Class of 2012 Abstract / OBJECTIVES: Therapeutic response to chemotherapeutic agents in vitro can be studied using immortalized lymphoblastoid cell lines (LCLs). While LCLs provide a valuable model to study heritable factors and anticancer drug reponse in large populations, the results may be confounded by properties inherent to the model. This study is used to explore possible confounders in Choy et al.’s publicially available dataset (Accession#: GSE11582). METHODS: This study utilized Affymetrics U133A array gene expression and phenotypic data for 162 unrelated LCLs. SPSS was used for two-tailed bivariate Pearson correlation analysis comparing relative 6-mercaptopurine (6-MP), 5-fluorouracil (5-FU), and methotrexate sensitivities, growth rate and ATP levels. GeneSpring was used to compare the top and bottom quartiles of relative ATP levels using the unpaired T-test with a significance threshold of 0.001 and Benjamin-Hochberg FDR (n=82). RESULTS: It was found that relative sensitivities of 5-FU and 6-MP are significantly correlated (r2= 0.627, p<0.0001). Furthermore, it was determined that 5-FU sensitivity and growth rate and ATP levels are also correlated; however, no significant correlation was found between growth rate and ATP levles (r2=0.127, p=0.107). Relative ATP level was found to be a more significant determinant of 5-FU sensitivity than growth rate. GeneSpring analysis showed that 1500 genes are differentially regulated based on ATP levels. The gene ontology related to nucleic acid metabolism was overrepresented (p=1.425E-15). CONCLUSIONS: The results above suggest that growth rate and, to a greater extent, baseline ATP levels influence genetic expression of LCLs and may confound in vitro studies of antineoplastic agents.

Human clinical genome-wide association studies (GWAS) have helped identify disease trait and pharmacogenomic loci without the need for biological under- standing. Molecular GWAS - associating genetic variation with traits such as gene expression - have been slow to fill the mechanistic gaps. While tissue specificity, lack of DNA resolution, and the need for better data integration are no dou bt important bottlenecks in molecular GWAS, there is also a very poor general understanding of which molecular phenotypes are important and how best to model them. Added to this is the clear need for a greater understanding of the strengths and weaknesses facing in vitro (and ex vivo) models as hypoth- esis generating and GWAS validation tools. The studies in this work focus on RNA expression in a popular human model: lymphoblastoid cell lines (LCLs). Chapters 2 and 3 examine microRNA (miRNA) and messenger RNA (mRNA) expression in a total of 300 genotyped human LCLs. The expression of only one miRNA could be associated with a nearby genetic variant. This result was observed in both the African and European samples studied, in a separate val- idation data set, and was technically validated with quantitative PCR. While limited genotype resolution and small sample sizes are likely to be important contributors to this low hit rate, the results strongly suggest experimental con- founders. Highly expressed miRNAs reflected the transformed nature of the cells, highly correlated miRNAs enriched for EBV and malaria associated tar- get mRNA genes, and several miRNAs that were differentially expressed be- tween the European and African samples suggested differential EBV transfer- mation. Chapter 4 presents a study on single cells from some of the same samples, to test the hypothesis that the lack of tissue spatial resolution is an important limiting factor in human genetic epidemiology. Experimental con- founders were also considered: sample growth was found to associate with the expression of several genes. Cell-to-cell gene correlations and distributions made it possible to propose how genes change their expression, functionally differ from each other, and are able to alter their behaviours without altered whole-tissue expression. The results suggest which type of genes are more likely to be susceptible to genetic effects, and propose promoter behaviours altered by genetic variants located near to 13 genes. From these whole-tissue and single cell results the broad conclusion is that, while LCLs are likely to be inappropriate for the study of miRNA genetics, their functional genomics at higher spatial resolution shows promise as a more mechanistic approach for the study of germline genetics.

Epstein-Barr Virus (EBV), a ubiquitous herpesvirus that infects over 95&percnt; of the adult human population, has been implicated in the aetiology of a range of autoimmune diseases and tumours. In some of these disorders such as post-transplant B-cell lymphomas, EBV acts as a direct causal factor, in others, like Hodgkin's disease and nasopharyngeal carcinoma, it is an important co-factor. Additionally, EBV infection has been linked to several other diseases, most notably Multiple Sclerosis through positive correlation with the occurrence of Infectious Mononucleosis – a benign lymphoproliferative disease caused by primary EBV infection. The key feature of most EBV-disease associations is the ability of the virus to infect and transform human B- T- NK- and epithelial cells using a set of transcripts and proteins, some of which act as oncogenes. While it is evident that EBV viral load and gene expression may be correlated with the course of disease or even directly contributing to its pathology, the genetic determinants of EBV uptake, expression and its proliferative capacity remain unresolved. This project aimed to investigate the genetic determinants of EBV copy number and EBV latency gene expression for human B-cells immortalised by EBV in vitro and transformed into permanently growing lymphoblastoid cell lines (LCLs), as a model for early-stage EBV infection in naïve B-cells. LCL samples studied have been sourced from several different populations, the HapMap Project, the 1000 Genomes Project as well as British MRC-A family cohort. Methods used encompass quantification of viral expression and copy number using TaqMan and SybrGreen PCR techniques, followed by statistical association tests conducted using Plink, Merlin and MatrixEQTL. EBV QTLs identified by the assays were next subjected to a meta-analysis in GWAMA. Two most significant eQTLs were also selected for a replication experiment in an independent panel of newly generated LCLs and validated in peripheral blood B-cells sourced from the same donors. Multiple significant and suggestive expression and copy number QTLs were identified. However, most of these associations have not been replicated in more than a single cohort. The relatively small sample size of most cohorts tested as well as population structure posed a limitation. Some findings merit attention, particularly the presence of statistically significant viral eQTLs within or close to CSMD1 locus in two different cohorts, and finding of a significant EBV eQTL in a SNP associated with type 1 diabetes risk and located close to IL2RA, an immune-response gene harbouring multiple autoimmune disease risk loci. Suggestive associations were also identified in the 1000 Genomes Project samples by the copy number assay which resulted in the most robust test conducted. These encompassed an association to the PRDM9 locus as well as to a gene involved in TGF-&beta; secretion. This is particularly interesting since TGF-&beta; signal promotes lytic replication in EBV-infected B-cells and a consistent significant correlation between EBV lytic expression and increased viral copy number has been identified. In conclusion, although no significant association has been consistently replicated, the project provided several suggestive EBV QTL candidates with plausible biological links to EBV infection and replication, which could be studied further in independent experiments.

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Neben chemotherapeutischen und chirurgischen Maßnahmen ist die Bestrahlung integraler Bestandteil multimodaler Therapiekonzepte bei malignen Tumorerkrankungen. In diesem Zusammenhang spielt der Einblick in physiologische und pathophysiologische Abläufe in menschlichen Zellen und auf molekularer Ebene  eine zunehmende Rolle. Auf diese Weise werden komplexe Stoffwechselwege mit ihren unterschiedlichen Funktionen und ihren aus einzelnen Proteinen bestehenden Komponenten immer besser verstanden. Allerdings entstehen durch die Kenntnis dieser Stoffwechselwege neue Fragen, die Gegenstand medizinischer Forschung sind.  Der TGFβ-Signalweg ist ein wesentlicher intrazellulärer Signalweg, der neben zahlreichen anderen Funktionen einen Einfluss auf die Entstehung bestimmter Tumorerkrankungen hat. Eine Vielzahl an Einzelnukleotid-Polymorphismen (single nucleotide polymorphisms, SNP) ist bekannt sowie die Erkenntnis darüber, dass die Anwesenheit von verschiedenen Varianten eines SNP einen Einfluss auf die Zellvitalität hat je nach Behandlungsbedingung. Ziel dieser Arbeit war es den Einfluss von Keimbahn-Polymorphismen in Genen des TGFβ-Signalwegs und der DNA-Reparatur auf die Strahlenempfindlichkeit lymphoblastoider Zellen zu untersuchen. Hierzu wurden 54 käuflich erworbene lymphoblastoide Zellen angezüchtet. Jede dieser Zelllinien wurde sechs parallelen Behandlungsbedingungen unterworfen. Neben der unbehandelten Kontrolle und einer mit anti-TGFβ behandelten Kontrolle wurden Zellen einer alleinigen Bestrahlung mit 3 Gy ausgesetzt. Darüber hinaus wurden Zellen 16 Stunden vor der Bestrahlung mit TGFβ1 oder anti-TGFβ vorinkubiert oder unmittelbar nach der Bestrahlung mit TGFβ1 behandelt.  Nach Ablauf einer 24-stündigen Inkubationszeit erfolgte die Zellvitalitätsmessung mittels FACS (fluorescence activated cell sorting)–Analyse. Die Ergebnisse wurden mit Daten von insgesamt 1656 polymorphen Positionen (aus HapMap Datenbank) aus 21 Kandidatengenen korreliert. Auf diese Weise sollte der Einfluss dieser Polymorphismen auf die Zellvitalität ermittelt werden. Sowohl bei SMAD3 als auch bei SMAD7 fanden sich jeweils 2 SNP, die ein perfektes bzw hohes Kopplungsungleichgewicht (linkage disequilibrium) aufwiesen. Insgesamt waren zwölf Polymorphismen aus acht Genen (TGFBR1, SMAD2, SMAD3, SMAD7, BRCA2, MSH2, MSH6 und XRCC1) mit signifikanten Veränderungen der Zellvitalität assoziiert. Das Variantenallel scheint bis auf wenige Ausnahmen einen zytoprotektiven Effekt zu haben. Ausnahmen sind 3 SNP der Gene BRCA2, SMAD3 und SMAD 7, bei denen der Wildtyp mit höherer Zellvitalität einhergeht. Bei alleiniger Bestrahlung wirkten sich SNP aus SMAD3, SMAD7, MSH2 und MSH6 modulierend auf die Zytotoxizität aus, wenn auch statistisch nicht signifikant. Interessanterweise zeigten sich bei Betrachtung der Auswirkung einer Stimulation mit TGFβ1 vor und nach Bestrahlung mit 3 Gy dieselben SNP als statistisch signifikante Modellprädiktoren wie auch bei alleiniger Bestrahlung mit Ausnahme eines SNP aus SMAD3.  Bei Vorinkubation mit TGFβ1 wirkte sich die MSH2-Variante stärker aus. Hier entstand beim Wildtyp ein zusätzlich zytotoxischer Einfluss im Vergleich zur Stimulation nach Bestrahlung. Bei Inhibition durch anti-TGFβ vor der Bestrahlung zeigte noch ein SNP aus MSH6 und ein SNP aus SMAD7 einen zytoprotektiven Effekt.  Einige Ergebnisse dieser Arbeit könnten, sofern sie im Verlauf durch nachfolgende Studien bestätigt bzw. erweitert werden helfen Therapiekonzepte maligner Tumoren zu optimieren und eine individuelle Radiotherapie zu ermöglichen.

Das Nijmegen-Breakage-Syndrom (NBS) ist ein autosomal-rezessiv vererbtes Chromosomenbruchsyndrom, dem in > 90% der Patienten eine 5bp-Deletion im Nbs1-Gen zugrundeliegt. Klinisches Hauptmerkmal ist ein stark erhöhtes Krebsrisiko, insbesondere für B-Zell-Lymphome. Bereits bekannt ist die Funktion des entsprechenden Genprodukts, Nibrin, bei den für die Krebsprävention wichtigen Mechanismen der DNA-Reparatur und der Zellzykluskontrolle. Daneben spielt die Apoptose eine essentielle Rolle bei der Krebsentstehung. Zu untersuchen ob Nibrin auch hier Funktionen übernimmt war Gegenstand dieser Arbeit. Eine Störung der Apoptose könnte dabei mitverantwortlich für das hohe Krebsrisiko der NBS-Patienten sein. Kern der Arbeit war die Untersuchung von NBS-B-Lymphozyten hinsichtlich ihrer Fähigkeit, nach einer DNA-Schädigung die Apoptose zu induzieren. Hierzu wurde in den entsprechenden Zellen mittels Bleomycin der Apoptoseprozess ausgelöst und die prozentualen Apoptoseraten durchflusszytometrisch bestimmt. Die Mehrheit der NBS-Zelllinien zeigte eine Störung in der Apoptoseinduktion im Sinne signifikant verminderter Apoptoseraten. Dies weist auf eine Funktion des Nibrins bei der Induktion der Apoptose hin. Andere NBS-Zelllinien zeigten normale Apoptoseindices. Dies könnte auf dem individuellen genetischen Hintergrund der Zellen beruhen, der auch für die erhebliche klinische Variabilität des Krankheitsbildes verantwortlich ist. Eine Korrelation der Apoptoseraten mit der Krebsinzidenz zeigte, dass alle Patienten mit reduzierten Apoptoseraten bereits Lymphome entwickelt hatten, während Patienten mit normalen Apoptoseindices bisher keine Lymphome aufwiesen. Möglicherweise gibt es also generell zwei Gruppen von NBS-Patienten - Patienten mit höherem und mit niedrigerem Entartungsrisiko, wobei eine verminderte Apoptoseinduktion als Risikofaktor für Krebs angesehen werden könnte. / The human genetic disorder, Nijmegen-Breakage-Syndrome (NBS), is characterised by an in increased risk for cancer, particularly B-cell-lymphoma. The Nbs1-gene codes for a protein, Nibrin, involved in the processing/repair of DNA double strand breaks and in cell cycle checkpoints - mechanisms relevant for cancer-prevention. As a third mechanism, apoptosis is important in preventing cancer. To evaluate whether Nibrin plays a role in this process was the aim of this study. Failure of apoptosis-induction could be another factor responsible for the high cancer risk in NBS. For this purpose we examined a set of NBS-B-cell-lines for their capacitiy to enter into apoptosis after a DNA-damaging treatment with Bleomycin. The majority of NBS-cell-lines showed a deficiency in apoptosis-induction. This may indicate a function of Nibrin in mechanisms of apoptosis-regulation. Some NBS-cell-lines showed a proficient apoptotic response, though. The reason may be found in the variable genetic background of the cell lines, also responsible for the high clinical variability of the disease. Correlation of apoptosis rates with cancer incidence showed that all patients deficient in apoptosis had already developed B-cell-lymphoma, whereas patients with normal rates had not developed lymphoma so far. Possibly there are two groups of NBS-patients- patients with higher and with lower risk of malignancy, with reduced apoptotic rates being a risk-factor for the development of cancer in NBS.

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Les thiopurines sont des médicaments cytotoxiques et immunosuppresseurs largement prescrits, notamment dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). Ils représentent l’un des meilleurs exemples d’application clinique de la pharmacogénétique avec le dépistage du déficit en thiopurine S-méthyltransférase (TPMT), enzyme clé du métabolisme des thiopurines. La variabilité interindividuelle de la réponse à ces médicaments rend nécessaire leur optimisation thérapeutique. Ce travail de thèse a d’une part, analysé les relations entre activité TPMT et concentrations des métabolites thiopuriniques, et d’autre part, recherché des facteurs associés à la résistance aux thiopurines. A l’aide d’une base de données pharmacogénétiques hospitalière et d’une étude « PheWAS » à partir d’un entrepôt de données cliniques, nous avons analysé la distribution et la corrélation génotype-phénotype pour la TPMT, en lien avec les concentrations des métabolites thiopuriniques. Nous avons observé qu’une activité TPMT très élevée (phénotype « ultra-rapide ») était associée à des paramètres clinico-biologiques reflétant une maladie évolutive et un traitement inefficace dans les MICI. De plus, une étude clinique rétrospective dans les MICI pédiatriques a permis d’identifier des facteurs associés à la lymphopénie observée sous thiopurines. Enfin, à partir d’un modèle in vitro fondé sur des lignées cellulaires lymphoblastoïdes (LCL) sélectionnées, nous avons établi une signature transcriptomique, incluant 32 gènes, prédictive de la résistance aux thiopurines. Une analyse fonctionnelle bioinformatique a abouti à l’identification de voies métaboliques liées à la protéine p53 et au cycle cellulaire, ainsi que des mécanismes moléculaires associés à la résistance aux thiopurines. En conclusion, ce travail de thèse, qui a exploré la variabilité de réponse aux thiopurines et tout particulièrement la résistance à ces médicaments, propose des hypothèses pour l’individualisation et l’optimisation thérapeutique des thiopurines. / Thiopurines are cytotoxic and immunosuppressive drugs widely prescribed, mainly in inflammatory bowel disease (IBD). They constitute one of the best success story of pharmacogenetic implementation into clinical practice based on the screening of thiopurine S-methyltransferase (TPMT) deficiency, a key enzyme in thiopurine metabolism. Optimization of thiopurine response is challenging because of its large interindividual variability such as inefficacy and toxicities. This thesis has explored, on one hand, the relationships between TPMT activity and metabolite concentrations, and on the other hand, factors associated with thiopurine inefficacy. Using a primary care pharmacogenetic database, we first analyzed TPMT distribution and genotype-phenotype correlation, in relation with thiopurine metabolites in a large population. Using a PheWAS study based on a clinical data warehouse we then reported that a very high TPMT activity (“ultra-rapid” phenotype) was associated with parameters of active IBD and poor response to thiopurines. Furthermore, a retrospective study in pediatric IBD identified factors predicting the occurrence of lymphopenia during thiopurine therapy. Finally, using a lymphoblastoid cell line (LCL) in vitro model, we established a transcriptomic signature, including 32 genes predicting thiopurine cellular resistance. A bioinformatic functional analysis identified metabolic pathways in relation with p53 and cell cycle, as well as molecular mechanisms associated with thiopurine resistance. To conclude, this research work, focusing on the variability of thiopurine response and mainly therapeutic resistance, provides new hypotheses to individualize and optimize therapeutic response to thiopurines.

Le système de différenciation entre le « soi » et le « non-soi » des vertébrés permet la détection et le rejet de pathogènes et de cellules allogéniques. Il requiert la surveillance de petits peptides présentés à la surface cellulaire par les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH I). Les molécules du CMH I sont des hétérodimères composés par une chaîne lourde encodée par des gènes du CMH et une chaîne légère encodée par le gène β2-microglobuline. L’ensemble des peptides est appelé l’immunopeptidome du CMH I. Nous avons utilisé des approches en biologie de systèmes pour définir la composition et l’origine cellulaire de l’immunopeptidome du CMH I présenté par des cellules B lymphoblastoïdes dérivés de deux pairs de fratries avec un CMH I identique. Nous avons découvert que l’immunopeptidome du CMH I est spécifique à l’individu et au type cellulaire, qu’il dérive préférentiellement de transcrits abondants, est enrichi en transcrits possédant d’éléments de reconnaissance par les petits ARNs, mais qu’il ne montre aucun biais ni vers les régions génétiques invariables ni vers les régions polymorphiques. Nous avons également développé une nouvelle méthode qui combine la spectrométrie de masse, le séquençage de nouvelle génération et la bioinformatique pour l’identification à grand échelle de peptides du CMH I, dont ceux résultants de polymorphismes nucléotidiques simples non-synonymes (PNS-ns), appelés antigènes mineurs d’histocompatibilité (AMHs), qui sont les cibles de réponses allo-immunitaires. La comparaison de l’origine génomique de l’immunopeptidome de soeurs avec un CMH I identique a révélé que 0,5% des PNS-ns étaient représentés dans l’immunopeptidome et que 0,3% des peptides du CMH I seraient immunogéniques envers une des deux soeurs. En résumé, nous avons découvert des nouveaux facteurs qui modèlent l’immunopeptidome du CMH I et nous présentons une nouvelle stratégie pour l’indentification de ces peptides, laquelle pourrait accélérer énormément le développement d’immunothérapies ciblant les AMHs. / The self/nonself discrimination system of vertebrates allows detection and rejection of pathogens and allogeneic cells. It requires the surveillance of short peptides presented by major histocompatibility class I (MHC I) molecules on the cell surface. MHC I molecules are heterodimers that consist of a heavy chain produced by MHC genes and a light chain encoded by the β2-microglobulin gene. The peptides presented by MHC I molecules are collectively referred to as the MHC I immunopeptidome. We employed systems biology approaches to define the composition and cellular origin of the self MHC I immunopeptidome presented by B lymphoblastoid cells derived from two pairs of MHC-identical siblings. We found that the MHC I immunopeptidome is subject- and cell-specific, derives preferentially from abundant transcripts, is enriched in transcripts bearing microRNA response elements and shows no bias toward invariant vs. polymorphic genomic sequences. We also developed a novel personalized approach combining mass-spectrometry, next-generation sequencing and bioinformatics for high-throughput identification of MHC I peptides including those caused by nonsynonymous single nucleotide polymorphisms (ns-SNPs), termed minor histocompatibility antigens (MiHAs), which are the targets of allo-immune responses. Comparison of the genomic landscape of the immunopeptidome of MHC-identical siblings revealed that 0.5% of ns-SNPs were represented in the immunopeptidome and that 0.3% of the MHC I-peptide repertoire would be immunogenic for one of the siblings. We discovered new factors that shape the self MHC I immunopeptidome and present a novel strategy for the identification of MHC I-associated peptides that could greatly accelerate the development of MiHA-targeted immunotherapy.