Isolées à l'origine de la moelle osseuse , les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) ont depuis été obtenues à partir de divers tissus fœtaux, postnataux et adipeux et font l'objet d'un nombre croissant d'essais cliniques en tant que traitement potentiel d’un large éventail de maladies dégénératives et de troubles autoimmuns. En effet, les CSM se sont révélées comme étant une alternative de premier plan pour la réparation tissulaire et la modulation immunitaire. Des recherches intensives ont visé à élucider leurs caractéristiques et les mécanismes par lesquelles elles provoquent leurs effets thérapeutiques. Plus précisément, dans le cadre de la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) allogéniques chez des patients pédiatriques atteints de leucémie, les CSM ont été utilisées pour favoriser la greffe et/ou pour induire une immunosuppression dans la maladie du greffon contre l’hôte (GVH), une complication fréquente et mortelle de la greffe pour laquelle il n’y a que très peu à offrir aux patients qui en sont touchés. En effet, la première indication thérapeutique d’un produit à base de CSM approuvée par Santé Canada a été indiquée pour la gestion de la GVH chez des patients pédiatriques ayant une maladie résistante aux traitements de première intention. Traduire la recherche fondamentale en applications cliniques nécessite un approvisionnement régulier en CSM viables et préalablement évaluées quant à leur sécurité et leurs propriétés fonctionnelles. La cryopréservation des CSM est l’élément clé qui permet de répondre à ces exigences. Suivant l'exemple des CSH, qui ont été cryoconservées et transplantées avec succès ultérieurement, les CSM ont donc été entreposées et décongelées selon les besoins des études cliniques de phase III pour le traitement de la GVH réfractaire aux traitements classiques. Ces études ayant obtenu des résultats mitigés et contrastants avec les résultats obtenus à partir de cellules fraîches dans des études cliniques de phases I et II, la cryopréservation a rapidement été reconnue coupable de leur échec. Une quantité remarquable de recherches et de ressources ont ensuite été consacrées à l'optimisation des protocoles, à la composition des milieux de congélation, aux dispositifs de refroidissement et aux conteneurs de stockage, ainsi qu'au développement de bonnes pratiques de fabrication afin de garantir que les CSM conservent leurs caractéristiques thérapeutiques après la cryoconservation et qu’elles soient sécuritaires pour une utilisation clinique. L’objectif principal de cette thèse était de clarifier l’impact de la cryopréservation sur les propriétés immunosuppressives des CSM. Alors que les études publiées sur le sujet faisaient, d’une façon assez équilibrée, l’état d’une réussite ou d’un échec à la cryopréservation des CSM en lien avec la conservation de leurs différentes fonctions in vitro et/ou in vivo dans des modèles animaux, mes travaux ont permis de revisiter l'impact de la cryoconservation sur les CSM en démontrant que des épisodes de réchauffement cellulaire survenant après leur congélation, plutôt que la cryoconservation en elle-même, étaient responsables de leurs altérations fonctionnelles. Si des précautions ne sont pas prises pour éviter le réchauffement des échantillons lors du processus d’entreposage dans l’azote liquide, ceux-ci vont subir une iii importante variation de température et ce, de façon étonnamment rapide et dommageable. Mes travaux ont démontré que l’inhibition de la prolifération lymphocytaire par les CSM diminuait drastiquement et de façon proportionnelle au réchauffement subi par les CSM pendant l’entreposage des produits cellulaires. Étonnamment, la viabilité des CSM n’était pas significativement diminuée par ces variations de température alors qu’elle est depuis toujours la principale mesure utilisée pour quantifier l’intégrité cellulaire postdécongélation. Dans une perspective de pouvoir prédire la présence d’une atteinte fonctionnelle des CSM induite par la cryopréservation, la suite de mes travaux a permis d’identifier la capacité d’adhésion des CSM comme étant un marqueur rapidement et facilement mesurable en laboratoire, mais surtout étant significativement liée à la capacité des CSM à inhiber une réponse lymphocytaire, laquelle est au cœur des symptômes de la GVH. Une grande rigueur pendant tout le processus de fabrication et de congélation des CSM ainsi que la génération de données reproductibles et fiables sont indispensables à l’obtention de preuves scientifiques de l'efficacité et de la qualité de cette thérapie cellulaire à grand potentiel dans le traitement des maladies auto-immunes. / Originally isolated from the bone marrow, mesenchymal stromal cells (MSC) have since been obtained from various foetal, postnatal and adipose tissues and are the subject of an increasing number of clinical trials as a potential treatment for a wide range of degenerative diseases and autoimmune disorders. Indeed, MSC have proven to be a leading alternative for tissue repair and immune modulation. Intensive research has aimed to elucidate their characteristics and the mechanisms by which they induce therapeutic effects. More specifically, in the context of transplantation of allogeneic hematopoietic stem cells (HSC) in pediatric patients with leukemia, MSC have been used to promote transplantation and/or to induce immunosuppression in graft-versus-host disease (GVH), a frequent and fatal complication of transplantation for which there is very little to offer to patients who are affected. The first therapeutic indication for a MSC-based product approved by Health Canada was indicated for the management of GVH in pediatric patients with a resistant to first-line treatments disease. Translating basic research into clinical applications requires a regular supply of viable MSC that have been previously assessed for their safety and functional properties. Cryopreservation of MSC is the key to meeting these requirements. Following the example of HSC, which were cryopreserved and successfully transplanted later, MSC were therefore stored and thawed as needed in phase III clinical studies for the treatment of GVH refractory to conventional treatments. These studies having obtained mixed results and contrasting with the results obtained from fresh cells in clinical studies of phases I and II, cryopreservation was quickly found guilty of their failure. A remarkable amount of researches and resources were then devoted to the optimization of protocols, the composition of freezing media, cooling devices and storage containers, as well as the development of good manufacturing practices in order to guarantee that MSC retain their therapeutic characteristics after cryopreservation and that they are safe for clinical use. The main objective of this thesis was to clarify the impact of cryopreservation on the immunosuppressive properties of MSC. While the studies published on the subject made, in a fairly balanced way, the state of a success or a failure in cryopreservation of MSC in connection with the conservation of their different functions in vitro and/or in vivo in animal models, results presented in this thesis have allowed us to revisit the impact of cryopreservation on MSC by demonstrating that episodes of cell warming occurring after their freezing, rather than cryopreservation itself, were responsible for their functional alterations. If precautions are not taken to prevent the samples from heating up during the liquid nitrogen storage process, they will undergo a significant temperature variation, surprisingly quickly and very damagingly. My work has shown that the inhibition of lymphocyte proliferation by MSC decreases drastically and in proportion to the warming experienced by MSC during storage of cellular products. Surprisingly, the viability of MSC was not significantly reduced by these temperature variations, whereas it has always been the main measure used to quantify post-thaw cell integrity. In a perspective of being able to predict v the presence of a functional impairment of MSC induced by cryopreservation, the rest of my work then made it possible to identify the adhesion capacity of MSC as being a marker quickly and easily assessable in the laboratory, but especially being significantly linked to the ability of MSC to inhibit a lymphocyte response, which is at the heart of GVH symptoms. Great rigor throughout the manufacturing and freezing process of MSC as well as the generation of reproducible and reliable data are essential to obtain scientific evidences of the efficacy and quality of this cell therapy with very high potential in the treatment of autoimmune diseases

Le cheval athlète est exposé à des lésions dégénératives ou traumatiques du cartilage prédisposant au développement de l’arthrose. Les arthropathies associées à une dégradation du cartilage se traduisent par une perte de fonctionnalité de l’articulation. Le cartilage ne possédant que de très faibles capacités de réparation intrinsèque, le développement de traitements de ces affections représente un enjeu thérapeutique. Le premier objectif de notre étude était la mise au point d’un substitut cartilagineux utilisant des cellules souches mésenchymateuses (CSMs) du sang de cordon ombilical (SCO). Après avoir été isolées et caractérisées, les CSMs de SCO ont été différenciées en chondrocytes au sein d’un biomatériau, en présence de facteurs de croissance (BMP-2 et TGF-β1 ou TGF-β3), en normoxie ou en hypoxie. L’utilisation de la BMP-2 et du TGF-β1 en normoxie permet une synthèse abondante des protéines caractéristiques de la matrice extracellulaire du cartilage avec néanmoins une expression persistante du collagène de type I, marqueur du fibrocartilage. La stratégie d’interférence par l’ARN ciblant Col1a2 permet de stabiliser le phénotype cellulaire obtenu au niveau transcriptionnel. Le deuxième objectif de notre étude était l’utilisation des CSMs de SCO indifférenciées lors d’injection intra-articulaire chez le cheval. La tolérance des CSMs allogéniques in vivo a été démontrée, ce qui n’a pu être le cas pour leur efficacité dans un modèle d’arthropathie induite expérimentalement. Ainsi, les CSMs de SCO constituent une source intéressante pour l’ingénierie tissulaire du cartilage mais leur utilisation thérapeutique sous forme indifférenciée doit être optimisée et validée. / The racehorse is exposed to degenerative or traumatic lesions of cartilage predisposing to the development of osteoarthritis. Arthropathies associated with cartilage degradation result in loss of joint functionality. The cartilage has only a very low intrinsic repair capacity ; that is why the development of new treatment represents a therapeutic challenge. The first objective of our study was to develop a cartilage substitute using mesenchymal stem cells (MSCs) from umbilical cord blood (UCB). After having been isolated and characterized, the MSCs of UCB were differentiated into chondrocytes in a biomaterial in the presence of growth factors such as BMP-2 and TGF-β1 or TGF-β3, in normoxia or in hypoxia. The use of BMP-2 and TGF-β1 in normoxia leads to an abundant synthesis of extracellular matrix proteins characteristic of hyaline cartilage but with persistent expression of type I collagen, a fibrocartilage marker. siRNAs targeting Col1a2 stabilize the cellular phenotype obtained at transcriptional level. The second aim of our study was the use of undifferentiated MSCs of UCB for intra-articular injection in horses. The tolerance of allogeneic MSCs was demonstrated in vivo, but not for now their efficacity in a model of joint arthropathy.Thus, the MSCs of UCB is a source of interest for tissue cartilage engineering but their therapeutic use in undifferentiated form must be optimized and validated.

Il est maintenant établi que les cellules souches mésenchymateuses (MSC), résident dans la même niche que les cellules souches hématopoïétiques (HSC), au sein de la moelle osseuse (MO). Il est connu que la pression en O2 (pO2) de la niche est inférieure à la normale, soit moins de 5% pO2 contre 12-15 % pO2 dans le sang artériel. Cette hypoxie a des conséquences sur le métabolisme, en protégeant les cellules contre le stress oxydatif et en favorisant leur caractère multipotent. Notre hypothèse est que les MSC cultivées en hypoxie devraient être plus proches de leur condition physiologique, donc plus multipotentes. Des MSC de la MO humaine ont été cultivées en pO2 de 21% et 5%. Leur morphologie, capacité de différenciation en ostéocytes et adipocytes, et transcriptome ont été comparés à différents passages. Nous avons observé un ralentissement de la prolifération à des temps précoces à pO2 5%, caractérisée par une inhibition de l'expression de gènes impliqués dans la réplication et le cycle cellulaire, puis une augmentation à des passages tardifs. Les gènes codant pour des molécules d'adhérence et de la matrice extracellulaire sont stimulés par l'hypoxie. A des temps tardifs, la capacité de différenciation des MSC est stimulée en hypoxie, les cellules présentent un aspect plus immature et une diminution de synthèse des mitochondries. Surtout, l'hypoxie stimule la synthèse de « gènes de la plasticité » suivant le logiciel « Gene Ontology », et de gènes impliqués dans le développement épithélial et neuronal. En conclusion, la culture des MSC de MO en hypoxie semble plus physiologique et pourrait être utile pour des applications en médecine régénératrice / It is now settled that mesenchymal stem cells (MSC), reside in the same microenvironment or niche than hematopoietic stem cells (HSC), within the bone marrow (BM). It is also known that the O2 tension (pO2) of the niche is below 5% as compared to 21% O2 in the air and 12-15% in the arterial blood. As developed in our recent review, this physiological hypoxia protects stem cells from oxidative stress and maintains their multipotential state. Our hypothesis is that MSC cultured in hypoxia should be closer to their physiological condition and therefore more "multipotent". MSC from human BM were cultured et 21% and at 5% pO2. Their morphology, their ability to differentiate into osteocytes and adipocytes, and their transcriptome were compared at different passages. We observed a decrease of proliferation rate in early times in hypoxia, characterized by inhibition of the expression of genes involved in cell replication and cell cycle, and an increase in later passages. Whatever the passage, the genes encoding adhesion molecules and extracellular matrix are stimulated by hypoxia. At later times, the ability of MSC differentiation is stimulated by hypoxia, the cells look to be more immature and show decreased synthesis of mitochondria. Indeed, hypoxia stimulates the synthesis of plasticity genes according to "Gene Ontology" (GO) terms, and of several genes involved in neuronal- and epithelial-cell development. In conclusion, the culture of MSC from BM in hypoxia seems to be more physiological and may be useful for regenerative medicine applications.

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Titre de l'écran-titre (visionné le 23 novembre 2023) / 5 vidéos en format mp4. MovieS1: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics formed on a typical MRC-5 cell adhering ; Movie S2A: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics in MRC-5, Untreated MRC-5 cell adhering ; MovieS2B: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics in MRC-5, MRC-5 cell adhering in presence of 50 μg mL-1 of cycloheximide ; MovieS3A: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics in HeLa, Untreated HeLa cell adhering ; MovieS3B: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics in HeLa, HeLa cell adhering in presence of 50 μg mL-1 of cycloheximide ; MovieS4: Time-lapse cell imaging of SIC inhibition and increased spreading of newly adhering MRC-5 cell treated with Y27632 (ROCK inhibitor). / La majorité des cancers proviennent du tissu épithélial. Lors de l'évolution d'une tumeur, les cellules cancéreuses épithéliales subissent une transition épithéliale à mésenchymateuse afin d'amorcer la progression tumorale. La migration et l'adhésion cellulaire sont des processus biologiques essentiels à l'établissement de métastases, qui sont la principale cause de décès associés au cancer. Ainsi, cibler l'un ou l'autre de ces processus et affecter la progression tumorale pourrait potentiellement améliorer le pronostic. Mon projet de doctorat s'est donc penché sur les mécanismes de régulation de l'initiation de l'adhésion spécifiques aux cellules ayant subi une transition épithéliale-mésenchymateuse. L'étude de l'initiation de l'adhésion a mis en lumière une structure impliquée dans la maturation des adhésions focales, les spreading initiation centers (SICs). Les SICs se situent au-dessus de futurs sites de formation d'adhésions focales et sont composés de complexes ribonucléoprotéiques confinés sous une gaine d'actine. Parmi les protéines faisant partie des SICs, on retrouve plusieurs protéines impliquées dans l'adhésion, mais également plusieurs protéines de liaison à l'ARN (RBPs). Nous avons montré que les RBPs ainsi que les ARNm sont présents de façon enrichie dans les SICs, suggérant une traduction localisée. En effet, l'inhibition de la traduction freine l'adhésion spécifiquement chez les cellules de types mésenchymateuses et les cellules ayant subi une transition épithéliale à mésenchymateuse. Nous avons mis en lumière une régulation spatiotemporelle de la traduction, spécifique aux cellules mésenchymateuses. Au fil de l'adhésion, la machinerie traductionnelle est tout d'abord inhibée puis stimulée. Cette régulation spatiotemporelle permet une reprogrammation de la traduction vers une traduction localisée et spécifique de protéines impliquées dans la formation des adhésions focales. Nous avons montré que la régulation temporelle de la traduction est assurée par la phosphorylation de la sous-unité alpha de l'EIF2. L'inhibition de la traduction est donc un moyen direct d'étudier les différences dans l'initiation de l'adhésion entre les cellules épithéliales et les cellules ayant subi une transition épithéliale à mésenchymateuse lors de la progression tumorale. / Most cancers originate in epithelial tissue. Epithelial cancer cells then undergo an epithelial to mesenchymal transition to initiate tumor progression. Cell migration and adhesion are essential biological processes for metastasis formation. Metastases are the leading cause of cancer-associated deaths, so targeting any of these processes would greatly affect tumor progression, which could lead to a better prognosis. My doctoral project therefore centered on the mechanisms of regulation of adhesion initiation specific to cells that have undergone an epithelial to mesenchymal transition. The study of adhesion initiation has highlighted a structure involved in the maturation of focal adhesions called spreading initiation center (SIC). This structure has been shown to localize above the formation sites of focal adhesions and to be composed of ribonucleoprotein complexes confined under an actin sheath. Among the proteins identified as part of the SICs are several proteins involved in adhesion and several RNA binding proteins. We have shown that RNA binding proteins and mRNA are enriched within SICs, suggesting the presence of translational activity. We subsequently confirmed an enrichment in translation in the SICs during the initial phase of adhesion. Indeed, inhibiting translation only inhibits cellular adhesion in mesenchymal cells and in epithelial cells having undergone an epithelial to mesenchymal transition. By further studying the translation dynamics during adhesion, we have highlighted a spatiotemporal regulation specific to mesenchymal cells. The translational machinery is first inhibited, after which there is an upsurge in translation. This spatiotemporal regulation allows a reprogramming of the translatome, inducing the specific translation of proteins involved in the formation of focal adhesions. We have shown that the temporal regulation of translation is regulated by the phosphorylation of the alpha subunit of eIF2. The initiation of translation is therefore an interesting target to study the differences between the adhesion initiation of epithelial cells and that of cells having undergone an epithelial to mesenchymal transition during tumor progression.

La réparation des défauts osseux de taille importante (fracture, tumeur, nécrose de l'os) pour lesquelles une partie de l'os est manquante et doit être remplacée, demeure un défi important pour le domaine médical. Des matériaux synthétiques, comme des matériaux céramiques, métalliques, et polymères, sont ainsi développés comme substituts osseux. Mais ces matériaux n'interagissent pas suffisamment avec l'os du patient et finissent par être encapsulés par une couche de tissu fibreux, ce qui peut résulter en une fracture de l'os, de l'implant, ou de l'interface entre les deux. La recherche vise donc à étudier et comprendre les interactions entre les cellules et les matériaux, afin de développer des matériaux capables d'interagir avec les cellules, et de mettre au point des implants combinant un matériau bioactif, des cellules, et des facteurs bioactifs permettant la reconstruction du tissu osseux. Dans ce contexte, les cellules souches mésenchymateuses (MSCs) ont gagné en popularité en médecine régénératrice compte tenu de leur capacité d'auto-renouvellement, leur multipotence, et leur taux de prolifération élevé. Cependant, une fois extraites du patient et cultivées in vitro, les MSCs ont tendance à se différencier de manière aléatoire, ce qui conduit à une population hétérogène de cellules avec laquelle il est difficile de reconstruire un tissu. Bien que les MSCs soient utilisées en clinique pour le traitement de diverses pathologies, une meilleure compréhension de leur comportement reste nécessaire pour permettre de contrôler leur différenciation vers une lignée spécifique et ainsi améliorer leurs performances en clinique. Les hydrogels ont émergé comme matériaux prometteurs pour la culture cellulaire puisqu'ils permettent de mimer la matrice extracellulaire naturelle des cellules. Notamment, de nombreuses études ont évalué l'impact de la rigidité des hydrogels sur la différenciation des MSCs et ont montré qu'une rigidité proche de celle d'un tissu naturel favorise la différenciation vers les cellules de ce tissu. Cependant, il est maintenant reconnu que les hydrogels et les tissus naturels ne sont pas caractérisés uniquement par leur rigidité, mais aussi par leur viscoélasticité. Or peu d'études ont été menées sur l'impact des propriétés viscoélastiques des hydrogels sur la différenciation des MSCs (15 articles sur les cinq dernières années via PubMed). Dans ce projet, il a été montré qu'il était possible de synthétiser des hydrogels de poly(acrylamide-co-acide acrylique) avec une rigidité et une viscoélasticité contrôlées, mesurées par compression et par AFM. Cinq hydrogels ont été choisis pour étudier l'impact des propriétés mécaniques sur la différenciation ostéogénique des MSCs en variant la rigidité et le pourcentage de relaxation : 15 kPa-15%, 60 kPa-15%, 140 kPa-15%, 100 kPa-30%, et 140 kPa-70%. Il a été montré que la fonctionnalisation de surface de ces hydrogels avec un peptide mimétique de la protéine BMP-2 a mené à une forme cellulaire étoilée après deux semaines de différenciation, sauf pour la rigidité la plus basse (15 kPa). Cette forme cellulaire étoilée correspondrait à une forme d'ostéocyte, qui est le dernier stade de différenciation ostéogénique des MSCs, et qui n'a jamais été obtenu in vitro à notre connaissance. De plus, une rigidité de 60 kPa a mené à une plus forte expression de marqueurs de différenciation ostéocytaires par rapport à des rigidités de 15 et 140 kPa, pour une même relaxation de 15%. Enfin, la plus forte expression de marqueurs de différenciation d'ostéoblastes et d'ostéocytes a été observée pour l'hydrogel présentant 70% de relaxation et une rigidité de 140 kPa. Ceci semble montrer qu'une viscoélasticité élevée favorise la différenciation ostéogénique des MSCs, même si elle est associée à une rigidité qui n'est pas la plus favorable. Ainsi, les propriétés viscoélastiques de la matrice auraient un impact non négligeable sur la différenciation des MSCs et devraient être considérées à l'avenir. / The repair of large bone defects, including large fracture, tumor, and necrosis for which a part of the bone is missing and has to be replaced, is still a challenge for the medical field. Synthetic materials, such as ceramic, metallic, and polymeric materials, have been developed as bone substitutes. However, these materials do not interact with the bone of the patient and generally end up being encapsulated by a layer of fibrous tissue, that might result in the fracture of the bone, the implant, or the interface between the two. The research therefore aims at studying and understanding cell-material interactions in order to develop materials capable of interacting with cells, and to create new implants combining a carrier material, cells, and bioactive factors, allowing bone reconstruction. In this context, mesenchymal stem cells (MSCs) have gained high interest in regenerative medicine considering their self-renewal ability, multipotency, and high proliferative rate. However, once extracted from the patient and cultivated in vitro, MSCs tend to differentiate randomly, which leads to a heterogeneous population of cells with which it is difficult to reconstruct any tissue. Therefore, although MSCs are used in clinics for the treatment of various pathologies, a better understanding of their biological behavior is still required to provide the ability to control their in vitro differentiation into a specific lineage and improve their clinical performance. Hydrogels have emerged as promising materials for cell culture as they allow to mimic the natural extracellular matrix of cells. Particularly, many studies have evaluated the impact of hydrogels stiffness on MSCs differentiation and showed that a stiffness close to that of a biological tissue leads to a differentiation towards cells of this tissue. Nevertheless, it is now recognized that hydrogels as well as biological tissues are not only described by their stiffness, but also by their viscoelastic properties. However, only few studies have been conducted on the impact of hydrogels viscoelastic properties on MSCs differentiation (15 articles over the past five years from PubMed). In this project, it has been shown that it was possible to synthesize poly(acrylamide-co- acrylic acid) hydrogels with different controlled stiffness and viscoelasticity, evaluated using compression and AFM. Five hydrogels have been chosen to study the impact of hydrogels mechanical properties on MSCs osteogenic differentiation by varying the stiffness and the relaxation percent : 15 kPa-15%, 60 kPa-15%, 140 kPa-15%, 100 kPa-30%, and 140 kPa- 70%. It has been shown that the surface functionalization of these hydrogels with a mimetic peptide of the BMP-2 protein led to star-like cells, except for the lowest stiffness (15 kPa). This star-like shape would correspond to the shape of osteocytes, which is the last stage of osteogenic differentiation, and which has never been obtained in vitro to our knowledge. Moreover, a stiffness of 60 kPa led to a higher expression of osteocyte markers as compared to stiffnesses of 15 and 140 kPa, for a constant low relaxation of 15%. Finally, the strongest expression of osteoblast and osteocyte differentiation markers has been observed for the hydrogel with a high relaxation of 70% and a stiffness of 140 kPa. This shows that a high viscoelasticity would favor MSCs osteogenic differentiation, even if it is associated with a stiffness that is not the most favorable. Thus, the viscoelastic properties of the matrix would have a significant impact on MSCs differentiation and should be considered in the future.

L’infection par Helicobacter pylori touche environ la moitié de la population mondiale et est responsable de plusieurs pathologies gastrointestinales incluant l’adénocarcinome gastrique. Le développement récent d’un modèle d’étude chez l’animal a permis d’identifier la nature des cellules à l’origine de la transformation cancéreuse en réponse à l’infection chronique par Hélicobacter. Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (MSC) seraient recrutées au niveau de la muqueuse gastrique afin de reconstituer, par un mécanisme de différenciation épithéliale, les glandes lésées par l’infection. L’adénocarcinome gastrique se développerait à partir des glandes reconstituées par les MSC. Les objectifs de ces travaux ont été d’analyser, in vitro par une approche séquentielle, les différentes étapes responsables de l’initiation tumorale incluant le recrutement des MSC au niveau gastrique, leur différenciation en cellules épithéliales et leur transformation tumorale lors de l’infection par H. pylori. Ces travaux ont tout d’abord démontré que les cellules épithéliales infectées par H. pylori peuvent recruter les MSC après sécrétion de certaines chimiokines. Nous avons ensuite montré que les MSC sont capables de fusionner avec les cellules épithéliales gastriques aboutissant à l’obtention de cellules épithéliales dérivées des MSC. Finalement, les interactions entre H. pylori et les MSC ont été étudiées et ont fourni des premiers éléments de compréhension des mécanismes de l’initiation tumorale. Nos résultats permettent de mieux comprendre le mécanisme physiopathologique de l’adénocarcinome gastrique et seront utiles à la compréhension d’autres cancers dans lesquels le rôle des MSC comme cellules initiatrices de tumeur est suggéré. / Helicobacter pylori infection is found in about half of the world population and can induce several gastrointestinal pathologies including gastric adenocarcinoma. An animal model recently led to the hypothesis of a cellular origin for the cancer initiating cells after Helicobacter infection. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) are believed to be recruited in the gastric mucosa in order to repair the damages due to infection, by an epithelial differentiation. Gastric carcinoma may rise from MSC reconstituted gastric glands. This study aimed to analyze, by sequential in vitro approaches, the different steps allowing tumor initiation including MSC recruitment by infected epithelial cells, epithelial differentiation of MSC, and cancer marker appearance after H. pylori infection. We first demonstrated that H. pylori infected epithelial cells may recruit MSC by a secretion of cytokines. We then showed that MSC fuse with gastric epithelial cells leading to MSC-derived epithelial cells. Finally, we studied the interaction between H. pylori and epithelial cells providing a preliminary explanation for cancer initiation. Our results allow a better understanding of gastric adenocarcinoma pathophysiology and will be helpful for the understanding of other cancers in which the role of MSC as cancer initiating cells is suspected.

Le myélome multiple (MM) est une hémopathie maligne de la lignée B qui se manifeste par <p>une accumulation de plasmocytes monoclonaux dans la moelle osseuse. Le MM se caractérise par <p>la nature inéluctable de ses rechutes de plus en plus réfractaires au traitement. Au sein de la moelle <p>osseuse, les cellules malignes interagissent avec leur microenvironnement notamment composé de <p>cellules stromales mésenchymateuses (CSM). Les CSM apportent un soutien aux cellules <p>plasmocytaires (PC) malignes via des interactions cellulaires directes (VLA-4, VCAM-1, CD44,…) <p>ou par la production de cytokines (IL-6, SDF1, VEGF,…). De ces interactions résulte l’apparition <p>d’altérations constitutives au sein des MM-CSM telles qu’une production réduite de dépôts de <p>calcium et une augmentation de la sécrétion de nombreux facteurs (IL-6, GDF-15, etc.). <p>L’objectif de ce travail est de mieux caractériser les anomalies constitutives (génomiques, <p>prolifératives, immunomodulatrices, etc.) des MM-CSM et d'évaluer l’impact des traitements reçus <p>par les patients sur ces anomalies. Ces analyses permettront de mieux définir le rôle des CSM dans <p>la physiopathologie et la progression de la maladie afin de mettre en évidence d’éventuelles cibles <p>thérapeutiques.<p>Compte tenu de l’altération de nombreux acteurs du cycle cellulaire mise en évidence par <p>notre analyse du profil d’expression génique des MM-CSM après comparaison avec celui des CSM <p>de donneurs sains (DS-CSM), nous avons décidé d’étudier leurs capacités prolifératives. Nos <p>observations démontrent que a) les MM-CSM sont caractérisées par une réduction de leur <p>clonogénicité et par un temps de doublement plus important par rapport aux DS-CSM b) l’entrée <p>précoce des MM-CSM en sénescence est confirmée par l'augmentation drastique du nombre de <p>cellules exprimant la « senescence-associated β-galactosidase », par l’augmentation de la taille <p>cellulaire, par l’expression spécifique de membres du « senescence-associated secretory profile » <p>(SASP) et par la surexpression de TP53 et TP21, deux facteurs importants du cycle cellulaire et de <p>la sénescence c) l’ostéoblastogenèse des MM-CSM est altérée en raison de ce processus de <p>sénescence, à savoir, une réduction de la production de calcium et une hausse précoce de l’activité<p>de la phosphatase alcaline des MM-CSM par rapport aux DS-CSM d) l’activité de support à <p>l’hématopoïèse des MM-CSM est augmentée (« increased Blast-Colony Forming Cells and LongTerm Culture Initiating Cells »). <p>Dans la seconde partie de ce travail, on s’est intéressée plus particulièrement aux capacités <p>immunomodulatrices des MM-CSM. Nous avons observé, par réaction mixte lymphocytaire et <p>stimulation mitogénique (PHA/IL-2), a) une réduction de l’inhibition de la prolifération des <p>lymphocytes T activés en présence de MM-CSM par rapport aux DS-CSM b) une inversion du ratio <p>Th17/Treg lorsque des lymphocytes T activés sont cultivés en présence de MM-CSM par rapport <p>aux DS-CSM ;les mécanismes potentiellement impliqués dans ces altérations ont été investigués c)<p>les MM-CSM présentaient une expression anormale du CD40/40L, VCAM1, ICAM-1, LFA-3 <p>HLA-DR et HLA-ABC et des taux d’IL-6 et d’IL-10 altérés ont été mesuré dans le milieu de <p>culture lorsque les lymphocytes T activés étaient cultivés en présence de MM-CSM par rapport aux <p>DS-CSM. <p>Nos résultats suggèrent que les MM-CSM entrent précocement en sénescence avec de <p>profondes altérations de leurs propriétés biologiques et notamment leur capacités <p>d'immunomodulation et de différenciation ostéogénique. Nous concluons que l’entrée en <p>sénescence des MM-CSM pourrait être à l’origine d’une altération du microenvironnement tumoral <p>qui favoriserait rechutes et résistances aux traitements. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Dans cette thèse, nous avons combiné les approches des cultures single-cell, de cytométrie en flux,des analyses de métabolisme énergétique et de génétique moléculaire afin d’explorer les effets del’Acétate d’α-Tocopherol (α-TOA) sur les cellules stromales mésenchymateuses (MStroC) et leurs souspopulations fonctionnelles (cellules souches et progénitrices mésenchymateuses). L’autre but était de tester une molécule de miR-210 par rapport à son utilisation potentielle comme « hypoxia mimicking molecule ». Après avoir démontré l’hétérogénéité de la population MStroC et conclu que la population de premier passage est appropriée pour des expérimentations ultérieures, nous avons trouvé que l’α-TOA présentait un effet positif sur le maintien de la capacité proliférative élevée des cellules souches mésenchymateuses. Cet effet est accompagné d’une atténuation de l’activité de la chaîne de transport d’électrons (ETC) qui pourrait d’autre part expliquer l’accroissement modéré du niveau des Reactive Oxygen Species mitochondriales (mtROS) que nous avons détectées. L’augmentation du niveau de mtROS pourrait être associée à une dégradation de protéine HIF-1 dans la population MStroC exposée à l’α-TOA. Bien que nous n’ayons pas détecté d’augmentation compensatoire de la glycolyse, les phénomènes observés représentent en partie la réponse cellulaire complexe au faible niveau d’O2. Il a été établi que ce phénomène était relié au maintien de primitivité des cellules souches. Le mécanisme exact reste à clarifier ainsi que son potentiel translationnel. En outre, nous avons apporté la preuve que miR-210 fait partie intégrante de la réponse des MStroC à la faible concentration en O2. Dans cette étude, nous avons montré que l’augmentation de l’expression de miR-210 sur une période courte (jusqu’à 24 heures) et après une période étendue (jusqu’à 72 heures) d’exposition des MStroC à une faible concentration en O2. De plus, nous avons prouvé que ce micro ARN pouvait être régulé par les deux facteurs transcriptionnels HIF-1 et HIF-2, nous laissant penser que ceci faisait partie intégrante de la réponse des MStroC à une faible concentration en O2. Jusqu’à présent, nos données suggèrent que miR-210 est digne d’intérêt en tant que bonne molécule « hypoxia mimicking ». / In this thesis, we combined approaches of single-cell cultures, flow-cytometry, energetic metabolismanalysis and molecular genetics in order to get insight in the effects of α-Tocopherol-Acetate (α-TOA)on Mesenchymal Stromal Cells (MStroC) and their functional subpopulations (mesenchymal stem and progenitor cells). The other aim was to test a miR-210 molecule with respect to its potential use as hypoxia mimicking molecule. After defining MStroC population heterogeneity and concluding that the first passage population is convenient for further experiments, we demonstrated that α-TOA exhibits a positive effect on the maintenance of high proliferative capacity of mesenchymal stem cells. This effect could be associated with an attenuation of electron transport chain (ETC) activity, which, on the other hand could explain moderate increase in the level of mitochondrial Reactive Oxygen Species (mtROS) we detected. The increase in mtROS level could be associated with a decreased HIF-1 alpha protein degradation in MStroC exposed to α-TOA. Although we did not detect a compensatory increase in glycolysis, the observed phenomena depict part of a complex cellular response to the low O2 that is demonstrated to be related with maintenance of stem cell primitiveness. The exact mechanism remains to be elucidated as well as its translational potential. In addition, we provided new evidences that miR-210 is integral part in MStroC response to low O2. In the study, we showed increased in miR-210 expression in a short-term (up to 24 hours) and after extended (up to 72 hours) MStroC exposed to low O2. Moreover, we demonstrated that this micro- RNA could be regulated by both HIF-1 and HIF-2 transcriptional factors, suggesting it as integral part of MStroC response to low O2. So far, our data suggest that miR-210 is worthy to be considered as good hypoxia mimicking molecule.

Ce travail de thèse a pour objectif le développement d‘un nouvel outil thérapeutique des tumeurs cérébrales en utilisant le tropisme tumoral des cellules stromales mésenchymateuses (CSMs) pour véhiculer et distribuer des nanoparticules (NPs) chargées en principe actif. Une sous-population de CSMs humaines extraites à partir de la moelle osseuse de la crête iliaque de patients, les cellules MIAMI (« Marrow-Isolated Adult Multilineage Inducible‖) et deux types de NPs [NPs polymériques et nanocapsules lipides (NCLs)] ont été utilisés pour montrer la preuve de concept de cet outil thérapeutique. Nous avons montré que les cellules MIAMI incorporent efficacement ces deux types de NPs sans modification de leur potentiel souche. De plus, ces cellules sont capables de véhiculer et de distribuer les NPs in vivo au sein d‘une tumeur cérébrale. La toxicité de ce nouvel outil a été validée in vitro et in vivo dans le modèle du gliome humain U87MG en utilisant des cellules MIAMI chargées en NCLs de ferrociphenol. La sureté de l‘utilisation des cellules MIAMI, en tant que vecteurs cellulaires, a également été étudiée. Nous avons montré que les cellules MIAMI n‘étaient pas capables de se transformer in vitro et in vivo. Cependant, l‘interaction des cellules MIAMI avec les cellules gliales tumorales semble être gliome dépendant suggérant que des investigations supplémentaires doivent être réalisées pour s‘assurer de la sureté des cellules MIAMI. L‘ensemble de ce travail de thèse a montré que les cellules MIAMI combinées à des NPs pour délivrer spécifiquement un principe actif au sein d‘une tumeur cérébrale constituent un outil prometteur dans la thérapie du gliome.