Derzeit ist es gängige Praxis, die Chemotherapie entsprechend der Körperoberfläche des Patienten zu dosieren. Diese Praxis ist jedoch nicht ideal, da es Patienten gibt, die starke Nebenwirkungen haben und andere, die kaum Nebenwirkungen aufweisen. Damit intelligentere Dosierungsschemata entwickelt werden können und prophylaktische Maßnahmen zum Verhindern von Therapienebenwirkungen besser geplant werden können, ist die Kenntnis der Faktoren erforderlich, welche die Nebenwirkungen verursachen. Die hämatologischen Nebenwirkungen der Chemotherapie sind dabei am stärksten ausgeprägt und führen oft zu Dosiserosionen, Zeitverschiebungen zwischen den Chemotherapiezyklen oder sogar zu einem Abbruch der Therapie. Das hat wiederum negative Auswirkungen auf den Therapieerfolg. In dieser Arbeit wurden daher Prognosemodelle für chemotherapieinduzierte hämatologische Nebenwirkungen aufgebaut. Die Daten von 1399 Patienten mit aggressivem Non-Hodgkin-Lymphom und einem breiten Altersspektrum von 18-75 Jahren aus der NHL-B1/B2-Studie (Pfreundschuh et al. 2004a und b) gingen in die Analyse ein. Es wurden für die jüngeren (<= 60 Jahre) und die älteren Patienten (> 60 Jahre) multivariate Proportionale Odds Regressionsmodelle für die drei hämatopoetischen Linien der Leukozytopenie, Thrombozytopenie und Anämie gerechnet und an zwei unabhängigen Datensätzen, auch unter Rituximab-haltigen Chemotherapieschemata, validiert. Die hier entwickelten Modelle konnten ein breites Heterogenitätsspektrum für die hämatologischen Nebenwirkungen erklären. Bemerkenswert ist, dass einige der Faktoren für hämatologische Nebenwirkungen gleichzeitig auch Faktoren des Internationalen Prognostischen Index für das Therapieergebnis sind. Die im ersten Chemotherapiezyklus beobachtete Nebenwirkung war der stärkste prognostische Faktor. Mit einigen der Modelle konnte die kumulative Nebenwirkung über die Chemotherapiezyklen hinweg gezeigt werden. Die Demonstration des Zusammenhangs zwischen den für Leukozytopenie ermittelten Risikogruppen und den klinisch relevanten Größen Infektion, Antibiotikagabe, Hospitalisierungstage und therapieassoziierte Todesfälle ist ein sehr wichtiges Ergebnis der Arbeit. Es wurde eine Internetseite (www.toxcalculator.com) entwickelt, welche den Ärzten die Möglichkeit bietet, die bei dem Patienten vorliegenden Prognosefaktoren einzugeben und dann die Modellvorhersagen für die zu erwartenden hämatologischen Nebenwirkungen zu erhalten. Die Ergebnisse der Arbeit wurden in der hochrangigen Zeitschrift ‚Annals of Oncology‘ publiziert (Ziepert et al. 2008).

Reproduction de : Thèse d'exercice : Médecine : Nancy 1 : 2005. / Titre provenant de l'écran-titre.

Reproduction de : Thèse d'exercice : Médecine : Nancy 1 : 2003. / Thèse : 2003NAN11035. Titre provenant de l'écran-titre.

Die Behandlung von Lymphomen konnten durch zahlreiche Therapieoptimierungsstudien verbessert werden. Für das Erzielen weiterer Fortschritte ergibt sich die Forderung auch zukünftig möglichst viele Patienten in Therapieoptimierungsstudien einzuschließen. Ziel dieser Arbeit war es, einen Überblick über die Praxis des Studieneinschlusses an einem deutschen Studienzentrum zu geben und hieraus ggf. einen Verbesserungsbedarf für bestimmte Lymphomentitäten oder Patientensubgruppen aufzuzeigen. Weiterhin wurde untersucht inwieweit sich die Studienergebnisse im klinischen Alltag wiederspiegeln und reproduzieren lassen. Es wurden anhand der elektronisch hinterlegten Arztbriefe die Inzidenz, die Therapieergebnisse sowie die Häufigkeit des Studieneinschlusses in der Abteilung Hämatologie und Onkologie der Universitätsmedizin Göttingen ermittelt. Desweiteren wurden für das diffus großzellige B-Zell-Lymphom (DLBCL) die Therapieergebnisse mit denen wichtiger klinischer Studien verglichen. Hierzu wurden die Patienten analog der deutschen Studiengruppe Hochmaligne Non-Hodgkin-Lymphome (DSHNHL) in die Gruppen „junge Patienten mit guter Prognose“, „junge Patienten mit schlechter Prognose“, „ältere Patienten“ und „Rezidivpatienten“ eingeteilt. Bezüglich der Studieneinschlussrate zeigt sich ein Defizit für die Patienten, die älter als 60 Jahre sind und die bei den meisten Lymphomentitäten den Großteil der Patienten stellen. In der Erstlinientherapiegruppe der „jungen Patienten mit guter Prognose“ (alters-justierter Internationaler Prognostischer Index (aIPI) <2) zeigen sich die besten Remissionsraten. Die Ergebnisse dieser Gruppe sind mit den Beobachtungen der MabThera-International-Trial-Studie (MInT) vergleichbar. In der Gruppe der „jungen Patienten mit schlechter Prognose“ (aaIPI≥2) zeigen sich schlechtere Therapieergebnisse als bei den „jungen Patienten mit guter Prognose“. Dies bestätigt die prognostische Relevanz der IPI-Risikofaktoren in der Rituximab-Ära. Der Vergleich der Therapieergebnisse mit den Ergebnissen der Mega-CHOEP-Studie fiel hinsichtlich der Overall response-rate (ORR), der progessive disease (PD)-, und der complete remission/complete remission unconfirmed (CR/Cru)-Rate uneinheitlich aus. Lediglich 37,5% der Patienten wurden mit 8 Zyklen R-CHOEP-14 behandelt, das sich in der Mega-CHOEP-Studie als überlegen herausstellte. Die Gruppe der „älteren Patienten“ zeigte eine vergleichbare ORR und PD-Rate zu den Patienten im 6xR-CHOP-14-Arm der RICOVER-60-Studie. Jedoch konnte die dort erreichte hohe CR/Cru-Rate im Göttingern Kollektiv der „älteren Patienten“ nicht beobachtet werden. Für die Gruppe der Rezidivpatienten konnten die Beobachtungen der PARMA-Studie bestätigt werden. Die Zeit, die bis zum Auftreten eines Rezidivs vergeht, erwies sich auch bei den Göttinger Patienten als bedeutender Prognosefaktor. Innerhalb der drei Erstlinientherapiegruppen weisen die Göttinger Studienpatienten jeweils höhere Remissionsraten als die Nichtstudienpatienten auf. Zur weiteren Therapieoptimierung und zum Erreichen besserer Remissionsraten sollte somit auch weiterhin größte Aufmerksamkeit auf das Randomisieren der Patienten, insbesondere der älteren Patienten, in neue klinische Therapieoptimierungsstudien gelegt werden.

Le traitement du lymphome B non hodgkinien (NHL) est généralement basé sur la combinaison d’un anticorps monoclonal anti-CD20, le rituximab, et de la chimiothérapie. Cependant, de nombreux patients deviennent réfractaires au ciblage du récepteur CD20. Dans cette thèse, l’effet d’un nouvel anticorps monoclonal anti-CD37 conjugué au Luthétium-177 (177Lu-lilotomab, Betalutin®) est étudié dans des modèles précliniques de lymphome non hodgkinien et comparé au rituximab radiomarqué au luthétium-177 (177Lu-rituximab). Nous avons développé une approche radiobiologique qui distingue les effets cytotoxiques dus à l’anticorps monoclonal et dus aux rayonnements ionisants dans des lignées cellulaires de lymphome humain. Cette méthode a permis de montrer qu’in vitro, le rituximab et le 177Lu-rituximab étaient plus cytotoxiques que le lilotomab et le 177Lu-lilotomab dans la lignée cellulaire radiorésistante Ramos (modèle du lymphome de Burkitt). Inversement, le 177Lu-lilotomab et le 177Lu-rituximab ont montré la même cytotoxicité dans la lignée cellulaire radiosensible DOHH2 (modèle de lymphome folliculaire transformé). Leur cytotoxicité était plus faible dans la lignée cellulaire Rec-1 (modèle du lymphome du manteau) que dans les cellules DOHH2. Ces résultats ont été confirmés in vivo sur des souris traitées par injection intraveineuse après xénogreffe sous-cutanée de cellules Ramos ou DOHH2. Le 177Lu-lilotomab et le 177Lu-rituximab ont montré la même efficacité thérapeutique chez les souris xénogreffées avec les cellules radiosensibles DOHH2, alors que le lilotomab non radiomarqué était moins efficace que le rituximab. Inversement, chez les souris xénogreffées avec les cellules radiorésistantes Ramos, la plus faible efficacité du 177Lu-lilotomab comparé au 177Lu-rituximab peut seulement être compensée par une augmentation de dose absorbée à la tumeur par le 177Lu-lilotomab. Mécanistiquement, la réponse cellulaire des tumeurs aux radiations dépend de la réponse apoptotique des cellules et de la réduction de l’arrêt en G2/M du cycle cellulaire via les phosphorylations médiées par WEE-1 et MYT-1 de la kinase dépendante des cyclines-1 (CDK1) sur la tyrosine 15 et thréonine 14. Ces résultats indiquent que l’interaction synergistique entre les effets cytotoxiciques du 177Lu et du lilotomab dans les tumeurs montrant une réduction des niveaux de phosphorylations de CDK1 peut compenser le manque d’efficacité thérapeutique du lilotomab comparé au rituximab. / Currently, B-cell Non-Hodgkin Lymphoma (NHL) treatment relies on the anti-CD20 antibody rituximab and chemotherapy. However, some patients become refractory to this therapy. Here, the effect of the novel anti-CD37 antibody-radionuclide conjugate 177Lu-lilotomab (Betalutin®) was investigated in NHL preclinical models and compared to 177Lu-labeled rituximab (anti-CD20 antibody). We developed a radiobiological approach that discriminates between the cytotoxic effects of unlabeled antibodies and of radiation in human lymphoma cell lines. This method allowed showing that in vitro, rituximab and 177Lu-rituximab were more cytotoxic than lilotomab and 177Lu-lilotomab in the radioresistant Ramos Burkitt’s lymphoma cell line. Conversely, 177Lu-rituximab and 177Lu-lilotomab had similar efficacy in the radiosensitive follicular lymphoma DOHH2 cell line. Their cytotoxicity was lower in mantle cell lymphoma Rec-1 cells that are less radiosensitive than DOHH2 cells. These results were confirmed in vivo in mice treated by intravenous injection of these antibodies after subcutaneous xenografts of Ramos or DOHH2 cells. 177Lu-lilotomab and 177Lu-rituximab showed the same therapeutic efficacy in mice xenografted with radiosensitive DOHH2 cells, although unlabeled lilotomab was less efficient than rituximab. Conversely, in mice xenografted with radioresistant Ramos cells, the lower efficacy of 177Lu-lilotomab compared with 177Lu-rituximab could only be compensated by increasing 177Lu-lilotomab tumor absorbed dose. Mechanistically, the tumor cell response to radiation depended on the cell apoptotic response and reduction of G2/M cell cycle arrest through WEE-1 and MYT1-mediated phosphorylation of cyclin-dependent kinase-1 (CDK1) at tyrosine 15 and threonine 14. These results indicate that the synergistic interaction between 177Lu irradiation and lilotomab cytotoxic effects in tumors with reduced CDK1 phosphorylation levels can correct the lower therapeutic efficacy of lilotomab compared with rituximab.

Les lymphomes anaplasiques à grandes cellules (ou ALCL) appartiennent au groupe des lymphomes T périphériques et peuvent être porteurs d'une translocation impliquant le gène ALK (ALK+). Ce sont des lymphomes rares, de haut grade de malignité qui touchent souvent les sujets jeunes. Les traitements actuels permettent d'obtenir une rémission complète pour plus de 80% des patients. Cependant près de 30% des patients dont le traitement est aujourd'hui stratifié selon des facteurs pronostiques cliniques, vont rechuter dans l'année qui suit l'arrêt du traitement. Il est donc essentiel de disposer de critères prédictifs de la rechute au moment du diagnostic afin d'adapter la prise en charge thérapeutique des patients. L'objectif de mon projet était d'une part, d'identifier des facteurs moléculaires dépendants de la tumeur ou de son microenvironnement, associés à la rechute ou à l'absence de rechute et d'autre part, d'établir une signature d'expression génique pronostique au moment du diagnostic utilisable en routine clinique. Nous avons effectué une analyse du profil d'expression génique d'échantillons obtenus au diagnostic d'une cohorte de 48 patients présentant un ALCL ALK+ avec un suivi suffisant (26 provenant de patients ayant rechuté précocement, 22 patients n'ayant pas rechuté). Nous avons mis en évidence une signature de 47 gènes différentiellement exprimés entre les deux groupes de patients. Cette signature montre notamment, dans le groupe des patients n'ayant pas rechuté, un enrichissement en gènes codant pour des protéines impliquées dans la régulation de la matrice extracellulaire. Cette signature a été ensuite validée par PCR quantitative (qPCR) à haut débit (Fluidigm). Les algorithmes de classification tels que les forêts aléatoires et la PLS-DA ont permis de sélectionner les huit gènes les plus discriminants en termes de pouvoir prédictif. Sur la base de leur niveau d'expression, trois gènes ayant le plus fort pouvoir prédictif ont été identifiés par régression logistique. Afin de rendre cette signature applicable en routine clinique, ces trois gènes ont été validés par une technique de qPCR classique. L'expression de ces trois gènes a permis d'établir un score et un seuil permettant de distinguer les patients qui ont un fort risque de rechute des patients qui n'ont qu'un faible risque de rechuter. Cette classification dichotomique donne un taux d'échec de prédiction de seulement 16% sur cette première cohorte de patients. Ce score de prédiction a été validé sur une cohorte indépendante de 18 patients, avec un taux d'échec de 22%. Ainsi cette étude démontre l'intérêt des signatures prédictives issues de données à haut débit afin de guider le clinicien dans le choix de la stratégie thérapeutique. / Anaplastic large cell lymphomas (ALCL) peripheral belong to T cell lymphomas and may be associated with translocations involving the ALK gene (ALK+). These lymphoma are rare, of high grade and often affect young subjects. Current treatments allow obtaining a complete remission for over 80% of patients. However nearly 30% of patients whose treatment is stratified according to current clinical prognostic factors, will relapse in the year following the end of treatment. It is therefore essential to decipher predictive factors of relapse at diagnosis in order to improve therapeutic management. The aim of my project was on one hand, to identify molecular factors of the tumor or its microenvironment, associated with relapse or lack of relapse and secondly, to establish a predictive gene expression signature at diagnosis that could be used in clinical routine. We performed transcriptome analysis of samples obtained at diagnosis in a cohort of 48 patients with ALK+ ALCL and sufficient follow up (26 from patients who early relapsed, 22 patients who did not relapse). We have identified 47 differentially expressed genes between the two groups. This signature shows in particular, from the group of patients who did not relapse, an enrichment of genes encoding proteins involved in the regulation of the extracellular matrix. This signature has been then validated by high-throughput quantitative PCR (Fluidigm). Classification algorithms such as Random Forests and PLS-DA helped select the eight most discriminating genes in terms of predictive power. Based on their expression level, three genes with the strongest predictive power were identified by logistic regression. For diagnostic testing in routine practice, these three genes were validated by standard qPCR. A score and a threshold for distinguishing patients who will relapse from patients who will not were established from the expression of these three genes. This dichotomous classification gives a prediction failure rate of only 16% on this first cohort. This prediction score was then validated in an independent cohort of 18 patients, with a failure rate of 22%. This study demonstrates the value of predictive signatures derived from high-throughput data to guide treatment strategy.

Ce travail a eu pour objectif de proposer des modèles conjoints d'intensités de processus d'événements récurrents et d'un événement terminal dépendant. Nous montrons que l'analyse séparée de ces événements conduit à des biais d'estimation importants. C'est pourquoi il est nécessaire de prendre en compte les dépendances entre les différents événements d'intérêt. Nous avons choisi de modéliser ces dépendances en introduisant des effets aléatoires (ou fragilités) et de travailler sur la structure de dépendance. Ces effets aléatoires prennent en compte les dépendances entre événements, les dépendances inter-récurrences et l'hétérogénéité non-observée. Nous avons, en premier lieu, développé un modèle conjoint à fragilités pour un type d'événement récurrent et un événement terminal dépendant en introduisant deux effets aléatoires indépendants pour prendre en compte et distinguer la dépendance inter-récurrences et celle entre les risques d'événements récurrents et terminal. Ce modèle a été ajusté pour des données de patients atteints de lymphome folliculaire où les événements d'intérêt sont les rechutes et le décès. Le second modèle développé permet de modéliser conjointement deux types d'événements récurrents et un événement terminal dépendant en introduisant deux effets aléatoires corrélés et deux paramètres de flexibilités. Ce modèle s'avère adapté pour l'analyse des risques de récidives locorégionales, de récidives métastatiques et de décès chez des patientes atteintes de cancer du sein. Nous confirmons ainsi que le décès est lié aux récidives métastatiques mais pas aux récidives locorégionales tandis que les deux types de récidives sont liés. Cependant ces approches font l'hypothèse de proportionnalité des intensités conditionnellement aux fragilités, que nous allons tenter d'assouplir. Dans un troisième travail, nous proposons de modéliser un effet potentiellement dépendant du temps des covariables en utilisant des fonctions B-Splines. / This work aimed to propose joint models for recurrent events and a dependent terminal event. We show how separate analyses of these events could lead to important biases. That is why it seems necessary to take into account the dependencies between events of interest. We choose to model these dependencies through random effects (or frailties) and work on the dependence structure. These random effects account for dependencies between events, inter-dependence recurrences and unobserved heterogeneity. We first have developed a joint frailty model for one type of recurrent events and a dependent terminal event with two independent random effects to take into account and distinguish the inter-recurrence dependence and between recurrent events and terminal event. This model was applied to follicular lymphoma patient’s data where events of interest are relapses and death. The second proposed model is used to model jointly two types of recurrent events and a dependent terminal event by introducing two correlated random effects and two flexible parameters. This model is suitable for analysis of locoregional recurrences, metastatic recurrences and death for breast cancer patients. It confirms that the death is related to metastatic recurrence but not locoregional recurrence while both types of recurrences are related. However, these approaches do the assumption of proportional intensities conditionally on frailties, which we want to relax. In a third study, we propose to model potentially time-dependent regression coefficient using B-splines functions.

Les imidazoquinoxalines (imiqualines), molécules bioactives originales analogues chimiques de l’imiquimod et présentant un important potentiel anticancéreux, ont été explorées afin d’élucider leurs mécanismes d'action. Les molécules EAPB0203 et EAPB0503, identifiées lors d’études antérieures comme étant les « têtes de séries », ont montré un effet cytotoxique puissant in vitro sur des lignées cellulaires cancéreuses humaines de mélanome et de lymphomes T. Nous avons étudié l’effet cytotoxique de 13 imiqualines nouvellement synthétisées sur une lignée cellulaire de mélanome humain (A375). Tous les composés ont montré un effet cytotoxique important. L’effet cytotoxique a été démontré sur d’autres lignées cellulaires cancéreuses humaines (côlon, sein et lymphome T de l’adulte).Un blocage du cycle cellulaire en phase G2/M a été mis en évidence par cytométrie en flux sur des cellules A375 traitées par EAPB0203 et EAPB0503. Cet arrêt du cycle cellulaire semble être en relation avec un effet inhibiteur de la polymérisation de la tubuline. En effet, nos résultats ont montré que l’EAPB0503 et 3 autres imiqualines inhibent la polymérisation de la tubuline. L’étude de modélisation moléculaire de la liaison à de la tubuline a montré que ces composés se fixent sur le site de la colchicine.Une analyse transcriptomique sur EAPB0503 a été effectuée pour élucider le mécanisme d'action des imiqualines. Cette étude a été faite sur la lignée A375 en comparaison avec 13 anticancéreux de référence. L’étude transcriptomique a montré que EAPB0503 a une composante antitubuline tout en révélant un mécanisme d’action original. Deux hypothèses mécanistiques pour EAPB0503 ont ainsi été identifiées : 1/ altération de la voie de signalisation liée aux intégrines, 2/ altération de la voie de signalisation du récepteur TNFR et de FasL.Des analyses fonctionnelles in vitro nous ont permis d’explorer ces hypothèses. Ainsi, une altération uniquement des voies de signalisation PI3K/AKT et RAS/MAPK, toutes deux liées aux intégrines, a été observée. La première hypothèse semble donc validée. De plus, ce résultat a été confirmé par l’étude de l’expression et de la phosphorylation de ERK.Finalement, nous avons développé une formulation injectable par voie intraveineuse de EAPB0503 à base de nanocapsules. Cette formulation a d’abord été testée in vitro et in vivo sur un modèle de lymphome. Ces études ont pu mettre en évidence l’absence de toxicité des nanoparticules vides et le maintien de l’activité cytotoxique de EAPB0503 encapsulé in vitro, avec un effet immunomodulateur in vivo qui demande à être exploré. / The imidazoquinoxalines (imiqualines), original bioactive molecules and chemical analogues of imiquimod and with significant anti-cancer potential, were explored in order to elucidate their mechanisms of action. The molecules EAPB0203 and EAPB0503 identified in previous studies as leader, showed potent in vitro cytotoxic effect on human cancer cell lines of melanoma and T lymphoma. We studied the cytotoxic effect 13 newly synthesized imiqualines on a cell line of human melanoma (A375). All compounds showed a significant cytotoxic effect. The cytotoxic effect was shown on other human cancer cell lines (colon, breast and adult T lymphoma).A cell cycle block in G2 / M phase was demonstrated by flow cytometry on A375 cells treated with EAPB0203 and EAPB0503. This cell cycle arrest seems to be related with an inhibitory effect on the polymerization of tubulin. Indeed, our results showed that EAPB0503 and three other imiqualines inhibit tubulin polymerization. The molecular modeling study of binding to tubulin showed that these compounds bind at the colchicine site.A transcriptomic analysis on EAPB0503 was performed to elucidate the mechanism of action of imiqualines. This study was made on the A375 line compared with 13 approuved anticancer molecules. This transcriptomic study showed that EAPB0503 has an antitubulin effect while revealing a novel mechanism of action. Two mechanistic hypotheses for EAPB0503 were identified: 1/ alteration of the signaling pathway linked to integrin, 2/ alteration of the signaling pathway TNFR receptor and FasL.In vitro functional analyses have allowed us to explore these hypotheses. Thus, alteration only PI3K / AKT and RAS / MAPK signaling pathways, both related to integrins, was observed. The first hypothesis seems confirmed. Moreover, this result was confirmed by the study of the expression and phosphorylation of ERK.Finally, we developed an intravenously injectable formulation of EAPB0503 based on nanocapsules. This formulation was first tested in vitro and in vivo on lymphoma model. These studies could highlight the lack of toxicity of empty nanoparticles and retention of the cytotoxic activity of encapsulated EAPB0503 in vitro, with an in vivo immunomodulatory effect which needs to be explored.

Le syndrome hyperéosinophilique dit "lymphoïde" avec cellules T circulantes CD3-CD4+ (SHE-L CD3-CD4+) se caractérise par une hyperéosinophilie secondaire à la présence d'un clone lymphocytaire T producteur de cytokines comme l'IL-5. Trente patients seulement ont été rapportés dans la littérature, neuf d'entre eux ont présenté un lymphome T périphérique au cours du suivi. Il n'existe aucune grande série de la littérature décrivant les données cliniques, les caractéristiques immunophénotypiques, histopathologiques et moléculaires de la maladie. Le travail de Thèse a permis de confirmer la prédominance des manifestations cutanées et ganglionnaires dans le SHE-L CD3-CD4+, mais également d'autres atteintes d'organes dont l'infiltrat à éosinophiles a été démontré (poumon, tube digestif, glande lacrymale, parotide, synoviale). Les cellules CD3-CD4+ circulantes peuvent être détectées à des taux extrêmement variables, des plus faibles (<1% des lymphocytes circulants) ne devant pas être négligés, aux plus élevés (>90% des lymphocytes circulants) ne devant pas faire évoquer systématiquement une hémopathie maligne. Nous décrivons également les 2 premiers cas de lymphomes angio-immunoblastiques (LAI) survenant au cours du SHE-L CD3-CD4+. Nous avons ensuite pu décrire pour la première fois les caractéristiques histopathologiques ganglionnaires et extra-ganglionnaires (peau, tube digestif,...) du SHE-L CD3-CD4+. Nous décrivons des caractéristiques ganglionnaires et cutanées très similaires au LAI qui soulignent les difficultés du diagnostic différentiel. Nous démontrons également la persistance du même clone lymphocytaire T dans le sang et les tissus lésés sur des prélévements espacés de plusieurs années pour un patient donné (maximum: 23 ans). Enfin, les caractéristiques immunophénotypiques des cellules T circulantes (expression du CD2, CD5, CD7, TCRalphabeta) sont très proches de celles observées dans le LAI. L'ensemble de ces données définissent le SHE-L CD3-CD4+ comme un syndrome lymphoprolifératif clonal T indolent périphérique, à ne pas confondre avec le LAI. Nous proposons des éléments de diagnostic différentiel comme l'expression du CD10 et des marqueurs CXCL13 et PD1 (marqueurs dits "T helper folliculaire"), absents dans le SHE-L mais spécifiques du LAI. La dernière partie du travail de Thèse a porté sur la caractérisation moléculaire du SHE-L CD3-CD4+ par une approche type single nucleotid polymorphism array (SNPa, n=4 patients) en complément d'une étude antérieure par une approche type comparative genomic hybridization array (CGHa, n=1 patient). La comparaison du génome complet des cellules CD3-CD4+ et CD3+CD4+ par SNPa pour un patient donné, a permis d'identifier une zone commune de perte d'hétérozygotie sur le bras long du chromosome 7. L'identification par CGHa d'un gain sur le même segment chromosomique chez un autre patient permet de restreindre la zone d'intérêt à un segment chromosomique porteur de 77 gènes. Des compléments d'investigation (SNPa) sont en cours afin de restreindre le segment chromosomique d'intérêt et d'identifier le gène muté en cause par des méthodes de séquençage. Cette approche devrait permettre d'identifier pour la première fois les mécanismes moléculaires à l'origine de l'émergence du clone lymphocytaire T dans le SHE-L CD3-CD4+. En conclusion, le travail de Thèse a permis d'apporter des éléments nouveaux dans le diagnostic du SHE-L CD3-CD4+, d'en décrire les caractéristiques histopathologiques et immunophénotypiques en faveur d'un syndrome lymphoprolifératif T clonal indolent périphérique, sans équivalent dans la classification OMS actuelle des hémopathies. Enfin, nous espérons pouvoir identifier un ou des gènes d'intérêt, et proposer des mécanismes moléculaires en cause dans ce syndrome lymphoprolifératif clonal T. / The CD3-CD4+ lymphoid variant of hypereosinophilic syndrome (CD3-CD4+ L-HES) is defined by a hypereosinophilia secondary to a clonal T-cell subset producing cytokines like interleukine-5. Only thirty patients have already been described, nine of them have developed a T-cell lymphoma during follow-up. No large series has described clinical features and immunophenotypic, histopathological and molecular characteristics of the disease. This work confirmed the predominance of skin and lymph nodes involvement in CD3-CD4+ L-HES, but also of other organs in which eosinophils infiltrates were demonstrated (lung, digestive tract, lachrymal gland, parotid, synovium). CD3-CD4+ circulating T-cells can be detected at very low level (<1% of total lymphocytes) which should not be neglected, or at very high level (>90% of total lymphocytes) which should not considered as a malignant disorder. We also describe the two first cases of angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL) occurred in CD3-CD4+ L-HES. We have also described for the first time the nodal and extra nodal histopathological characteristics of CD3-CD4+ L-HES, which are similar to AITL and which highlight the difficulty of differential diagnosis. We also demonstrate the same T-cell clone in blood and damaged tissues in samples spaced up for several years (maximum 23 years). Secondly, immunophenotypic characteristics of circulating T-cells (CD2, CD5, CD7, TCRalphabeta) are really closed to those of circulating T-cells in AITL. Overall, our data define CD3-CD4+ L-HES as a peripheral indolent clonal T-cell lymphoproliferative disorder, which should not be confused with AITL. We suggest some differential diagnosis tools like CD10 and Tfh markers (CXCL13, PD1) which are absent in CD3-CD4+ L-HES but specific of AITLThe last part of the work focused on the molecular characterization of the CD3-CD4 + L-HES by a single nucleotid polymorphism array approach (SNPa, n = 4 patients) in complement of an earlier study using comparative genomic hybridization array approach (CGHa, n = 1 patient). The comparison of the full genome of CD3-CD4 + and CD3+CD4+ T-cells in a given patient identified a common segment of loss of heterozygosity on the long arm of chromosome 7. Identification by CGHa of a gain on the same chromosomal segment in another patient allows restricting the area of interest to a chromosomal segment which represents 77 genes. Complementary investigations (SNPa) are underway to restrict the chromosomal segment of interest and identify the potential mutated genes by sequencing methods. This approach should identify for the first time the molecular mechanisms underlying the emergence of clonal T-cells in the CD3-CD4 + L-HES.In conclusion, the work brings some new usefull features for the diagnosis of CD3-CD4+ L-HES, describes some histopathological and immunophenotypic features in favor of a peripheral indolent clonal T-cell lymphoproliferative disorder, without any equivalent in the 2008 WHO classification of lymphoid neoplasms. Finally, we hope to identify one or more genes of interest, and to propose some molecular mechanisms involved in this clonal lymphoproliferative T-cell disease.

Les macrophages associés aux tumeurs (TAMs) proviennent des monocytes circulants attirés par l'inflammation chronique due à la tumeur. Ces monocytes vont se différencier en une variété de macrophages en fonction des médiateurs présents dans le microenvironnement tumoral. Ainsi, il est admis que les macrophages peuvent stimuler la croissance tumorale (macrophages classiquement appelés M2), mais peuvent aussi reconnaitre et éliminer spécifiquement les cellules transformées (macrophages M1). Cette dichotomie fonctionnelle est dépendante du stade de développement cancéreux et plus spécifiquement de l'évolution du microenvironnement tumoral. De manière générale, l'infiltration et la densité élevée des TAMs au niveau de la tumeur sont corrélées à un mauvais pronostic et de ce fait les TAMs sont considérés comme une cible thérapeutique importante. Dans ce travail de thèse, nous nous sommes attachés dans un premier temps à caractériser le phénotype et les fonctions des macrophages au cours de l'évolution de la tumeur. La mise en place d'un modèle murin préclinique de lymphome T (cellules EL4) nous a permis de montrer que les macrophages présents à un stade tardif du développement tumoral, sont capables de stimuler la prolifération des cellules tumorales. Ces macrophages produisent des facteurs pro-angiogéniques, comme le TGF-ß, et immunosuppresseurs, comme l'IL-6, l'IL-10 et l'Indoléamine dioxygénase (IDO). De manière intéressante, nous avons démontré la capacité de l'IL-6, sécrétée en grande quantité dans l'ascite tumorale, à induire la différenciation des macrophages résidents en macrophages M2 pro-tumoraux. Inversement, nous avons montré que des macrophages murins résidents activés par l'IFN-? ou l'IL-13, cytokines non présentes dans l'ascite tumorale, acquièrent un phénotype anti-tumoral. Alors que l'IFN-? est connu pour induire un macrophage M1 présentant un puissant potentiel tumoricide, nous montrons que l'IL-13, qui polarise les macrophages vers un phénotype alternatif (M2), peut aussi différencier les macrophages vers un phénotype anti-tumoral. Dans ce contexte, nous avons étudié les mécanismes anti-tumoraux des macrophages polarisés par l'IL-13 vis-à-vis des cellules lymphoblastoïdes T. De façon originale, nous avons montré que les macrophages activés par l'IL-13 induisent la nécrose des cellules EL4, en produisant des radicaux libres oxygénés (RLO) et en déplétant l'arginine par l'augmentation de l'activité arginase. Nous avons également montré que les récepteurs Mannose et Dectine-1(Récepteurs Lectine de type-C), fortement exprimés par les macrophages activés par l'IL-13, reconnaissent les cellules tumorales et déclenchent la production des RLO en activant la voie Syk-P47phox. Ils induisent aussi la surexpression de l'arginase en activant la libération d'acide arachidonique et la production des HETEs (acide hydroxy-eicosatétraénoïque), agonistes naturels du récepteur nucléaire PPAR?. De plus, nous avons pu valider, in vivo, la capacité de l'IL-13 à reprogrammer les macrophages pro-tumoraux associés au lymphome T vers un phénotype anti-tumoral et à induire une régression de la tumeur. Ces résultats ont été confirmés par la diminution de la charge tumorale des souris porteuses de lymphome T, après un transfert adoptif des macrophages activés par l'IL-13. Enfin, nous avons établi que l'IL-13 active aussi les fonctions anti-tumorales des macrophages dérivés de monocytes humains contre diverses cellules tumorales humaines. Ce travail illustre la complexité du paradigme M1/M2 dans la description des fonctions pro- et anti-tumorales des macrophages. Ainsi, nos travaux démontrent la capacité de l'IL-13 à stimuler les défenses anti-tumorales des macrophages dans le cadre d'un lymphome T. Ce travail montre également que la modulation efficace des récepteurs Mannose et Dectine-1 par l'IL-13 pourrait permettre d'orienter l'interaction " cellules tumorales-macrophages " pour le bénéfice de l'hôte. / Tumor-associated macrophages (TAMs) are derived from circulating monocytes attracted by the chronic inflammation in the tumor. These monocytes differentiate into a variety of macrophages according to the mediators present in tumor microenvironment. Thus, it is known that macrophages can stimulate tumor growth (usually called M2 macrophages) but may also, in other circumstances, specifically recognize and eliminate transformed cells (M1 macrophages). This functional dichotomy is dependent on the stage of cancer development and specifically on tumor microenvironment. In general, the infiltration and the high density of TAMs in the tumor are associated with poor prognosis and consequently, TAMs might be an important therapeutic target. In this work, we first focused on the phenotype and the functions of the macrophages associated to tumor progression. The use of a preclinical mouse model of T-cell lymphoma (EL4 cells) has shown that macrophages associated to the late stage of tumor development stimulate EL4 tumor cell proliferation. These macrophages produce pro-angiogenic factors like TGF-ß and immunosuppressive mediators, such as IL-6, IL-10 and Indoleamine dioxygenase (IDO). Interestingly, we have shown that IL-6, highly secreted in tumor ascites, can improve protumoral functions of resident macrophages. Conversely, murine resident macrophages activated by IFN-? or IL-13, cytokines not detected in the tumor ascites, acquire an antitumor phenotype. While IFN-? is known to induce M1 macrophages with a powerful tumoricidal potential, we report that IL-13, which stimulate alternative phenotype (M2) of macrophages, can induce antitumor functions of macrophages. In this context, we studied the antitumor mechanisms of IL-13-activated macrophages against T-lymphoma cells. We report that IL-13-activated macrophages exert antitumor activity by promoting T-lymphoma cell necrosis through ROS release and arginase induced-L-arginine depletion. In fact, L-arginine degrading enzymes have been suggested as antitumor agents against multiple tumor lineages auxotrophic for L-arginine. We have also shown that the activation of IL-13-activated macrophages antitumor functions is dependent on the tumor cell recognition by mannose and dectin-1 receptors (C-type Lectin Receptors). Indeed, after recognition, these receptors that are overexpressed by IL-13-activated macrophages, activate Syk-P47phox pathway for ROS production and arachidonic acid-HETEs (hydroxy-eicosatetraenoic acid)-PPAR? axis for arginase activity. Moreover, IL-13 improves T-cell lymphoma regression in tumor-bearing mice through its ability to reprogram TAMs toward cytotoxic effectors. This was supported by a decrease of tumor burden in tumor-bearing mice after adoptive transfer of IL-13-activated macrophages. Finally, we established that IL-13 activates human monocyte-derived macrophages to become tumoricidal against various human tumor cells. This work shows the complexity of the M1/M2 paradigm in the description of pro- and antitumor functions of macrophages. Thus, our findings demonstrate the ability of IL-13 to stimulate macrophage antitumor activities, in the context of T-cell lymphoma. This work also suggests that effective modulation of mannose and dectin-1 receptors by IL-13 might shift the "tumor cells-macrophages" interaction for the host benefit.