Des études menées sur des modèles animaux ont montré que le métabolisme oxydatif joue un rôle important dans l’hématopoïèse normale et leucémique via le contrôle de l’activation de p38 MAPK. Nous avons établi que les cellules CD34+CD38- médullaires humaines ont un très faible niveau d’H2O2 et une forte expression de GPX3, le gène codant l’enzyme antioxydante glutathion peroxydase-3 (GPx-3), un déterminant majeur du potentiel souche des cellules hématopoïétiques. De plus, la niche leucémique étant essentielle pour l’auto-renouvellement des cellules souches leucémiques, nous avons étudié, chez l’homme, le rôle des cellules souches/stromales mésenchymateuses (CSM) médullaires primaires, dans la régulation de l’axe GPx-3/H2O2/p38 MAPK des cellules leucémiques et avons montré que les CSM contrôlent cet axe dans les cellules leucémiques humaines KG1a en régulant l’expression de GPx-3. Ces résultats ont bénéficié du développement de deux méthodes originales, l’une quantifiant l’expression des gènes antioxydants par RT-qPCR (« antioxydogramme », brevet) et l’autre permettant une analyse en haute résolution du cycle cellulaire par cytométrie en flux. / Studies in animal models have demonstrated that oxidative metabolism plays an important role in normal and leukemic hematopoiesis by controlling the p38 MAPK activation. We have established that the human bone marrow CD34+CD38- cells have a very low H2O2 level and express GPX3, the gene encoding for the antioxidative enzyme gluthathione peroxidase-3 (GPx-3) which is a major determinant of the stem cell potential of hematopoietic cells. As the niche is essential for the leukemic stem cell self-renewal, we have studied the role of human primary bone marrow mesenchymal stromal/stem cells (MSCs) in regulating the axis GPx-3/H2O2/p38 MAPK in human leukemic cells and we have shown that MSCs control this axis in human KG1a leukemic cells by regulating the expression of GPx-3. These results benefited from the development of two original methods, the first one quantifying the expression of by RT-qPCR of antioxidative genes (“antioxidogram”, patent) and the second one for high resolution analysis of the cell cycle by flow cytometry.

La grande originalité de mon projet réside dans la génération de cellules stromales mésenchymateuses (MSCs) à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPS). Je rappellerai les propriétés phénotypiques, de multipotence et immunosuppressives des MSCs et m’attarderai sur leurs différents mécanismes immunomodulateurs. Cependant, leur nombre limité et leur isolation difficile limitent leur utilisation thérapeutique nécessitant une autre source de cellules.Mon travail a donc été de générer et de caractériser des MSCs issues d’iPS (huiPS-MSCs). L'avantage des huiPS-MSCs réside dans leur plus grande disponibilité et la possibilité d'en avoir à volonté. Encore faut-il valider l’intérêt thérapeutique potentiel de ces huiPS-MSCs. Premièrement, mes résultats in vitro montrent que les huiPS-MSCs présentent une activité immunosuppressive sur les lymphocytes T (LT) activés conduisant à une induction de LT régulateurs FoxP3+ fonctionnels. Deuxièmement, dans une approche plus axée sur la thérapie, j’ai analysé in vivo l’activité́ immunosuppressive des huiPS-MSCs dans un modèle de réaction xénogénique de greffon contre l'hôte (souris immunodéficientes NSG injectées avec des LT humains). Je montre clairement, après traitement avec les huiPS-MSCs, une réduction de la proportion de LT humains producteurs de cytokines inflammatoires (IFNγ et TNFα) typiques de la pathologie et l’apparition concomitante de LT présentant un phénotype régulateur (production d’IL10 et expression de FoxP3). La fin de mon travail a été de caractériser moléculairement la régulation de l’expression de PD-L1, une molécule immuno-régulatrice puissante, entre les MSCs issues de la moelle osseuse (BM-MSCs) de donneurs sains et nos huiPS- MSCs. Les huiPS-MSCs ont une expression constitutive de PD-L1, qui est absente sur les BM-MSCs. J’ai analysé les microARNs susceptibles de limiter l’expression de PD-L1, j’ai pu en identifier plusieurs. En mesurant leur expression dans les différentes MSCs à notre disposition, je montre que cette expression est inverse par rapport à celle de PD-L1. J’ai ainsi pu démontrer l’activité immunosuppressive de nos huiPS-MSCs in vitro et in vivo avec une perspective d’induction de tolérance immune, et caractériser la régulation de l’expression de PD-L1, molécule immunosuppressive exprimée par les huiPS-MSCs. / The mesenchymal stromal cells (MSCs) present many features that render attractive as therapeutic cells. Their phenotype, multipotency and immunosuppressive properties are well described. Nevertheless, major restriction for their clinical use is due to the limited in vitro expansion and low quantity of cells that can be collected from adult tissues. The originality of my project consisted in the generation of mesenchymal stromal cells (MSCs) from human induced pluripotent stem cells (iPS). These huiPS-MSCs could fulfill some of the specification required to improve MSCs use in therapeutic approaches: welldefined and unlimited number of cells with reproducible functional characteristics. In a first approach, I characterized the huiPS-MSCs generated in the laboratory. My results highlight the immunosuppressive activity in vitro of the huiPS-MSCs on T-cell stimulation that induces a switch in T-cell cytokine polarization toward the generation of Treg cells. Secondly, in a more therapy-oriented approach, I analyzed in vivo immunosuppressive activity of huiPS-MSCs in a xenogeneic graft versus host model (NSG immunodeficient mice injected with human T lymphocytes). My data showed significantly reduced percentages of human-differentiated T cells producing Th1 inflammatory cytokines (IFNγ and TNFα). By contrast, T cells producing IL-10 and FoxP3+ Treg cells, absent in nontreated animals, were detected in huiPS-MSCs treated mice, confirming the in vitro results of a tolerizing process. The end of my work was to characterize the molecular regulation of the expression of PDL1, an immunoregulatory molecule expressed by the MSCs. Comparing bone marrow MSCs (BM-MSCs) from healthy donors and our huiPS-MSCs, I showed that the huiPSMSCs have a constitutive expression of PD-L1, which is absent on BM-MSCs. Analysing microRNAs that could limit the expression of PD-L1, I could identify several microRNAs which expression is inverse to the expression of PD-L1. For the first time, my results highlight the immunosuppressive activity of huiPS-MSCs on human T-cell stimulation with a concomitant generation of human Treg cells in vivo and characterize the regulation of PD-L1 expression, an immunosuppressive molecule expressed by the MSCs. They may favor the development of new tools and strategies based on the use of huiPS cells and their derivatives for the induction of immune tolerance.

Le cartilage articulaire est un tissu possédant une faible capacité de réparation intrinsèque. Dès lors, la répétition de traumatismes articulaires induit un microenvironnement propice à la dégradation du cartilage et, in fine, l’émergence de l’arthrose. Les traitements utilisés à l’heure actuelle visent uniquement à soulager la douleur, réduire l’inflammation et la progression de l’arthrose. Ainsi, le traitement des lésions chondrales équines revêt une importance majeure puisque les affections locomotrices constituent la première cause de baisse de performances et d’arrêt prématuré de la carrière du cheval sportif. De plus, le cheval est le modèle animal qui possède le cartilage articulaire le plus semblable à celui de l’Homme et, en conséquence, représente un modèle d’étude pertinent pour les lésions chondrales humaines. Dans ce contexte, notre étude s’est attachée à développer de nouvelles stratégies pour le traitement des lésions chondrales basées sur la différenciation chondrogénique de CSM en vue de produire in vitro un substitut cartilagineux implantable en site articulaire. Ainsi, nous avons d’abord isolé et caractérisé des CSM équines à partir de prélèvements de moelle osseuse (MO) et de sang de cordon ombilical (SCO), puis, nous avons réalisé la différenciation en cultivant les CSM durant 14 jours en hypoxie ou normoxie au sein d’un biomatériau (éponges de collagène de types I/III), en présence de BMP-2 et TGF-β1 et de siRNA ciblant le collagène de type I et HtrA1, molécules atypiques du cartilage hyalin. Bien que ce protocole nous ait permis d’obtenir un substitut cartilagineux riche en marqueurs du cartilage hyalin comme le collagène de type II et l’agrécane, la présence du collagène de type I persistait. Nous avons donc tenté d’optimiser le protocole en allongeant le temps de culture, en utilisant le TGF-β3, et en modifiant la stratégie d’interférence par l’ARN. Cette étape nous a permis de conclure sur l’effet bénéfique de l’allongement de la culture à 28 jours et l’efficacité des facteurs chondrogéniques initialement utilisés. Néanmoins, la stratégie d’interférence par l’ARN demeure encore perfectible. Finalement, nous avons comparé la qualité du substitut cartilagineux obtenu après différenciation en fonction de la source de CSM utilisée. Les CSM de MO semblent les plus adaptées mais le protocole que nous avons utilisé n’est probablement pas le plus efficace pour induire la différenciation des CSM de SCO. Dans une partie complémentaire, bien que ces résultats soient préliminaires, nous avons montré que le sécrétome des CSM pourrait être un formidable outil afin d’améliorer le traitement des lésions chondrales. Dans leur ensemble, les résultats obtenus permettent d’avoir un regard optimiste concernant la mise en place de thérapies cellulaire et tissulaire du cartilage, aussi bien en médecine équine qu’humaine. / Articular cartilage is a tissue with low intrinsic repair abilities. Therefore, repeated traumas lead to cartilage degradation and ultimately, to the emergence of osteoarthritis (OA). Current therapies aim to reduce pain, inflammation and to prevent the progression of OA. Thus, treatment of equine chondral lesions is of major importance since locomotor disorders are the main causes of poor performance and early retirement of the athlete horses. In addition, the horse is an animal model with the most human-like articular cartilage and, therefore, represents the best relevant model to study human chondral lesions and arthropathies. In this context, our study focused on developing new strategies for the treatment of chondral lesions based on the chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells (MSC) in order to produce an in vitro neo-synthetized cartilaginous substitute, which could be implantable in the chondral lesion site. Thus, we first isolated and characterized equine MSC derived from bone marrow (BM) and umbilical cord blood (UCB). Then, we have differentiated MSC by culturing them for 14 days in hypoxia or normoxia, in a biomaterial (types I / III collagen sponges), in the presence of BMP-2 and TGF-β1 and siRNA targeting type I collagen and HtrA1, two atypical hyaline cartilage molecules overexpressed in OA. Although this protocol allowed us to obtain a cartilaginous substitute composed of large amounts of hyaline cartilage markers such as type II collagen and aggrecan, the presence of type I collagen persisted. We therefore tried to optimize the protocol by extending the culture time, using TGF-β3, and modifying the RNA-interference strategy. We have concluded on the beneficial effect of the lengthening of the culture to 28 days and the effectiveness of the chondrogenic factors initially used. Nevertheless, the RNA-interference strategy still remains perfectible. Finally, we compared the quality of the neo-synthetized cartilaginous substitute according to the source of MSC used. BM-MSC seem to be the most suitable, but the protocol we used is probably not the most effective for inducing UCB-MSC differentiation. In a complementary part, although these results are very preliminary, we have shown that the MSC secretome could be a tremendous tool to improve current therapies of chondral lesions. Overall, the results obtained make it possible to look ahead with optimism, in order to obtain future efficient cartilage tissue engineering therapies, both in equine and human medicines.

Introduction : Les cellules souche mésenchymateuse (CSM) présentent une puissante activité immunomodulatrice sur les lymphocytes T et les Natural Killer (NK), impliquées dans les réactions allogéniques. Les propriétés immunomodulatrices des CSM dépendent de contacts cellulaires et des facteurs secrétés. Ainsi les exosomes produits par ces cellules pourraient constituer des nouveaux produits thérapeutiques.L’objectif de ce travail est d’étudier, in vitro, l’effet d’exosomes dérivés de CSM sur les lymphocytes B, T et les NK.Méthodologie : Les CSMs utilisées sont issues de foies fœtaux humains. Les exosomes ont été isolés à partir du milieu de culture des CSMs par une série d’ultracentrifugation à 100000g.Résultats : Contrairement aux CSMs qui inhibent la prolifération des lymphocytes T et B, leurs exosomes n'ont pas d'effet sur leur prolifération. Cependant ils inhibent la prolifération, l’activation et la cytotoxicité (expresion CD107a) des NK. Nous avons mit en évidence, par FACS, la présence de TGFbeta; à la surface des exosomes. De plus leur fonction inhibitrice est abrogé en présence d’un anticorps bloquants anti-TGFbeta;. Réciproquement l’exposition de cellules NK à du TGFbeta; inhibe la cytotoxicité et la prolifération de cellules. Enfin, en présence d'exososmes nous avons montré, par IF, une translocation de Smad 2/3 (messager du signal TGFbeta;) dans les noyaux des cellules NK, inhibé par l'ajout d'anticorps anti-TGFbeta;.Conclusion: Ces résultats suggère que les propriétés immunomodulatrices de CSMs sur NK pourraient dépendre de TGFβ présenté ou associé aux exosomes. / Introduction: Mesenchymal stem cells (MSCs) are powerful immunomodulators regulating the function of B and T lymphocytes and natural killers cells (NK) involved in allogeneic reactions. Their immunomodulatory properties depend on cell contact and secretion factors produced by MSCs. Thus exosomes produced by these cells could provide new therapeutic tools.Objective: The objective of this work is to study the effect of MSC derived exosomes in vitro on B and T lymphocytes and NK cells.Method: MSCs used for this study are isolated from human fetal liver. Exosomes were isolated from MSC culture medium by a serie of ultracentrifugation at 100000g.Results: MSCs inhibit the proliferation of T lymphocytes. Unlike MSCs, their exosomes do not abrogate the proliferation of T and B cells. However they inhibit the proliferation, activation and cytotoxicity (CD107a expression) of NK cells. By FACS analysis we showed a surface expression of TGFb; by exosomes. Inhibition of NK cells activation by exosomes is altered by a neutralizing anti-TGFb; antibody. Contrary when NK cells are cultured with TGFb; the same effect qs exosomes is demonstrated. By IF, we found a nuclear translocation of Smad 2/3 (TGFb; signal transducer) in NK cells cultured with exosomes, which is inhibited by the qddition of anti-TGFb; antibody.Conclusion: These results suggest that the immunomodulatory properties of MSCs on NK could depend on exosome presentation or association with TGFb;.

Introduction : L’efficacité de la greffe d’îlots n’est plus à démontrer mais elle reste l’objet de recherches pour améliorer la qualité et la survie des îlots greffés souvent fragilisés par la destruction enzymatique de leur microenvironnement lors de la procédure d’isolement. Dans ce contexte, les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) d’origine pancréatique représentent un outil intéressant par leurs propriétés d’immunomodulation et par leur capacité de sécrétion de facteurs du microenvironnement. L’objectif de ce travail est d’évaluer l’effet des cellules stromales pancréatiques humaines sur les cellules β humaines.Méthodes : Des îlots humains purifiés ont été maintenus en culture pendant plusieurs jours. Les cellules adhérentes se formant en périphérie de l’îlot ont été sélectionnées et immortalisées. Ces nouvelles cellules « human islet-derived stromal cells » (hISC) ont ensuite été caractérisées pour déterminer leur profil mésenchymateux Nous avons ensemencé des cellules β humaines (lignée EndoC-βH1 ou cellules primaires) sur du milieu conditionné de hISC (hISC-CM) utilisé comme support de culture. L’adhérence, la survie, la prolifération, l’insulinosécrétion des cellules β cultivées sur le hISC-CM ont été mesurées et comparées à un support contrôle : la poly-L-lysine.Résultats : Les hISC présentent un profil phénotypique et transcriptomique très proche des CSM issues de la moelle osseuse. D’un point de vue fonctionnel, les hISC présentent une capacité d’immunomodulation. Elles expriment et sécrètent des protéines matricielles connues pour être présentes autour et à l’intérieur des îlots humains tels que les collagènes de type I, IV et VI, la laminine et la fibronectine. Au contact du hISC-CM les cellules EndoC-βH sur adhèrent st s’étalent. Le hISC-CM augmente l’expression du marqueur de prolifération PCNA et améliore la survie et la fonction des cellules EndoC-βH1. D’un point de vue mécanistique, l’interaction cellules β/hISC-CM active la phosphorylation de FAK (focal adhesion kinase) et ERK (extracellular signal-regulated kinases). A l’interface de cette interaction, la sous-unité β1 de l’intégrine est impliquée dans les effets observés du hISC-CM sur l’adhérence et la fonction des cellules β.Conclusion : Nos travaux démontrent l’intérêt prometteur des hISC en tant que cellules de soutien des cellules β humaines par la sécrétion de protéines matricielles pancréatiques. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour le maintien des îlots en culture et leur conditionnement dans un microenvironnement plus physiologique permettant ainsi de préserver leur qualité fonctionnelle lors de la greffe. / Introduction : The efficacy of islet transplantation is well established. However, the procedure still needs improvements in the quality of grafted islets, often weakened by the loss of their surrounding tissue during the isolation process. In this respect, mesenchymal stromal cells (MSC) represent an interesting tool as they have immunomodulatory and anti-inflammatory properties and are known to secrete proteins involved in creating a favorable microenvironment. This work aims to investigate the effect of human pancreatic stromal cells on human β-cells.Methods : We characterized the mesenchymal profile of cells, previously immortalized in our lab from human islets of Langerhans adherent cells, hereafter named hISC (human islet-derived stromal cells). We seeded human β-cells (EndoC-βH1 cell line or primary β-cells) on hISC-conditioned medium (hISC-CM) used as coating of Petri dishes. We assessed spreading, survival, proliferation and glucose-induced insulin secretion of β-cells cultured on hISC-CM as compared to poly-L-lysine coating.Results : Phenotypic and transcriptomic profiles of hISC are close to bone-marrow MSC. The hISC have an immunomodulation capacity. They express and secrete extracellular matrix proteins known to be present around and within human islet such as types I, IV and VI collagens, laminin and fibronectin. EndoC-βH1 seeded on hISC-CM adhere and spread on cell culture surface. We show that hISC-CM has positive effects on EndocC-βH1 proliferation, survival and glucose-induced insulin secretion, as compared to poly-L-lysine. From mechanistic point of view, hISC-CM induces FAK (focal adhesion kinase) and ERK (extracellular signal-regulated kinases) phosphorylations. The β1-integrin subunit is involved in both adhesion and increased insulin secretion of β cells induced through hISC-CM.Conclusion : Our work demonstrates a promising interest of hISC as support cells for human β-cells by scaffolding factors secretion. It opens new perspectives for conditioning human β-cells in a more physiological microenvironment to preserve their functional quality before and after transplantation.

. / Articular cartilage is made up of dense, connective tissue localized at the junction of several locations in the skeleton. It covers the surface of the joints to ensure that bones can move. It is an avascular tissue that is not innervated and is composed primarily of a single cell type, the chondrocyte, which synthesizes an abundant extracellular matrix (ECM). Osteoarthritis (OA), a degenerative disease of articular cartilage, is characterized by the degradation of the ECM, associated with increased secretion of matrix metalloproteinases (MMPs) and aggrecanases. In addition, the OA process induces chondrocyte dedifferentiation characterized at least in part by increased synthesis of type I collagen, an atypical isoform in articular cartilage. Moreover, due to the poor intrinsic healing capacity of articular cartilage, there is currently no treatment to restore the chondrocyte phenotype and, in the most advanced stages of OA, the joint must be replaced with a prosthesis, requiring surgery. Therefore, various drug and surgical treatments have been developed in an attempt to prevent the destruction of cartilage which, in light of their relative success, then lead to new, improved therapeutic strategies. One of the most promising approaches is the cartilage tissue engineering based on the procedure described by Brittberg using autologous chondrocyte implantation (ACI). Applied in the earliest stages of OA or chondral lesions, ACI is based on the use of chondrocytes from a healthy, non-bearing region of the diseased joint. The cells are then amplified in monolayer culture and then re-implanted in the lesion. However, amplification of autologous chondrocytes in two-dimensional culture mimics, at least in part, some of the characteristics of the OA process and is accompanied by cell dedifferentiation leading to the formation of nonfunctional fibrocartilage. The numerous pharmaceutical approaches and surgical techniques developed to repair cartilage lesions have revealed their limitations. Ideally, traumatic cartilage lesions should be treated earlier to prevent OA and postpone prosthetic surgery. In the interest of preventing OA, cartilage cell therapy has proven to be a pivotal approach for repairing damaged tissue. Cell therapy consists not only in filling the cartilage lesion with healthy chondrocytes, but also in reconstituting the structure, the physico-chemical properties and the functionality of the hyaline matrix. The transplantation of autologous chondrocytes is the foundation of cell therapy and cartilage tissue engineering and there have been several generations of ACI, each improving on the previous one. However, even the most recent ACI techniques are showing limitations and consequently, research efforts are now focused on improving this technique in order to obtain, after amplification, a differentiated and stable chondrocyte phenotype. This is to be achieved by using new types of biomaterials that can fill more important lesions, molecules and growth factors to better control the chondrogenic differentiation and more suitable cell sources that avoid morbidity at the donor site as it is the case with articular chondrocytes. Today, MSCs hold much promise for biomedical research because they are able to recapitulate many tissues, including cartilage. However, for future advances in the field of regeneration and tissue engineering it is important to know the exact nature of these cells. With this goal, in this work, we first fully characterized 4 categories of serum free amplified mesenchymal stem cells extracted from adipose tissue (AT), bone marrow (BM), dental pulp (DP) and Wharton’s jelly (WJ) of the umbilical cord. The cells were characterized in terms of efficiency of isolation, amplification kinetics and according to an extensive immunophenotyping using flow cytometry... [etc]

Les progrès dans la compréhension de la biologie osseuse ont permis d’identifier le rôle du système nerveux sensoriel dans la formation osseuse, le remodelage et la régénération tissulaire. Cependant, le rôle précis du système nerveux sensoriel sur la l’ostéogénèse reste encore méconnu. La première partie de ce travail a été d’analyser le rôle des neurones du ganglion de la racine dorsale (DRG) sur la différenciation ostéoblastique des cellules souches mésenchymateuse (MSCs). Pour répondre à cette question, nous avons utilisé une plate-forme microfluidique, qui tente de mimer l’innervation sensorielle du tissu osseux. Dans la seconde partie de cette étude, nous avons cherché à mieux caractériser la sous-population de neurones DRG impliqués dans la régulation directe de la différenciation des MSCs vers le lignage ostéoblastique. En conclusion, l’ensemble des résultats permettent de montrer que: i) les neurones sensoriels ont un effet positif et direct sur la différenciation ostéoblastique des cellules ostéoprogénitrices, ii) la voie de signalisation Wnt/β-caténine est impliquée dans cette transduction du signal; iii) cet effet est principalement régulé par des neurones sensorimoteur, iv) qui peuvent induire la libération locale de facteurs neuroactifs. / Advances in the understanding of bone biology have identified the sensory nervous system as a critical regulator in the orchestration of bone formation, remodeling, and repair. However, the precise role of the sensory nervous system on bone tissue, particularly on osteoprogenitor cells, remains unknown. Firstly, we were interested in clarifying whether dorsal root ganglion (DRG) neurons would be able to induce the osteoblast differentiation by acting directly on mesenchymal stem cells (MSCs). Afterwards, we attempted to understand whether the canonical Wnt signaling pathway could be implicated in the DRG neurons-induced osteoblastogenesis. In the second part of this study, we aimed at better characterizing the subset of DRG neurons involved in the direct regulation of osteoblast differentiation from MSCs. In this work we provide several novel insights: i) we show that sensory neurons have a positive and direct effect on osteoblast differentiation of osteoprogenitor cells, ii) by activating the Wnt/β-catenin signaling pathway; and iii) we suggest that this effect is mainly regulated by sensorimotor neurons, iv) which possibly mediate the local release of neuroactive factors.

Le couple CXCL12/CXCR4 joue un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques (CSPHs) et constitue un axe clé par lequel les niches et les CSPHs communiquent au sein de la moelle osseuse (MO). Des mutations hétérozygotes du gène CXCR4, qui tronquent le domaine C-terminal de la protéine et entraînent un défaut de désensibilisation homologue de CXCR4 et une hypersensibilité à CXCL12, ont été identifiées dans le Syndrome WHIM (SW), une immunodéficience rare caractérisée notamment par une lymphopénie. Les mécanismes sous-jacents de cette anomalie restaient inconnus. Grâce à un modèle murin porteur d’une mutation gain de fonction de Cxcr4 identifiée chez certains patients et phénocopiant la lymphopénie du SW, nous avons exploré la possibilité qu’un défaut de domiciliation, de différenciation ou d’expansion des CSPHs dans la MO soit à l’origine de la lymphopénie circulante. Nous avons mis en évidence que la désensibilisation de Cxcr4 régule la balance quiescence/cycle des CSHs à court terme ainsi que leur différenciation en progéniteurs multipotents et progéniteurs engagés vers le lignage lymphoïde. Nos travaux révèlent donc que la désensibilisation de Cxcr4 est requise à la différenciation lymphoïde des CSPHs et suggèrent que l’absence de ce processus soit à l’origine de la lymphopénie observée chez les souris mutantes et, par extrapolation, chez les patients. Ces altérations lymphoïdes impliquaient à la fois des défauts intrinsèques (CSPHs) et extrinsèques (stroma), ce qui nous a conduit à considérer l’impact de la mutation gain de fonction de Cxcr4 sur le stroma médullaire. Dans ce contexte, l’objectif principal de mon projet de thèse a consisté à investiguer à l’aide du modèle murin du SW le rôle de la désensibilisation de Cxcr4 dans le maintien des composantes mésenchymateuses au sein de la MO. Nos données ont permis de mettre en lumière que la désensibilisation de Cxcr4 est intrinsèquement requise à la régulation de l’équilibre quiescence/cycle des cellules souches mésenchymateuses (CSMs), ainsi qu’à la préservation de leur potentiel ostéogénique en contrôlant l'expression et la biodisponibilité de Cxcl12 de manière autocrine. Par conséquent, nos travaux suggèrent que les actions autocrines et paracrines de l’axe de signalisation Cxcl12/Cxcr4 au sein des CSMs régulent leur différenciation en ostéoblastes tout en contribuant au maintien des niches des CSPHs et au processus d’hématopoïèse. / The CXCL12/CXCR4 signaling axis plays an essential role in the maintenance of hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) homeostasis and constitutes a key pathway through which the niches and HSPCs communicate in the bone marrow (BM). Heterozygous gain-of-function mutations of CXCR4, which engender a truncated receptor and affect its homologous desensitization in response to CXCL12, have been reported in the WHIM Syndrome (WS); a rare immunodeficiency notably characterized by lymphopenia. The mechanisms underpinning this remain obscure. Using a mouse model harboring a naturally occurring WS-linked Cxcr4 gain-of-function mutation, we explored the possibility that the lymphopenia in WS arise from defects at the HSPC level in the BM. We showed that Cxcr4 desensitization is required for proper quiescence/cycling balance of short-term HSCs as well as their differentiation into multipotent progenitors and downstream lymphoid-biased progenitors. Thus, our results suggest that efficient Cxcr4 desensitization is critical for lymphoid differentiation of HSPCs, and its impairment is a key mechanism underpinning the lymphopenia observed in WS mice. The role of Cxcr4 desensitization in regulating such lympho-hematopoiesis process implicated both intrinsic and extrinsic properties, thus raising the question of the impact of a gain-of-Cxcr4-function mutation on BM stroma. Therefore, the main part of my PhD project was dedicated to evaluate using this relevant knock-in model the impact of Cxcr4 desensitization on maintenance of BM mesenchymal elements. We have found unexpectedly that such regulatory mechanism is intrinsically required for regulating quiescence/cycling balance of mesenchymal stem cells (MSCs) and preserving their osteogenic potential through the control of Cxcl12 expression and availability in an autocrine manner. Therefore, these findings support autocrine and paracrine actions of the Cxcl12/Cxcr4 signaling axis within MSCs to regulate osteoblast differentiation while contributing to HSPC niches and hematopoiesis.

RÉSUMÉ en françaisLes systèmes de délivrance de médicaments sont fortement investigués dans le but d’obtenir la meilleure efficacité thérapeutique et la plus faible toxicité possible. De nombreux systèmes existent à l’heure actuelle qu’ils soient mécaniques ou chimiques. Dans ce travail, nous nous sommes tout d’abord intéressés à une nouvelle approche basée sur la macropinocytose pour augmenter l’internalisation d’agents thérapeutiques aussi bien dans des cellules cibles de médicaments que dans des cellules souches mésenchymateuses d’origine musculaire (mdMSCs) actuellement de plus en plus étudiées comme nouveaux systèmes de délivrance. La macropinocytose est en effet une voie d’endocytose clathrine-indépendante permettant l’internalisation non sélective de fluide extracellulaire. Ce processus semble contribuer à l’agressivité des cancers en favorisant leur apport en nutriments, le recyclage de la membrane plasmatique et de ses récepteurs ainsi que l’internalisation d’exosomes. La macropinocytose est déclenchée notamment par l’activation des récepteurs epidermal growth factor receptor (EGFR) et platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) qui sont des marqueurs connus d’agressivité des gliomes. Au cours de ce travail, nous nous sommes demandé si la macropinocytose ne pourrait pas être utilisée pour améliorer l’internalisation d’agents chimiothérapeutiques dans les cellules de glioblastomes. Nous avons tout d’abord montré que l’expression des acteurs clés de la macropinocytose au niveau de leur ARNm est fortement altérée en fonction du grade de la tumeur en utilisant des bases de données publiques d’échantillons de tumeurs gliales humaines. Une « signature » basée sur l’expression de 38 gènes liés à la macropinocytose permet la discrimination des échantillons de glioblastomes, c’est-à-dire des tumeurs les plus agressives. Nous avons ensuite comparé les effets induits par le MOMIPP et le Vacquinol-1, deux inducteurs connus de macropinocytose, à ceux de l’Honokiol qui induit également une vacuolisation sévère au sein de cellules de gliomes. Malgré de fortes similarités morphologiques, l’Honokiol se distingue par l’induction de vacuoles provenant à la fois d’endocytose mais aussi du réticulum endoplasmique. Chacun des trois composés induit néanmoins une nette augmentation de l’internalisation de dextrans de 10 kDa. Le marquage à l’acridine orange suggère pourtant des différences dans le devenir des vacuoles induites par ces trois molécules. Il a récemment été démontré que le MOMIPP agit en empêchant la maturation des macropinosomes ce qui concorde avec notre observation d’une fusion avec les lysosomes qui serait très limitée. Si les trois molécules permettent bien d’augmenter également la concentration de témozolomide (traitement de référence) au sein des cellules de gliomes, leur impact sur l’internalisation de la doxorubicine est plus faible. L’augmentation de l’internalisation des médicaments par l’induction de macropinocytose ne semble donc pas toujours efficace et pourrait dépendre de leurs propriétés physico-chimiques ainsi que de leur voie d’internalisation basale. Étant donné que l’induction soutenue de macropinocytose peut également déclencher la mort cellulaire tant de cellules de glioblastome chimio-sensibles que chimio-résistantes, nous proposons d’envisager la macropinocytose dans des approches combinées pour bénéficier d’une augmentation de l’internalisation de médicaments et d’effets additifs/ synergiques. Comme les cellules souches mésenchymateuses sont intensément étudiées pour leur utilisation en tant que transporteur de médicaments en plus de leur potentiel intrinsèque pour la médecine régénérative, les effets de ces inducteurs de vacuolisation ont également été étudiés sur des mdMSCs. Ces dernières sont caractérisées par un niveau basal de macropinocytose plus élevé que les modèles de gliomes utilisés et elles semblent mieux répondre au Vacquinol-1 qui permet d’ailleurs d’augmenter plus efficacement la concentration intracellulaire en doxorubicine que le MOMIPP, avec une internalisation environ 2 fois plus importante qu’en absence de stimulation. Ces cellules pouvant être utilisées comme véhicule pour le transport de molécules ayant une faible biodisponibilité afin d’améliorer leur usage en clinique, nous avons ensuite évalué l’impact du chargement de mdMSCs avec de la curcumine, un polyphénol naturel bien connu pour ses propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires dont le potentiel clinique reste limité notamment par sa faible solubilité. Pour cette raison, l’utilisation du NDS27, un complexe de lysinate de curcumine et d’hydroxy-propyl-bêta-cyclodextrine qui présente une bien meilleure solubilité dans l’eau, a été préférée. Nous avons observé que l’internalisation de la curcumine, provenant du NDS27, dans les mdMSCs est concentration-dépendante et non temps-dépendante. De plus, elle ne peut pas être augmentée par l’utilisation d’inducteurs de macropinocytose. De plus amples investigations des effets de l’internalisation de la curcumine à partir du NDS27 en fonction de la concentration sur leur viabilité, prolifération, propriétés mésenchymateuses et leur fonction mitochondriale nous ont permis de montrer qu’un chargement de 2 h avec 7 µM de NDS27 était acceptable en vue de préserver la possibilité de bénéficier des mdMSCs en tant qu’agent de thérapie cellulaire régénérative en sus de leur aspect de délivrance. L’investigation du potentiel thérapeutique de telles mdMSCs chargées en curcumine pour traiter l’arthrose chez le cheval est toujours en cours. / SUMMARYDrug delivery systems are highly investigated with the aim to promote the best therapeutic efficacy and the lowest possible toxicity. Nowadays, several systems either mechanical or chemical exist. In this work, we were first interested in studying a new approach based on macropinocytosis to increase the internalisation of therapeutic agents in both target cells of drugs and skeletal muscle-derived mesenchymal stem cells (mdMSCs) currently more and more studied as new deliverance systems. Macropinocytosis is indeed a clathrin-independent endocytosis pathway allowing the nonselective internalisation of extracellular fluid. This process seems to contribute to cancer aggressiveness by favouriting nutrient supply, recycling of plasma membrane and its receptors, and exosome internalisation. Macropinocytosis may notably be triggered by epidermal growth factor receptor (EGFR) and platelet-derived growth factor receptor (PDGFR), two well-known markers of glioma aggressiveness. During this work, we wondered whether macropinocytosis could be used to improve the internalisation of chemotherapeutic agents into glioblastoma cells. We first showed that the mRNA expression levels of key actors of macropinocytosis are strongly altered according to the grade of the tumour using public datasets of human glioma tumour samples. A “signature” based on the expression of 38 macropinocytosis-related gene allows the discrimination of the glioblastoma samples, i.e. the most aggressive tumours. We next compared the effects induced by MOMIPP and Vacquinol-1, two well-known macropinocytosis inducers to those of Honokiol which also induces a severe vacuolisation within glioma cells. Despite high phase-contrast morphological similarities, Honokiol appeared different from the others by the induction of vacuoles from both endocytosis and endoplasmic reticulum origins. Each of the three compounds nevertheless induces a marked increase in 10 kDa dextran internalisation. Acridine orange staining however suggested differences in the fate of vacuoles induced by those three molecules. MOMIPP has recently been shown to prevent the macropinosomes maturation which is consistent with our observation ofthe lack of acridine orange staining of the vacuoles that may be attributed to a limited fusion with lysosomes. Although each of the three compounds allows nevertheless a marked increase of temozolomide (i.e. first-line treatment) concentration into glioma cells, their impact on the internalisation of doxorubicin is poor. The increased internalisation of drugs by inducing macropinocytosis does not seem to be always efficient and could depend on their physicochemical properties and their basal way of internalisation. Considering that sustained macropinocytosis induction may also trigger cell death of both chemo-sensitive and chemo-resistant glioblastoma cells, we proposefor future perspectives to consider macropinocytosis in combination approaches to benefit from an increased drug uptake and additive/synergistic effects. As mesenchymal stromal / stem cells are increasingly studied for their use as drug-carrier in addition to their intrinsic potential for regenerative medicine, the effects of these vacuolisation inducers were also studied on mdMSCs. These lasts are characterised by a higher basal level of macropinocytosis than the glioma models used in this work. They seem to better respond to Vacquinol-1 which allows to increase more efficiently the intracellular concentration of doxorubicin than MOMIPP, with an uptake approximatively 2-fold higher than without stimulation. Given that these cells can be used as vehicle to transport molecules with a poor bioavailability in order to improve their clinical usage, we evaluated the impact of the loading of mdMSCs with curcumin, a natural polyphenol well-known for its antioxidant and anti-inflammatory properties whose clinical potential remains limited notably by reason of its poor solubility. Therefore, the use of NDS27, a complex of curcumin lysinate and hydroxypropyl-beta-cyclodextrin displaying an increased solubility in aqueous solution, was preferred. We observed that the uptake of curcumin from NDS27 into mdMSCs is concentration-dependent and not time-dependent. Moreover, it cannot be improve using macropinocytosis inducers. Further investigations of the effects of curcumin internalisation from NDS27 depending on the concentration used on their viability, proliferation, mesenchymal properties and their mitochondrial function allowed us to show that a loading of 2 h with NDS27 at 7 µM seems acceptable to preserve the possibility to benefit from mdMSCs as a cellular therapy agent in addition to the delivery aspect. The investigation of the double potential therapeutic benefits of such curcumin-loaded mdMSCs to treat osteoarthritis in horses is still ongoing. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L'attention de la communauté scientifique, ainsi que le développement, pour les bioprocédés dédiés à la culture et à l'expansion de cellules souches mésenchymateuses (MSCs) pour la thérapie cellulaire et la médecine régénérative a considérablement grandi pendant ces dernières décennies. Une plus ample compréhension du lien entre la structure, la fonction et les propriétés des suspensions de cellules mésenchymateuses est devenue de première importance. Dans cette thèse, nous présentons tout d'abord les résultats d'une étude expérimentale portant sur l'écoulement de suspensions concentrées de cellules vivantes d'origine mésenchymateuse pour une grande gamme de concentration cellulaire. Nous caractérisons l'évolution de la viscosité relative en fonction de la contrainte de cisaillement appliquée pour des fractions volumiques cellulaires allant de 20 à 60%. Ces matériaux ont des empreintes rhéologiques compliquées mais très reproductibles, incluant des comportements de fluide à seuil, rhéofluidifiants ainsi que des fractures liées à la contrainte de cisaillement. Les propriétés rhéologiques de la suspension sont ensuite étudiées avec l'addition d'acide hyaluronique (HA), une biomolécule avec des séquences d'adhésion pour des récepteurs à la surface des cellules étudiées. Nous montrons que l'addition d'acide hyaluronique modifie substantiellement le comportement de la suspension et nous permet de contrôler les propriétés d'écoulement de la suspension à toutes les fractions volumiques. Cytométrie de flux et imagerie confocal à l'appui, nous montrons que l'effet observé est dû à un important changement dans la formation d'agrégats cellulaires dans la suspension, et donc dans l'envergure du réseau correspondant. La troisième partie de cette thèse porte sur l'ajout de polyéthylène glycol, une molécule qui n'est pas naturellement présente dans l'organisme mais fréquemment utilisée dans la formulation d'hydrogel. En utilisant trois types de PEG, l'influence de la charge des molécules est étudiée. Les résultats montrent que la charge est un paramètre important dans le contrôle des propriétés d'écoulement de suspensions cellulaires, car déterminant dans la formation et la compacité des agrégats. En considérant les agrégats comme des objets fractals, nous montrons qu'en prenant en compte les modifications de fractions volumiques avec le cisaillement, nous pouvons obtenir une courbe maitresse pour l'ensemble des conditions testées, et en extraire la force d'adhésion moyenne entre les cellules, au travers une population de plusieurs millions de cellules. Cette étude livre de nouveaux aspects sur la complexité des propriétés en écoulement de suspensions de cellules méchymateuses, adhérentes et concentrées, sur leur sensibilité à l'ajout de molécules, qu'elles soient naturellement présentes dans les tissues ou non, ainsi qu'une nouvelle méthode pour mesurer la force d'adhésion entre les cellules.