuencia de pasos alternos sobre el tapiz. Esto ocurrió en ambas mellizas, pero de una manera más acentuada en la melliza que recibió el entrenamiento. Como síntesis final, el tapiz rodante es una herramienta en uso creciente en el ámbito de la pediatría para potenciar aspectos relacionados con la locomoción. La evidencia científica disponible hasta la fecha indica que el entrenamiento de la marcha con el tapiz puede tener efectos positivos en niños con riesgo de retraso en el desarrollo motriz, tanto para la detección de retrasos o anomalías en el desarrollo, como para la prevención de retrasos más severos en relación a la adquisición de la marcha autónoma. Conseguir este hito motriz es de gran importancia, ya que conllevará la autonomía del niño, la cual es fundamental dada la relación de la misma con el desarrollo cognitivo y con la calidad de vida de las personas. Referencias 1. Almond D, Chay KY, Lee DS. The costs of low birth weight. Q J Econ. 2005;120(3):1031-1083. 2. Angulo-Barroso R, Tiernan CW, Chen L, Ulrich D, Neary H. Treadmill responses and physical activity levels of infants at risk for neuromotor delay. Pediatr Phys Ther. 2010;22(1):61-68. 3. Korvenranta E, Lehtonen L, Peltola M, et al. Morbidities and hospital resource use during the first 3 years of life among very preterm infants. Pediatrics. 2009;124(1):128-134. 4. Wood E. The child with cerebral palsy: Diagnosis and beyond. Semin Pediatr Neurol. 2006;13(4):286-296. 5. Campos JJ, Anderson DI, Barbu-Roth MA, Hubbard EM, Hertenstein MJ, Witherington D. Travel broadens the mind. Infancy. 2000;1(2):149-219. 6. Richards CL, Malouin F, Dumas F, Marcoux S, Lepage C, Menier C. Early and intensive treadmill locomotor training for young children with cerebral palsy: A feasibility study. Pediatr Phys Ther. 1997;9(4):158-165. 7. Mattern-Baxter K, McNeil S, Mansoor JK. Effects of home-based locomotor treadmill training on gross motor function in young children with cerebral palsy: A quasi-randomized controlled trial. Arch Phys Med Rehabil. 2013;94(11):2061-2067. 8. Begnoche DM, Pitetti KH. Effects of traditional treatment and partial body weight treadmill training on the motor skills of children with spastic cerebral palsy. A pilot study. Pediatr Phys Ther. 2007;19(1):11-19. 9. Day JA, Fox EJ, Lowe J, Swales HB, Behrman AL. Locomotor training with partial body weight support on a treadmill in a nonambulatory child with spastic tetraplegic cerebral palsy: A case report. Pediatr Phys Ther. 2004;16(2):106-113. 10. Valentin-Gudiol M, Mattern-Baxter K, Girabent-Farres M, Bagur-Calafat C, Hadders-Algra M, Angulo-Barroso RM. Treadmill interventions with partial body weight support in children under six years of age at risk of neuromotor delay. Cochrane Database Syst Rev. 2011;(12):CD009242. 11. Angulo-Barroso RM, Tiernan C, Chen LC, Valentin-Gudiol M, Ulrich D. Treadmill training in moderate risk preterm infants promotes stepping quality--results of a small randomised controlled trial. Res Dev Disabil. 2013;34(11):3629-3638. / Low birth-weight and premature infants are considered to be at risk for neuromotor, cognitive and emotional developmental delays(1). Some of these infants are diagnosed with cerebral palsy (CP), while others with early motor behaviour problems do not develop CP(2). Locomotor difficulties have been demonstrated in children with CP. Studies in children with CP have used a paediatric treadmill to improve functional gait and ambulation. Treadmill training (TT) has been shown to improve ambulatory capability in children with CP6(8,9). However, little is known about the impact of such training in infant populations at risk for neuromotor delay. This thesis aimed to: (1) assess the current state of scientific evidence regarding treadmill interventions in infants at risk for neuromotor delays (ND), and (2) to study the effects of TT in relation to motor development and the onset of independent walking. First, a systematic review about treadmill interventions in children under 6 years of age at risk of ND was carried out. The findings indicated that task-specific training (TT for independent walking acquisition) might be a useful tool to promote development in children at risk for ND. However, the number of studies found was limited and fairly heterogeneous, especially regarding the type of population studied (different diagnoses), treadmill parameters and training protocols(10). A controlled clinical trial was then conducted with a sample of 28 infants at risk for ND. The experimental group, which received TT (entry age 8-11 months), demonstrated an improvement in step quality. Although no differences were found between groups regarding age of onset of independent walking, a significant relationship between treadmill step frequency and onset of independent walking was established(11). Finally, an individualised TT protocol was implemented in a case study of twins with a history of mild prematurity. At 8 months corrected age, the twin who showed greater motor delays started to receive TT. An increase in the rate of gross motor development was shown in the trained twin 2 months after training had started. Improvement in step quality and frequency of alternate treadmill steps occurred in both twins, but was more accentuated on the trained one. In conclusion, TT may be considered as a useful tool to potentiate aspects related to locomotion in infants with or at risk for ND. Locomotion and walking acquisition is a key milestone for all children since it is associated with cognitive and emotional development(5), as well as quality of life. Referencias 1. Almond D, Chay KY, Lee DS. The costs of low birth weight. Q J Econ. 2005;120(3):1031-1083. 2. Angulo-Barroso R, Tiernan CW, Chen L, Ulrich D, Neary H. Treadmill responses and physical activity levels of infants at risk for neuromotor delay. Pediatr Phys Ther. 2010;22(1):61-68. 3. Korvenranta E, Lehtonen L, Peltola M, et al. Morbidities and hospital resource use during the first 3 years of life among very preterm infants. Pediatrics. 2009;124(1):128-134. 4. Wood E. The child with cerebral palsy: Diagnosis and beyond. Semin Pediatr Neurol. 2006;13(4):286-296. 5. Campos JJ, Anderson DI, Barbu-Roth MA, Hubbard EM, Hertenstein MJ, Witherington D. Travel broadens the mind. Infancy. 2000;1(2):149-219. 6. Richards CL, Malouin F, Dumas F, Marcoux S, Lepage C, Menier C. Early and intensive treadmill locomotor training for young children with cerebral palsy: A feasibility study. Pediatr Phys Ther. 1997;9(4):158-165. 7. Mattern-Baxter K, McNeil S, Mansoor JK. Effects of home-based locomotor treadmill training on gross motor function in young children with cerebral palsy: A quasi-randomized controlled trial. Arch Phys Med Rehabil. 2013;94(11):2061-2067. 8. Begnoche DM, Pitetti KH. Effects of traditional treatment and partial body weight treadmill training on the motor skills of children with spastic cerebral palsy. A pilot study. Pediatr Phys Ther. 2007;19(1):11-19. 9. Day JA, Fox EJ, Lowe J, Swales HB, Behrman AL. Locomotor training with partial body weight support on a treadmill in a nonambulatory child with spastic tetraplegic cerebral palsy: A case report. Pediatr Phys Ther. 2004;16(2):106-113. 10. Valentin-Gudiol M, Mattern-Baxter K, Girabent-Farres M, Bagur-Calafat C, Hadders-Algra M, Angulo-Barroso RM. Treadmill interventions with partial body weight support in children under six years of age at risk of neuromotor delay. Cochrane Database Syst Rev. 2011;(12):CD009242. 11. Angulo-Barroso RM, Tiernan C, Chen LC, Valentin-Gudiol M, Ulrich D. Treadmill training in moderate risk preterm infants promotes stepping quality--results of a small randomised controlled trial. Res Dev Disabil. 2013;34(11):3629-3638.

La resección meniscal o meniscectomía fue el tratamiento de elección de las lesiones meniscales durante mucho tiempo. Desde que la literatura reportó reiteradamente los cambios articulares degenerativos tras este gesto quirúrgico a largo plazo, la forma de tratar estas lesiones ha ido cambiando hacia un proceder cada vez más conservador. Además, la resección meniscal conlleva en muchos casos al dolor compartimental a medio o largo plazo, denominado como síndrome postmeniscectomía. En un intento de paliar de forma biológica este dolor y de potencialmente prevenir la degeneración articular debida a una disminución de tejido meniscal, a mediados de los años 80’ se planteó el trasplante meniscal alogénico (TMA) como una posible solución. Esta alternativa terapéutica ha reportado buenos resultados a medio y largo plazo. Si bien el efecto positivo del TMA sobre el síndrome postmeniscectomía es ya incuestionable, el efecto condroprotector a largo plazo del TMA no ha sido claramente demostrado. Dentro de las técnicas de fijación del implante, si bien la fijación mediante suturas representa una menor dificultad técnica, estudios en cadáver han demostrado una mejor transmisión en las fuerzas de presión cuando la fijación se realiza con tejido óseo conservado en el menisco trasplantado. Sin embargo, la superioridad clínica de una técnica de fijación sobre la otra no ha sido demostrada. El término extrusión meniscal hace referencia a la situación en la que el tejido meniscal se encuentra al menos en un 25% desplazado por fuera del margen tibial. Es evidente y así se ha sugerido, que este “desnudamiento” de la superficie tibial atenta contra el normal funcionamiento biomecánico del menisco. Trasladando esta situación de extrusión meniscal al contexto del TMA podría limitar los potenciales beneficios de ésta técnica. Incluso se ha especulado sobre si el método de fijación del injerto puede afectar la mecánica articular. Otro tema de controversia alrededor del TMA, es el método de preservación del injerto. Mientras que la liofilización se ha dejado de usar dado que se ha demostrado que altera la ultraestructura del injerto conllevando a pobres resultados funcionales, la congelación ha resultado ser un método simple y con buenas resultados funcionales. Sin embargo, aunque para algunos autores con la congelación simple el injerto seguiría mantenimiento sus características biomecánicas, recientemente Gelber et al. han demostrado que esta congelación afecta la ultraestructura de la red colágena. Esto puede evitarse con la criopreservación del tejido que incluso parece mantener la estructura celular, aunque este último punto también está en debate. Finalmente, el injerto fresco se presentaría como la opción más idónea, ya que no produce destrucción celular e incluso preserva la capacidad de producir proteoglicanos y fibras de colágeno por dichas células. La principal limitación de esta técnica de preservación meniscal es la dificultad logística y la necesidad de incubar previamente al injerto a trasplantarse con el suero del receptor, aunque esto último se podría evitar si se utilizasen medios de cultivo genéricos como el Insulin-Transferrin-Selenio (ITS). Sin embargo, no se ha reportado hasta la fecha su utilización en el terreno de la conservación meniscal. / Meniscectomy or meniscal resection was the treatment of choice for meniscal injuries for a long time. Once the literature repeatedly reported degenerative joint changes after this surgical action, the way to treat these injuries has shifted towards increasingly conservative procedures. Furthermore, meniscal resection often provokes medium to long term compartmental pain, which is called postmeniscectomy syndrome. In an attempt to alleviate this pain by biological means and potentially prevent joint degeneration due to decreased meniscal tissue, meniscal allograft transplantation (MAT) was put forth as a possible solution in the mid-80's. This alternative therapy has reported good results in the medium and long term. While the positive effect of TMA on the postmeniscectomy syndrome is unquestionable, the long-term chondroprotective effect of TMA has not been clearly demonstrated. Within the area of implant fixation techniques, while fixation with sutures has shown less technical difficulty in cadaver studies, it has shown a better transmission of the pressure forces when the fixing is done with the bone tissue in the preserved transplanted meniscus. However, the clinical superiority of one technique over another has not been demonstrated. The term meniscal extrusion refers to the situation in which the meniscal tissue is displaced by at least 25% outside the tibial margin. It is obvious and as has been suggested that this "stripping" of the tibial surface undermines the normal biomechanical functioning of the meniscus. Transferring this situation of meniscal extrusion to the context TMA may limit the potential benefits of this technique. It has even been speculated that the graft fixation method can affect joint mechanics. Another topic of controversy surrounding the TMA is the graft preservation method. While lyophilization is no longer used as it has been shown to alter graft ultrastructure and so lead to poor functional results, freezing has proven to be a simple method with good functional results. Although for some authors the graft would continue maintaining its biomechanical characteristics with simple freezing, Gelber et al. have recently shown that this freezing affects the ultrastructure of the collagen network. This can be avoided with tissue cryopreservation that even appears to maintain cellular structure, although the latter is also being debated. Finally, the fresh graft is presented as the most suitable option as it does not produce cellular destruction and even preserves the ability of said cells to produce proteoglycans and collagen fibers. The main limitation of this meniscal preservation technique is the logistical difficulty and the need to previously incubate the graft to be transplanted in serum from the recipient, even though the latter could be avoided if generic culture media such as Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) is used. However, its use in this field of meniscal conservation has not been reported, to date.

Objetivos: La osteoporosis es una enfermedad ósea definida por la pérdida de masa ósea generalizada con un elevado riesgo de fracturas óseas asociado a una alta morbimortalidad. Las Células Stem Mesenquimales (CSM) de médula ósea (MO) pueden representar un tratamiento óptimo para la osteoporosis debido a su capacidad innata de diferenciación a osteoblastos. Aunque el injerto de las CSM ha sido demostrado, su tropismo óseo es bajo cuando se administran de forma intravenosa, imprescindible para el tratamiento de esta enfermedad sistémica. Su tropismo depende de la interacción de sus receptores de superficie con los que se encuentran en las células endoteliales. La proteína E-selectina es inducida en el endotelio de la microvasculatura de tejidos inflamatorios en respuesta a citoquinas y es constitutivamente expresada en las células endoteliales de MO. La glicoforma de CD44 (HCELL), un potente ligando de E y L-selectina, es expresada de forma innata por las Células Stem Hematopoyéticas (CSH). HCELL es la molécula clave para el reclutamiento celular hacia la MO. Las CSM expresan CD44 pero no HCELL ni otros ligandos de E-selectina de forma constitutiva. La fucosilación (adición de una fucosa) ex vivo en posición α1,3 del antígeno CD44 mediante la enzima fucosiltransferasa VI (FTVI) produce HCELL en las CSM, incrementando su afinidad por E-selectina y por tanto su osteotropismo. EL objetivo de este estudio preclínico es evaluar la seguridad y la eficacia de las CSM humanas fucosiladas en un modelo murino inmunocomprometido (NOD/SCID). Métodos: 31 ratones NOD/SCID fueron randomizados a recibir de forma intravenosa: 1x106 CSM fucosiladas (n=13), 1x106 CSM (n=14), o salino (n=4). Las toxicidades fueron evaluadas por un score clínico, peso y un examen histológico (corazón, pulmón, hígado, bazo, riñón, gónadas, cerebro, hueso y MO). Se realizó estudio de biodistribución mediante detección de los genes β-actina y β2-microglobulina humanas. La integridad genética fue evaluada por cariotipo. Se realizó inmunohistoquímica con un anticuerpo policlonal anti-Osteocalcina humana para valorar eficacia. Las células osteocalcina positivas fueron identificadas por un precipitado citoplasmático de color marrón oscuro. Resultados: No se produjo ningún fallecimiento inesperado y ningún ratón mostró toxicidad aguda. Un ratón en el brazo de salino presentó toxicidad crónica leve (piloerección y cambios moderados en el comportamiento). La histología de corazón, hígado, bazo, riñón, cerebro, hueso y MO fue normal en todos los ratones. Se objetivaron áreas localizadas inflamatorias en los pulmones de un 15%, 42% y 25% de los ratones infundidos con CSM fucosiladas, CSM y salino respectivamente sin diferencias significativas (p=0.28). La biodistribución fue normal en todos los ratones con la excepción de un ratón (infundido con CSM sin fucosilar) que mostró expresión de ARN humano (β-actina and β2-microglobulina) en la muestra pulmonar tomada a las 12 semanas después de la infusión. Se observaron osteoblastos en el 100% de los ratones infundidos con CSM fucosiladas, en 62,5% de los infundidos con CSM, y ninguno en el grupo de salino (p=0.01). Los ratones infundidos con CSM fucosiladas presentaron un mayor número de osteoblastos osteocalcina positivos en 10 campos de gran aumento (400x) de secciones de tibia y calota con respecto a los infundidos con no fucosiladas (32 vs 5.5) (p=0.0082). Las CSM fucosiladas. Los osteoblastos humanos fueron detectados en el hueso desde la quinta a la doceava semana post-infusión. Conclusiones: Nuestro ensayo preclínico demuestra que la infusión intravenosa de CSM fucosiladas es segura y eficaz en guiar las células al hueso con un potencial más elevado de osificación en ratones NOD/SCID que las CSM no fucosiladas. Estos resultados van a permitir comenzar con un Ensayo clínico en humanos con CSM fucosiladas. / Objectives: Osteoporosis is a skeletal disease characterized by systemic bone loss with an increased risk to bone fractures, associated with high morbidity and mortality. Mesenchymal stem cells (MSC) from bone marrow (BM) are ideal candidates for the treatment of osteoporosis because they are able to differentiate to osteoblasts. Although bone graft of MSCs has been demonstrated, its osteotropism is low when they are administered intravenously (IV), of choice in this multifocal disease. MSC homing depends upon the adhesive interaction between MSC surface receptors and counter receptors on endothelial cells. E-selectin protein is induced on microvascular endothelium in inflammatory tissues in response to cytokines and it is constitutively expressed in BM endothelial cells. The Hematopoietic cell E and L-selectin ligand (HCELL), a glycoform of CD44, is a potent E-selectin ligand expressed constitutively in the Hematopoietic stem cells (HSC). HCELL represents the key to involve in cell recruitment to the BM. MSC express CD44 but do not express HCELL or other E-selectin ligands. Ex vivo fucosylation (adding a fucose residue) in α1-3 position of the CD44 antigen by use of the enzyme fucosyltransferase VI (FTVI) yields HCELL in MSC increasing the affinity for E-selectin and osteotropism. The aim of this preclinical study was to describe the safety and efficacy of human fucosylated MSC infused in an immunocompromised mice model (NOD/SCID). Methods: 31 NOD/SCID mice were randomized to by tail vein injection: 1x106 fucosylated MSC (n=13), 1x106 MSC (n=14) or saline (n=4). Toxicities were evaluated by a clinical score, weight and histological assessment (heart, lung, liver, spleen, kidney, gonads, brain, bone and BM). RT-PCR array-based evaluation of the expression of human β-actin and β2-microglobulin genes was performed to study biodistribution of MSC. The maintenance of genetic integrity was evaluated during in vitro culture by karyotype. Additional samples of tibia and calota were to immunostained with a polyclonal Rabbit anti-human osteocalcina to demonstrate efficacy. Osteocalcin-positive cells were identified by a dark-brown cytoplasmic precipitate. Results: There was no unexpected death and none of the mices had any acute toxicity. One mouse in the saline arm had mild chronic toxicity primarily manifested as piloerection, and moderate changes in behavior. The histology of heart, liver, kidney, spleen, gonads, brain, bone and bone marrow was normal in all mice. There were localized areas of lung inflammation in 15%, 42% and 25% of mice infused with fucosylated MSC, MSC, and saline, respectively without significance differences (p=0.28). Biodistribution was normal with except one mice (infused with MSC non-fucosylated) showed an expression of human RNA β-actin and β2-microglobulin in the lung sample taken after 12 weeks of intravenous infusion .Osteoblasts were seen in 100% of mices infused with fucosylated MSC, in 62.5%% of animals infused with MSC alone, and none in saline group (p=0.01). NOD/SCID mice infused with fucosylated MSC presented a higher number of osteoblasts positive for osteocalcin in 10 high-power fields (400x) of tibia and calvarium sections that non-fucosylated (32 vs 5.5) (p=0.0082). Human osteoblasts were detected inside the bone from the fifth to the twelfth week after infusion. Conclusions: Our preclinical trial demonstrate that the intravenous infusion of human fucosylated MSC is safe and effective in guiding the cells to bone with a higher potential to ossification in NOD/SCID mices that non-fucosylated MSC. These results are allowing to start a human clinical trial with intravenous fucosylated MSC as treatment in patients with osteoporosis.

L'artritis reumatoide (AR) és una malaltia crònica localitzada principalment en les articulacions, on es produeix inflamació de la membrana sinovial, degeneració del cartílag i l'os, que finalment originen la seva deformació i incapacitació. A més a més, l'AR és una malaltia autoimmunitària, on es desenvolupen diferents tipus d'autoanticossos, com el factor reumatoide dirigit contra la propia IgG i anticossos contra el col.làgen articular. Avui encara es desconeix l'etiologia i la patogènesi del procés artrític i per això resulta essencial disposar de models animals que presentin mecanismes patogènics semblants als de la malaltia humana per tal de dissenyar millors estratègies terapèutiques.L'artritis adjuvant (AA) és una patologia induïda en rata que es considera model d'AR i que cursa amb inflor, eritema, dolor i impotència funcional de les articulacions dels animals afectats. Avui s'accepta que aquesta patologia és mitjançada fonamentaJment per limfòcits T.En el present treball es va pretendre: identificar les poblacions cel.lulars presents en el teixit sinovial inflamat: esbrinar el possible paper dels limfòcits T gamma/delta, T CD4 i T CD8 en el desenvolupament i perpetuació de l'AA; i conèixer si la teràpia amb un anticòs monoclonal (AcMo) dirigit contra la molècula CD4 és capaç de modificar el curs de l'AA. Per assolir els objectius esmentats, és a dir, per delimitar quines subpoblacions de limfòcits T estan implicades en l'AA, es van realitzar diferents protocols d'immunoteràpia amb AcMo dirigits contra determinades molècules de superfície presents en els limfòcits T alfa/beta, T gamma/delta, T CD4 i T CD8.Yoshino i col.laboradors, al 1990, ja van demostrar la implicació dels limfòcits T alfa/beta en el desenvolupament i en la perpetuació de l'AA, i en el present estudi el mateix AcMo R73 dirigit contra el TCR-alfa/beta de rata ha estat utilitzat com a control positiu de tractament. Fins a l'actualitat no es coneixia el paper dels limfòcits T gamma/delta a l'AA a causa de que no existia un AcMo anti-TCR-gamma/delta de rata. En el present treball, i gràcies al recent descobriment per part del grup del Prof. Hünig de Würzburg de l'AcMo V65 s'ha pogut avaluar la implicació d'aquestes cèl.lules en aquest model experimental. D'altra banda, també s'han realitzat estudis d'immunoteràpia emprant un AcMo anti-CD4. el W3/25, que no havia estat utilitzat anteriorment en l'AA, i que per tant, no es coneixia el seu potencial terapèutic en aquest model experimental. A més a més, s'ha assajat la teràpia combinada anti-CD4 + anti-CD8, que tampoc no ha estat descrita fins a l'actualitat, i que ha permès determinar els efectes de la població CD8+ sobre els Iimfbcits T CD4+-. Totes aquestes teràpies anaven encaminades a inhibir el desenvolupament de l'AA.La inducció de l'AA en rates de la soca Wistar o Lewis es va realitzar mitjançant l'administració d'una suspensió de Mycobaeterium butyricum o de Mycobaeterium tuberculosis al 0,5% en vaselina liquida, per via intradèrmica a la base de la cua. Durant els primers dies després de la inducció no s'observa cap signe extern i a partir dels 10-12 dies es manifesta una.inflamació sistèmica que afecta a les extremitats posteriors i sovint també a les anteriors de l'animal. En els diferents experiments s'ha realitzat un seguiment de la inflamació dels animals mitjançant paràmetres clínics, com l'índex d'artritis, que comprèn la valoració clínica del grau d'eritema i d'edema de les quatre articulacions; i l'increment de volum articular de les extremitats posteriors, mesurat per pletismometria.Per a l'anàlisi de les poblacions cel·lulars presents en teixit sinovial s'ha utilitzat una tècnica immunohistoquímica. Com a substrat s'han utilitzat talls criostàtics de membrana sinovial i la identificació de determinats antígens de membrana s'ha realitzat utilitzant AcMo dirigits contra aquests antígens de superfície cel·lular. La reacció s'ha revelat amb el mètode peroxidasa-anti-peroxidasa.A partir de mostres de plasma dels animals artrítics. s'ha detenninat la concentració d'anticossos dirigits contra el micobacteri, la concentració dels AcMo administrats i de la resposta dirigida contra aquests, mitjançant tècniques d'ELISA.Per a determinar l'efecte a nivell cel.lular dels AcMo administrats s'ha utilitzat la citometria de flux. Aquesta tècnica permet la identificació de poblacions cel.lulars mitjançant la detecció d'antígens de la seva superfície, prèviament marcats amb anticossos conjugats a un fluorocrom. Un pas previ per a l'anàlisi citomètrica de les poblacions de sang perifèrica és l'aïllament dels limfòcits. Amb el fi de conèixer quin mètode és el més adequat per analitzar els limtècits de sang perifèrica dels animals dels estudis d'immunoteràpia, es van comparar els efectes de quatre mètodes d'aïllament de limfòcits sobre sang de rata: gradient de Ficoll-Isopaque, lisi amb clorur amònic, lisi amb reactiu de Becton & Dickinson i lisi mitjançant el sistema Coulter Q-prep.Els limfòcits es van marcar amb AcMo dirigits contra diferents subpoblacions limfocítiques. En considerar tots els marcatges realitzats no es van trobar diferències entre els mètodes, la qual cosa dona validesa als 4 mètodes per a sang de rata. Però l'anàlisi estadística que va considerar els resultats obtinguts per cada AcMo per separat va mostrar algunes diferències significatives. El gradient Ficoll-Isopaque, és el que va proporcionar uns percentatges més baixos de limfòcits CDS+, CD4+ i CD25+, suggerim una pèrdua selectiva d'alguns limfòcits T. Per altra banda, amb el clorur amònic, es van obtenir els percentatges més baixos de limfòcits B, i aquest fet es pot atribuir a que una part dels limfòcits B són sensibles a les condicions d'aquest mètode. En els dos mètodes comercials, els percentatges corresponents a la majoria de les poblacions estudiades van presentar valors intermitjos. En el nostre estudi, es va triar el clorur amònic com a mètode de lisi per els estudis d'immunoteràpia. Aquest mètode no afecta selectivament cap població de limfòcits T i, a més a més permet realitzar el marcatge sobre cèl.lules aïllades i presenta un baix cost.Per conèixer quins tipus cel.lulars estan involucrats a nivell de l'articulació inflamada en l'AA, es va realitzar l'estudi histològic de la membrana sinovial de genoll. La membrana sinovial està formada per teixit conjuntiu i revesteix tota la cavitat articular, a excepció dels cartílags. El teixit sinovial artrític augmenta de mida i en general incrementa unes tres vegades el seu pes.L'estudi histològic de la membrana sinovial mostra en el teixit control una capa íntima formada per 1 ó 2 fileres de sinoviòcits i una capa subíntima formada per teixit adipós amb alguns vasos sanguinis. Als 14 dies de la inducció, amb inflamació articular ja establerta, a nivell sinovial s'observa un augment en el nombre de fileres de cèl.lules de la capa íntima. També s'observen plegaments cap a la cavitat articular. Existeix un gran nombre de cèl.lules mononuclears i gran quantitat de fibres de col.làgen en la capa subíntima.L'estudi immunohistoquímic de la membrana sinovial es va realitzar amb el mètode peroxidasa-antiperoxidasa. En alguns teixits sinovials inflamats, es van identificar algunes cèl.lules CD5+ amb l'AcMo OX19. Aquestes cèl.lules CD5+ no van aparèixer en cap teixit control sa. El nombre de cèl.lules CD8+ de la capa subíntima va incrementar significativament del dia 14 al 28 postinducció respecte als teixits control. L'AcMo W3/25, que s'uneix a l'antigen CD4 de limfòcits T col.laboradors i de macròfags, ja detecta cèl.lules positives en tots els teixits sinovials control i el seu nombre augmenta en els teixits artrítics. A causa de les poques cèl.lules CD5+ trobades i de la morfologia i la tinció citoplasmàtica d'aquestes cèl.lules es poden considerar macròfags. L'AcMo OX6 que detecta la molècula lA present en diferents tipus cel.lulars marca un gran nombre de cè1.lules a nivell de l'enzima sinovial dels animals control, i en els animals artrítics aquest nombre és molt elevat.Com a primer estudi d'immunoteràpia i per tal d'analitzar la implicació dels limfòcits T gamma/detla en l'AA, van portar a terme diferents protocols terapèutics amb un AcMo dirigit contra el TCR-gamma/delta de rata, l'AcMo V65. Es van desenvolupar diferents protocols d'administració d'aquest anticòs: un tractament preventiu, realitzat a animals nounats des del moment del naixement i a dosis creixents durant 8 setmanes, és a dir durant tot el període previ a la inducció de l'AA; i 2 tractaments curatius. Un dels protocols va consistir en administrar els anticossos els dies 12, 15 i l8, és a dir, començant abans del màxim d'inflamació articular i l'altre protocol, en el qual es van assajar tres dosis diferents de l'anticòs, es va iniciar durant el màxim d'inflamació, és a dir el dia 15. En els dos tractaments curatius. es va realitzar un tractament paral.lel amb l'AcMo R73, dirigit contra el TCR-alfa/beta, com a control positiu del tractament.En tractar amb l'AcMo V65 només es van observar algunes cèl.lules gamma/delta amb una expressió normal del seu TCR a nivell de sang perifèrica, ganglis limfàtics poplitis i mesentèrics. El que apareix és una població de limfòcits amb una expressió antigènica disminuïda de les molècules de TCR gamma/delta i de CD3 en la seva superfície. Aquest fet indica que l'AcMo V65 va produir la down-regulation del receptor i també la comodulació de la molecula CD3. Ara bé, el percentatge d'aquesta subpoblació amb el TCR modulat era inferior al percentatge de Iimfòcits T gamma/delta detectats abans del tractament, indicant que alguns limfòcits T van perdre totalment l'expressió del TCR o que es van depleccionar. El pretractament amb V65 des del naixement, que va provocar que aquests animals no tinguessin en cap moment Iimfòcits T gamma/delta amb expressió normal del seu TCR, no va aconseguir prevenir el desenvolupament de la patologia i els animals van seguir el mateix curs inflamatori que els animals artrítics control. El tractament curatiu amb l'AcMo V65, iniciat abans del màxim d'inflamació no va aconseguir modificar el volum articular respecte al grup artrític control d'isotip i el mateix va succeir amb la VSG. En canvi, l'AcMo R73, anti-TCR-alfa/beta, sí que mostra un efecte beneficiós, disminuint tant el volum articular com la VSG durant el tractament. El tractament curatiu iniciat durant el màxim d'inflamació tampoc va aconseguir modificar els paràmetres inflamatoris ni la VSG propis de les rates artrítiques, en cap de les dosis assajades.Tot i la manca d'efecte curatiu de l'AcMo V6S observada en les variables estudiades quan el tractament es va iniciar abans del màxim d'ínflamació, es va observar un grau de destrucció articular significativament superior a l'observat en les rates artrítiques control en fases tardanes de la patologia. Aquest fet indica un paper protector fase-depenent dels limfòcits T gamma/delta a l'AA.Després de descartar la intervenció directa dels limfòcits T gamma/delta en la patogènesi del procés artrític experimental, es va centrar l'atenció cap als limfòcits T alfa/beta, concretament cap a la població limfocítica CD4+ i la CD8+. Per estudiar la implicació d'aquestes dues poblacions limfocítiques en el desenvolupament de l'artritis, es va realitzar una immunoteràpia durant el període de latència, emprant l'AcMo anti-CD4 W3/25, a dosi de 3 mg, l'AcMo anti-CD8 OX8 a dosi d'1 mg i ambdós AcMo conjuntament.Durant el tractament amb els AcMo W3/25 i OX8 es van estudiar també els seus efectes a nivell cel.lular per citometria de flux. L'administració de l'AcMo anti-CD4 W3/25 va produir la down-regulation dels limfòcits T CD4+, mentre que l'administració de l'AcMo OX8 va produir la deplecció dels limfòcits T CD8+ de sang perifèrica. L'administració de l'AcMo anti-CD4 W3/25 durant el període de latència administrat sol o conjuntament amb l'AcMo OX8, va inhibir el desenvolupament del procés inflamatori de l'AA, fins i tot després d'una segona inducció de la patologia, fet que confirma el paper essencial dels limfòcits T CD4+ en la patogènesi de l'AA. En canvi, l'administració de l'AcMo anti-CD8 no va modificar el curs de l'artritis, seguint els animals tractats amb aquest AcMo un curs similar al grup artrític control, la qual cosa indica que els limfòcits T CD8+ no intervenen directament ni exerceixen un paper regulador sobre els limfòcits T CD4+ en la patogènesi de l'AA.Com a últim protocol terapèutic i amb el fi de conèixer la implicació dels limfòcits T CD4+ i els CD8+ en la perpetuació de l'AA, es va realitzar una immunoteràpia amb els mateixos AcMo que en l'estudi anterior però iniciant la teràpia el dia 14 postinducció. un cop l'artritis ja està establerta. En aquest estudi es va disposar també d'un grup tractat amb W3/25, un grup tractat amb OX8 i un grup tractat amb ambdós AcMo conjuntament.El tractament amb l'AcMo OX8 no va aconseguir modificar el procés inflamatori ja existent. D'altra banda, el tractament amb W3/25 sol o conjuntament amb l'anticòs OX8 va ser capaç de revertir el procés inflamatori, fet que indica una implicació directa dels limfòcits T CD4+ en la perpetuació de l'AA. Aquest efecte, però, va ser transitori, ja que va desaparèixer després de 6 dosis. Aquest fet es pot atribuir al desenvolupament d'anticossos contra les 1g de ratolí administrades. que es van detectar en els animals tractats amb W3/25. A l'avaluar els nivells d'anticossos anti micobacteri desenvolupats pels diferents grups de l'estudi, cal destacar que ¡'administració de l'AcMo OX8 administrat sol va produir nivells 4 vegades superiors al dels altres grups i que van ser elevats durant tot l'estudi, el que suggereix que els limfòcits T CDS5+ tenen un efecte regulador sobre les cèl.lules responsables de la resposta humoral dirigida contra el micobacteri.En resum, en aquest treball s'ha demostrat la implicació dels limfòcits T CD4+ o col.laboradors no només en la fase de desenvolupament del procés artrític. sinó també en el procés de cronificació, fet que permet considerar els limfòcits T CD4+ com a possibles dianes d'un tractament en l'AR humana. Cal tenir en compte, però, que aquest tractament s'ha de realitzar de forma contínua i amb molècules que no estimulin una resposta immunitària. A més a més, s'ha demostrat que els limfòcits T gamma/delta juguen un paper secundari en el desenvolupament de l'AA i que aquest paper és més aviat protector, modulant l'acció exercida per altres tipus cel.lulars en una determinada fase de la patologia. D'altra banda, els limtòcits T CD8+ no estan implicats en el desenvolupament de l'artritis, ni tan sols com a moduladors de l'acció dels limtòcits T CD4+ artritogènics. Per últim, malgrat la rellevància dels limfòcits T col.laboradors en el procés artrític, la presència d'aquestes cèl.lules a nivell inflamatori local és mínima, suggerint un efecte regulat majoritàriament per citocines des dels òrgans limfoides. / Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune disease characterized by joint chronic inflammation, associated with synovitis and erosion of cartilage and bone. Adjuvant arthritis (AA) is an experimental autoimmune disease in rats which shares certain clinical and immunological features with RA. Although the pathogenesis of AA is unknown, a strong T lymphocyte dependence has been described.The objectives of the present work were to identify cell populations present on inflamed tissue from arthritic rats and to determine the role of gamma/delta, CD4 and CDS T lymphocytes on the development and the perpetuation of adjuvant arthritis. For these purposes, we performed different immunotherapy protocols using monoclonal antibodies (MoAb) directed against alpha/beta, gamma/delta, CD4 and CD8 T cells.The immunohistochemical analysis of synovia revealed that only a few CD5+ cells appeared on some arthritic tissues. No CD5+ cell appeared on healthy lissues. Arthritic tissues showed a higher number of CD5+, CD4+ and Ia+ cells than healthy tissues.Immunotherapy with an anti-gamma/delta-TCR MoAb was applied according to a preventive and to a pre-peak and a late therapeutic schedule. Although all protocols down-regulated gamma/delta-TCR expression in peripheral blood and lymph nodes cells, none influenced clinical parameters of AA. If rats were treated before the clinical peak of AA, joint destruction was more severe than in vehicle-treated rats, suggesting a stage-dependent protective role of gamma/delta T cells in AA.To study the pathogenic role of CD4 and CD8 T cells on arthritis, an immunotherapy using an anti-CD4 MoAb, W3/25, an anti-CDS MoAb, OX8 or both together was performed during the latency period of AA. W3/25 (which was found to be non-depleting) alone or in combination with OX8 prevented the inflammatory process of AA. To ascertain if any of the last MoAb could reverse AA, an immunotherapy beginning on day 14 postinduction was applied. During treatment with W3/25, a strong amelioration of inflammatory signals occurred. This study indicates that CD4+ cells play an important role both on the initiation and the perpetuation of AA, while CD8+ cells do not appear relevant for the development of the disease.