The aim of this project was to produce and study a murine homozygous knock-in model containing a fast skeletal regulatory light chain (RLC) containing a Asp49toAla point mutation. The D49A mutation is in the functional calcium binding loop of RLC, which is believed to modulate muscle contraction in striated muscle. To introduce the mutation, a reversible knock-out/knock-in system was employed. The Cre/Lox-P strategy was used to conditionally knock-in the RLC D49A mutation. The generation of the knock-in mouse was attempted with two different breeding strategies consisting of two Cre mouse lines with differential expression patterns during development. The proposed animal was never produced because the RLC knock-out recombination event introduced a splicing error resulting in a stop codon in intron 2. Extensive DNA, RNA and protein analysis as well as histological, gross morphology and muscle physiology studies obtained from the animals of the two breeding strategies lead to the identification of the splicing error. Evidence for this outcome is presented. A recommendation for a different strategy in future studies is included.

Η geminin είναι ένα σχετικά καινούριο μόριο το οποίο διαθέτει καίριο ρόλο κατά την ανάπτυξη και την διαφοροποίηση, εξαιτίας του νευροποιητικού δυναμικού της, της ικανότητάς της να αλληλεπιδρά με μέλη των Hox και polycomb πρωτεϊνών, καθώς επίσης και να δρα σαν ρυθμιστής του κυτταρικού κύκλου, λειτουργώντας ως αναστολέας του παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA, CDT1. Στα πλαίσια της εργασίας αυτής, κλωνοποιήσαμε το γονίδιο της geminin στο ποντίκι το οποίο αποτελείται από 7 εξώνια και καλύπτει μία περιοχή γύρω στα 10Kb. Σχεδιάσαμε και κλωνοποιήσαμε ένα πλασμιδιακό όχημα στόχευσης για το γονίδιο της mgeminin και εισήγαμε 3 θέσεις loxP στο γενωμικό locus αυτής, με σκοπό να δημιουργήσουμε υπό συνθήκη ελλειμματικούς ποντικούς για το γονίδιό της. Χρησιμοποιώντας το συγκεκριμένο φορέα στόχευσης αδρανοποιήσαμε το γονίδιο της Geminin σε pc3 (protamine Cre 3) πολυδύναμα κύτταρα ποντικού, δημιουργώντας ετερόζυγους ES κλώνους που φέρουν το «floxed» αλληλόμορφο, καθώς επίσης και το αλληλόμορφο αγρίου τύπου. Το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο ελέγχθηκε τόσο με PCR όσο και με ανάλυση κατά Southern για την ορθότητα του ομόλογου ανασυνδυασμού. Ταυτοποιήσαμε 15 ορθά ανασυνδυασμένους ES κλώνους, οι οποίοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη δημιουργία υπό συνθήκη knockout ποντικών για το γονίδιο της geminin, μετά από έγχυση σε B6 βλαστοκύστεις και επακόλουθη μεταφορά αυτών σε θετές μητέρες. / Geminin is a novel bifunctional molecule with a pivotal role in the processes of differentiation and cell cycle regulation, due to its neuralizing potential, its ability to interact through Hox and polycomb group members, as well as in the inhibition of cell cycle progression through protein-protein interactions with the licensing factor Cdt1. We have cloned the mouse Geminin gene, which consists of 7 exons and spans approximately a region of 10Kb. We have generated a vector and introduced 3 loxP sites in the Geminin locus, in order to create conditional knockout mice. Using this knockout construct we inactivated the geminin locus in pc3 mouse embryonic stem cells, creating heterozygous ES clones, carrying a “floxed” and a “WT” allele for geminin. The mutant allele in the targeted ES cells has been verified with Southern blotting and PCR for the correct homologous recombination events. We identified 15 correctly targeted ES clones, which can be used for the generation of conditional geminin knockout mice, upon injection into B6 blastocysts and subsequent transfer to foster mothers.

To understand the pathophysiology of hearing loss, it is necessary to identify genes responsible for embryonic development of neurosensory cells in the inner ear. The aim of this work is to clarify the role of LIM-homeodomain transcription factor ISL1 in the development of these cells. Using Cre-loxP recombination strategy, we generated a mouse line with time and site- specific deletion of Isl1 gene in NEUROD1-Cre expressing cells (Isl1 CKO). Although the early development of stato-acoustic ganglion was not affected by Isl1 deletion, at E14,5, we observed abnormalities in neuronal migration, formation of spiral ganglion and axon guidance in the Isl1 CKO cochlea. The length of the cochlear sensory epithelium was shortened by 20% as a consequence of lower proliferation activity of sensory precursor cells. Our results suggest that ISL1 is necessary for spiral ganglion formation and innervation of the Organ of Corti. Key words: transcription factor ISL1, neurons, Cre-loxP system, mouse model

Plasmids are small, circular, extrachromosomal double-stranded genetic elements present in bacteria. Plasmids can replicate independently of the bacterial chromosome and play an important role as a transmitter of antibiotic resistance genes between bacteria. Antibiotic resistance genes have been shown to be selected for even in the presence of subinhibitory levels of antibiotics, but the effect of antibiotics on conjugation is not as well understood. To study this, we designed a novel conjugation tracking system utilizing a Cre-expressing plasmid and a chromosomal floxed blue fluorescent protein (BFP) gene. We found that our model worked opposite as intended as cells expressed BFP before conjugation and lost BFP expression upon recombination. An issue with the system was isolated to the direction of the single loxP site remaining after recombination. Both loxP sites were inverted but this did not restore the intended expression of BFP after recombination. Subsequently the system was modified to increase the space between the promoter region and the single loxP site remaining after recombination. This extension produced the desired result as BFP expression now increased upon recombination. Still, further work needs to be done to construct a Cre-expressing plasmid, tune expression of BFP, and show expression of yellow fluorescent protein (YFP) in our model before the system can be applied to clinical isolates.

Glaucoma is a heterogeneous group of diseases that is currently considered to be the leading cause of irreversible blindness worldwide. Of the identified risk factors, elevated intraocular pressure remains the only modifiable risk factor that can be targeted clinically. Ocular hypertension is often a result of dysregulation of aqueous humour fluid dynamics in the anterior eye segment. Aqueous humour drainage is regulated by structures located in the anterior chamber of the eye. In some circumstances dysregulation occurs due to developmental abnormalities of these structures. The malformation of structures in the anterior segment is thought to be due to a defect in the differentiation and/or migration of the periocular mesenchyme during development. Unique to vertebrates, the neural crest cell (NCC) population contributes to the periocular mesenchyme and is instrumental to the proper development of structures in the anterior segment. For many years our laboratory has examined the role of the Activating Protein-2 (AP-2) transcription factors that are expressed in the neural crest and vital during the development of the eye. The purpose of this research project is to investigate the role of AP-2β in the NCC population during the development of the anterior segment of the eye. Conditional deletion of AP-2β expression in the NCC population demonstrated that mutants have dysgenesis of structures in the anterior segment including defects of the corneal endothelium, corneal stroma, ciliary body and a closed iridocorneal angle. Loss of retinal ganglion cells and their axons was also observed, likely due to the disruption of aqueous outflow, suggesting the development of glaucoma. The data generated from this research project will be critical in elucidating the role of AP-2β in the genetic cascade dictating the development of the anterior eye segment in addition to providing scientific research with a novel model of glaucomatous optic neuropathy. / Thesis / Master of Science (MSc)

Murine polyomavirus is an important member of Polyomaviridae family offering potential applications in gene therapy and immunotherapy. Viral mutant analysis is crucial for study of the virus, however, commonly used methods of its production are laborious and give low yields. This thesis involves development of the new experimental system that can produce intact viral genome from recombinant plasmid in vivo using Cre/loxP-mediated recombination. One loxP site is unavoidably introduced into newly generated viral genome during recombination. Two variants of production plasmids generating wild type viral genome with incorporation of loxP between the poly(A) signal sites of early and late genes or into the intronic region of early genes were prepared. LoxP insertion between the poly(A) signal sites has a dramatic effect on viral gene expression and leads to complete loss of virus infectivity. Conversely, the infectious virus was obtained from the viral genome containing loxP site in the early intronic region. To ensure expression of Cre recombinase I also prepared stably transfected cell lines which can simplify the virus production. This thesis shows that newly designed system gives satisfactory yield of the virus, solves restrictions connected with commonly used methods and can be used for low infectious viral...

Η ανάπτυξη του ανοσοποιητικού συστήματος ξεκινά από πολυδύναμα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα, τα οποία διαδοχικά δίνουν γένεση σε ενδιάμεσους πληθυσμούς προγονικών κυττάρων οι οποίοι σταδιακά χάνουν την ικανότητά τους για αυτοανανέωση και τελικά δίνουν γένεση στα πλήρως διαφοροποιημένα κύτταρα της μυελικής και λεμφικής σειράς. Η συγκεκριμένη διαδικασία στηρίζεται στο λεπτό συντονισμό της αυτοανανέωσης, αλλά και της διαφοροποίησης, απαιτεί δε την έκφραση διαφορετικών γονιδίων που σχετίζονται με τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, τη μεταγραφική ρύθμιση γονιδίων, αλλά και συμπλόκων αναδιοργάνωσης της δομής της χρωματίνης που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση. Η geminin έχει προταθεί ότι ρυθμίζει την απόφαση ενός κυττάρου για πολλαπλασιασμό ή διαφοροποίηση. Αλληλεπιδρά με μεταγραφικούς παράγοντες, με σύμπλοκα αναδιάταξης της δομής της χρωματίνης, ρυθμίζοντας την έκφραση γονιδίων που ελέγχουν τη νευρωνική διαφοροποίηση. Παράλληλα, δρα σαν αναστολέας του κυτταρικού κύκλου, προσδενόμενη στο παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA, CDT1. Στόχος μας ήταν να διερευνήσουμε τον in vivo ρόλο της Geminin στη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό, στο ανοσοποιητικό σύστημα. Στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής, βασιζόμενοι στο σύστημα Cre-loxP, δημιουργήσαμε μύες που επιτρέπουν την υπό συνθήκη εξάλειψη (knockout) του γονιδίου της geminin, πλαισιώνοντας τα εξώνια 3 και 4 του γονιδίου της με θέσεις loxP. Η στόχευση του γονιδίου και η παρεμβολή των 3 loxP θέσεων πραγματοποιήθηκε σε pc3 εμβρυικά πολυδύναμα κύτταρα μυός, χρησιμοποιώντας κατάλληλο πλασμιδιακό knockout φορέα, που έφερε τη κασέτα επιλογής TKneo. Μετά από ένεση των ορθά ανασυνδυασμένων pc3 κλώνων σε βλαστοκύστεις, τη δημιουργία χιμαιρικών μυών που εκφράζουν την Cre ρεκομπινάση στη γαμετική σειρά, και την επακόλουθη διασταύρωσή τους με μύες αγρίου τύπου, δημιουργήθηκαν ετερόζυγοι μύες για το πλαισιωμένο με loxP θέσεις αλληλόμορφο της Geminin, που παράλληλα έφερε και τη κασέτα επιλογής TKneo («floxed-ΤΚneo»), το πλαισιωμένο με loxP θέσεις αλληλόμορφο της Geminin, που στερούνταν της κασέτας επιλογής TKneo (floxed), καθώς επίσης και το αλληλόμορφο που στερούνταν των εξωνίων 3 και 4 και είναι το πλήρες knockout (ΔGEM ΚΟ -null) αλληλόμορφο). Από διασταυρώσεις ετερόζυγων για το ΔGEM ΚΟ αλληλόμορφο της geminin, δεν προέκυψαν ομόζυγοι μύες για το ΔGEM ΚO αλληλόμορφο (-/-), τόσο μεταγεννητικά όσο και in utero. Η μειωμένη αντιπροσώπευση των ΔGEM+/- μυών σε συνδυασμό με την αύξηση των Thy1-/B220- κυττάρων σε σπλήνα και λεμφαδένες ενήλικων μυών, η σημαντική αύξηση των Thy1+ και ειδικότερα των CD8+ Τ κυττάρων, καθώς επίσης και η αισθητή μείωση των CD4+ Τ κυττάρων του σπλήνα σε ζώα ηλικίας 5 μηνών, προτείνει ένα είδος απλοανεπάρκειας των ετερόζυγων για Geminin μυών. Σε παραπλήσια αποτελέσματα οδηγηθήκαμε και μετά από την ανάλυση των GT KO για το γονίδιο της Geminin (GT) μυών με τη μεθοδολογία της παγίδευσης γονιδίων. Τα ετερόζυγα GT ζώα διασταυρώθηκαν με ετερόζυγα ζώα για το πλήρες ΚΟ του BRG1 (BRG) και με ετερόζυγα ζώα που υπερεκφράζουν μια επικρατούσα κατασταλτική μορφή του BAF57 (BAFΔΝ, BAF), προκειμένου να διαπιστωθεί εάν υπάρχει γενετική αλληλεπίδραση μεταξύ της Geminin και των μελών του συμπλέγματος αναδιοργάνωσης της δομής της χρωματίνης SWI/SNF, BRG1 και BAF57 που έχει δειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο κατά την ανάπτυξη και διαφοροποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος. Ιστοειδικά, χρησιμοποιώντας την floxedΤΚneo σειρά μυών σε συνδυασμό με την CD2-Cre, που επιτρέπει την εξάλειψη του γονιδίου από το στάδιο των DN κυττάρων του θύμου και μετά, είδαμε ότι η ανάπτυξη του θύμου δεν φαίνεται να επηρεάζεται κατά την απουσία της Geminin, ενώ αντίθετα ο ολικός αριθμός των σπληνοκυττάρων μειώνεται στα FlTKneo/KO;CD2 σε σχέση με τα WT. Μιτωγονική διέγερση με ConA εναιωρήματος σπληνοκυττάρων από FlTKneo/KO;CD2 και WT ζώα, έδειξε ότι τα FlTKneo/KO;CD2 Τ λεμφοκύτταρα αδυνατούν να διαιρεθούν. Τέλος, έγινε προσπάθεια για ιστοειδική υπερέκφραση στο ανοσοποιητικό σύστημα της ανθρώπινης Geminin συντηγμένης με τη πράσινη φθορίζουσα χρωστική (GFP). Το συγκεκριμένο σύστημα επιτρέπει την υψηλή έκφραση του διαγονιδίου κυρίως στα Τ κύτταρα. Ενώ προέκυψαν ιδρυτές για όλες τις πιο πάνω σειρές τόσο με χαμηλή όσο και με υψηλή ενσωμάτωση του διαγονιδίου, η έκφραση της GFP δεν κατέστη δυνατόν να ανιχνευθεί με FACS. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν ότι η Geminin είναι ιδιαίτερα σημαντική κατά τα αρχικά στάδια ανάπτυξης του εμβρύου μυός, ενώ ιστοειδικά στο ανοσοποιητικό σύστημα η πλήρης εξάλειψή της δεν έχει καμία επίπτωση στην ανάπτυξη του θύμου αδένα, ενώ αντίθετα στη σπλήνα εμφανίζονται μειωμένοι οι πληθυσμοί των ώριμων CD4 και CD8 Τ λεμφοκυττάρων. Τέλος, φαίνεται να συνεργάζεται με το σύμπλεγμα αναδιοργάνωσης της δομής της χρωματίνης SWI/SNF στη ρύθμιση των CD4 κυττάρων του θύμου αδένα και των CD8 του σπλήνα. / Immune system development initiates from a multipotent hematopoietic stem cell that consecutively generates intermediate progenitors that concomitantly lose their self-renewal ability and finally generate the fully differentiated cells of the myeloid and lymphoid lineage. The whole procedure is based on the fine tuning of the processes of both self-renewal and differentiation, and requires the expression of diverse genes that are implicated in the processes of cell cycle regulation, transcriptional regulation, and are constituents of chromatin remodeling complexes that operate during differentiation. Geminin has been proposed to control a cell’s decision to proliferate or differentiate. It interacts with transcription factors, with chromatin remodeling complexes, regulating neurospecific gene transcription. At the same time, Geminin acts as a cell cycle inhibitor through direct binding to the DNA licensing factor CDT1. Our goal was to investigate Geminin’s in vivo role in differentiation and cell cycle regulation in the immune system. In this thesis, using Cre-loxP system, we generated conditional knockout mice for Geminin’s gene, flanking exons 3 and 4 with loxP sites. Gene targeting and the insertion of the three loxP sites was performed in pc3 mouse embryonic stem cells, using a suitable knockout plasmid vector, which bared the TKneo cassette selection marker. Upon injection of the homologously recombined pc3 clones into blastocysts, the generation of chimeric mice that expressed Cre recombinase in their germ line, and their subsequent cross to wild type mice, we were able to generate heterozygote mice for the flanked by loxP sites allele of Geminin that also bared TKneo selection marker (“floxed-TKneo” allele), the flanked by loxP sites allele of Geminin that was deprived of the TKneo selection marker (the floxed allele) and the complete knockout allele of Geminin (ΔGEM KO (null) allele) that was deprived of exons 3 and 4. From ΔGEM+/- intercrosses we didn’t recover any homozygote knockout mice, both postnatally and in utero. The reduced number of the ΔGEM+/- obtained, in combination with the dramatic increase of Thy1-B220- cells from spleen and lymph nodes from ΔGEM+/- adult mice, the significant increase in Thy1+ and CD8+ from lymph nodes and the discernible decrease of spleenic CD4 T cells in ΔGEM+/- aged 5 months suggest that ΔGEM+/- mice are haploinsufficient. Similar results were obtained from the analysis of the GT knockout that we generated, using a gene trap mutagenesis approach. GT heterozygote mice were crossed with heterozygote mice for BRG1 Knockout (BRG mice) and with heterozygote mice that overexpressed a dominant negative form of BAF57 (BAFΔN, BAF mice), so as to investigate whether there is a genetic interaction between Geminin and the two members of the SWI/SNF chromatin remodeling complex that have significant roles during development and differentiation of the immune system. Upon conditional inactivation of Geminin’s gene in the immune system, using floxedTKneo and CD2-Cre mouse lines, that allowed the deletion of the gene from the DN stage and on, we were surprised to see that in the Geminin conditional knockout mice, thymic development was largely unaffected. On the contrary, spleenic cellularity from Geminin conditional knockout mice was fairly reduced, when compared to WT control littermates. Mitogenic stimulation with ConA of spleenic whole cell extract from Geminin conditional KO (FlTKneo/KO;CD2) and WT mice demonstrated that the mutant T cells were unable to divide. Finally, we tried to overexpress human Geminin tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) specifically in the immune system. This particular system would ensure high expression of the transgene mainly in T cells. We obtained founders for all of the cloned constructs, both with low and high copy transgene integration, but we were unable to detect GFP expression by FACS analysis. Our results show that Geminin has a pivotal role during early mouse embryonic development, whereas tissue specific inactivation in the immune system leaves thymic development largely unaffected, whereas mature CD4 and CD8 T cells in the spleen are drastically reduced. Finally, Geminin seems to operate with SWI.SNF complex for the regulation of thymic CD4 and spleenic CD8.

Abstract In mice, gene targeting has become a useful tool for resolving the functions of proteins and for creating new animal models. Cre/loxP technology has been used broadly for generation of genetically modified mice. The Cre recombinase recognizes a specific DNA sequence, called loxP, and removes any DNA fragment between two loxP-sites. The activity of the Cre recombinase can be controlled spatially and temporally with cell- or tissue-specific promoters and synthetic inducing agents, such as tamoxifen or tetracycline. In this thesis, we employed tamoxifen-induced Cre recombination in vitro. Cre-ERTM mice were crossed to ROSA26LacZ reporters and Cre-recombination induced by 4OH-TM was monitored by LacZ staining. 0.5 μM 4OH-TM treatment was competent for tamoxifen-induced Cre-mediated activation of LacZ both in kidney cultures and in experimentally induced kidney mesenchymes. Wnt4 is a secreted signaling molecule, which is necessary for the development of several organs including kidney, ovary, adrenal gland, mammary and pituitary glands. Wnt4 is crucial for kidney development and conventional Wnt4-/- mice die soon after birth, likely due to renal failure. In this thesis, two different Wnt4 alleles, Wnt4EGFPCre and floxed Wnt4, were generated and analyzed to learn more about the Wnt4 functions and to apply these mouse lines to renal functional genomics. In the Wnt4EGFPCre, the EGFPCre fusion cDNA was targeted into exon I of the Wnt4 locus. EGFP-derived fluorescence was observed in the pretubular aggregates from E12.5 embryonic kidney onwards. Further characterization by crossing with the floxed ROSA26LacZ and yellow fluorescent protein (YFP) reporter lines demonstrated that in addition to the kidney, reporter expression was observed in the gonad, spinal cord, lung and the adrenal gland. The expression pattern of the Cre activity recapitulates well the known pattern of the Wnt4 gene. Time-lapse analysis in organ culture settings showed that the Wnt4 expressing cells contributed to the nephrons, some cells near the stalk of the developing ureter, as well as a number of positive supposed medullary stromal cells. In the conditional Wnt4 knock-out, loxP sites were placed to flank exons 3 to 5. The Wnt4 gene was specifically inactivated with CAGCre and Wnt4EGFPCre lines. In both of these crosses deletion of Wnt4 gene function led to impaired kidney development. In conclusion, we identified the culture conditions that can be used for the tamoxifen-induced conditional mutagenesis in tissue cultures. In addition, the created Wnt4 mouse lines serve as new useful tools for addressing the roles of Wnt4 function in diverse tissues and in different stages of development. / Tiivistelmä Hiirillä geenikohdennuksesta on muodostunut hyödyllinen väline proteiinien tehtävien selvittämisessä ja uusien eläinmallien luomisessa. Cre/loxP -tekniikkaa on käytetty laajasti muuntogeenisten hiirien tuottamisessa. Cre-rekombinaasi tunnistaa spesifisen DNA-jakson, niin kutsutun loxP:n, ja poistaa kaikki DNA-jaksot kahden loxP-sekvenssin väliltä. Cre-rekombinaasin aktiivisuutta voidaan säädellä paikallisesti ja ajallisesti solu- tai kudosspesifisillä promoottoreilla ja synteettisillä indusoivilla kemikaaleilla, kuten tamoksifeenillä tai tetrasykliinillä. Tässä väitöskirjassa hyödynsimme tamoksifeenin aiheuttamaa Cre-rekombinaatiota in vitro -kudosviljelmissä. Cre-ERTM-hiirilinja risteytettiin ROSA26LacZ-reportterilinjan kanssa, ja 4-hydroksitamoksifeenin indusoima Cre-rekombinaasin aktiivisuutta monitoroitiin LacZ–värjäyksellä. 0.5 µM:n 4OH-TM konsentraatiolla LacZ-reportterigeeni saatiin aktivoitua tehokkaasti Cre-rekombinaasin avulla sekä munuaisviljelmissä että munuaismesenkyymiviljelmissä. Wnt4 on erittyvä signalointimolekyyli, jolla on keskeinen rooli useiden elinten, kuten munuaisen, munasarjan, lisämunuaisen, rintarauhasen ja aivolisäkkeen kehittymisessä. Wnt4-geenillä on ratkaisevan tärkeä rooli munuaisen kehityksessä, ja poistogeeninen Wnt4-/-hiiri kuolee pian syntymän jälkeen, todennäköisesti munuaisen vajaatoimintaan. Tässä väitöskirjatyössä tuotettiin kaksi eri Wnt4 alleelia, Wnt4EGFPCre ja konditionaalinen Wnt4. Nämä hiirilinjat analysoitiin, jotta saisimme lisää tietoa Wnt4-geenin toiminnasta ja pystyisimme soveltamaan kyseisiä hiirikantoja munuaisten toiminnan selvittämisessä. Wnt4EGFPCre-alleelissa EGFPCre-fuusio -cDNA kohdennettiin osaksi endogeenisen Wnt4-geenin ykköseksonia. Vihreän fluoresoivan proteiinin (EGFP) aktiivisuus havaittiin varhaisen munuaisen kehityksen aikana. Wnt4EGFPCre-alleelin lisäkarakterisointi reportterilinjoilla (Rosa26LacZ ja Rosa26YFP) osoitti, että Wnt4-geenin ilmentyminen havaittiin munuaisen lisäksi sukurauhasissa, selkäytimessä, keuhkoissa sekä lisämunuaisessa. Wnt4EGFPCre-alleeli ilmentyi niissä kudoksissa, joissa endogeenisen Wnt4-geenin tiedetään olevan aktiivinen. Time-lapse -analyysin avulla osoitettiin, että Wnt4-geeniä ilmentävät solut muodostavat tiettyjä rakenteita munuaisen kehityksen aikana. Wnt4-geeni ilmentyi nefroneissa, kehittyvän virtsajohtimen soluissa sekä useissa medullaarisissa stroomasoluissa. Konditionaalisessa (ehdollisessa) Wnt4 knock-out-hiirilinjassa loxP-sekvenssit sijoitettiin eksonien kolme sekä viisi ympärille. Wnt4-geenin toiminta inaktivoitiin CAGCre- ja Wnt4EGFPCre-hiirilinjojen avulla. Näissä molemmissa tapauksissa Wnt4-geenin toiminnan poistaminen johti munuaisen kehityshäiriöön. Yhteenvetona voimme todeta, että olemme tunnistaneet ne kasvatusolosuhteet, joita voidaan hyödyntää, kun halutaan aktivoida reportterigeenejä tai kehityksen kannalta tärkeitä geenejä tamoksifeenin aiheuttamaa Cre/loxP -rekombinaatiota hyväksikäyttäen kudosviljelmissä. Samoja olosuhteita ja menetelmää käyttäen voidaan myös poistaa jonkun kehityksen kannalta tärkeän geenin toiminta ja tutkia sitä kudosviljelmässä. Tuotetut Wnt4-hiirikannat ovat lisäksi uusia hyödyllisiä työkaluja, kun halutaan tutkia Wnt4-geenin toimintaa erilaisissa kudoksissa ja eri kehitysvaiheiden aikana.

No description available.

Les astrocytes sont des cellules gliales présentes dans le système nerveux central, qui exercent de nombreuses fonctions physiologiques essentielles et sont impliquées dans la réponse aux lésions et dans plusieurs pathologies du cerveau. Les astrocytes sont générés par les cellules de la glie radiale, les précurseurs communs de la plupart des cellules neuronales et gliales du cerveau, après le début de la production des neurones. Le passage de la neurogenèse à la gliogenèse est le résultat de mécanismes moléculaires complexes induits par des signaux intrinsèques et extrinsèques responsables du changement de propriété des précurseurs et de leur spécification. Le gène Pax6 code pour un facteur de transcription hautement conservé, impliqué dans plusieurs aspects du développement du système nerveux central, tels que la régionalisation et la neurogenèse. Il est exprimé à partir des stades les plus précoces dans les cellules neuroépithéliales (les cellules souches neurales) et dans la glie radiale, dérivant de la différenciation de ces cellules. L’objectif de cette étude est d’analyser le rôle de Pax6 dans la différenciation et dans le développement des astrocytes. À travers l’utilisation d’un modèle murin mutant nul pour Pax6, nous avons obtenu des résultats suggérant que la suppression de ce gène cause l'augmentation de la prolifération et de la capacité d'auto-renouvellement des cellules souches neurales embryonnaires. In vitro, les cellules mutantes prolifèrent de façon aberrante et sous-expriment les gènes p57Kip2, p16Ink4a, p19Arf et p21Cip1, qui inhibent la progression du le cycle cellulaire. De plus, Pax6 promeut la différenciation astrocytaire des cellules souches neurales embryonnaires et est requis pour la différenciation des astrocytes dans la moëlle épinière. Les mutants nuls pour Pax6 meurent après la naissance à cause de graves défauts développementaux dus aux fonctions essentielles de ce gène dans le développement embryonnaire de plusieurs organes. En utilisant un modèle murin conditionnel basé sur le système CRE/ loxP (hGFAP-CRE/ Pax6flox/flox) qui présente l’inactivation de Pax6 dans les cellules de la glie radiale, viable après la naissance, nous avons montré que Pax6 est impliqué dans la maturation et dans le développement post-natal des astrocytes. Le cortex cérébral des souris mutantes conditionnelles ne présente pas d’astrocytes matures à l’âge de 16 jours et une très faible quantité d’astrocytes immatures à l’âge de trois mois, suggérant que Pax6 promeut la différenciation et la maturation des astrocytes. De plus, Pax6 semble jouer un rôle même dans le processus de différenciation et de maturation de cellules gliales rétiniennes. L’étude des gènes et des mécanismes moléculaires impliqués dans la génération des astrocytes est crucial pour mieux comprendre le rôle physiologique et les altérations pathologiques des ces cellules. / Astrocytes, a subtype of glial cells present in the central nervous system, have multiple physiological functions and are involved in the response to lesions and in several brain pathologies. Astrocytes are generated by radial glia cells, the common precursors of most neural and glial cells of the brain, after the beginning of neurons production. The transition from neurogenesis to gliogenesis is the result of complex molecular mechanisms induced by both intrinsic and extrinsic signals responsible for the change of precursors properties and commitment. The Pax6 gene encodes a highly conserved transcription factor, involved in several aspects of central nervous system development, such as regionalization and neurogenesis. It is expressed from the earliest stages in the neuroepithelial cells (neural stem cells) and in their more differentiated radial glia progeny. The aim of this study was to analyze the role of Pax6 in the differentiation and development of astrocytes. By using a Pax6 null mutant mouse, we obtained results suggesting that the suppression of this gene increases the proliferation and the self-renewal ability of embryonic neural stem cells. In vitro mutant cells overproliferate and overexpress p57Kip2, p16Ink4a, p19Arf et p21Cip1 genes, which inhibit the cell cycle progression. Moreover Pax6 promotes astrocytic differentiation of embryonic neural stem cells and is required for astrocyte differentiation in spinal cord. Pax6 null mutants die after birth because of severe developmental defects, due to the essential functions of this gene in embryonic development of several organs. Using a conditional mutant mouse of Pax6 in radial glia (hGFAP-CRE/ Pax6flox/flox, based on site-specific Cre/loxP-mediated gene excision), which is viable after birth, we obtained evidences showing that Pax6 is involved in astrocyte maturation and postnatal development. The cerebral cortex of sixteen-day-old conditional mutant mice doesn’t present mature astrocytes, and the three-month-old mice cortex presents only few immature astrocytes, suggesting that Pax6 promotes astrocyte differentiation and maturation. Moreover Pax6 seems to play a role also in the maturation and differentiation of retinal glial cells. The identification of genes and molecular pathways involved in the generation of astrocytes is crucial to better understand the physiological function and pathological alterations of these cells.