La poly(ADP-ribose) polymerases consistant en une population hétérogène de polymères formés à partir du NAD. La poly(ADP-ribose) glycohydrolase est responsable de la dégradation du poly(ADP-ribose). Les activités enzymatiques de ces enzymes constituent un système de régulation pour différents sentiers métaboliques. En effet, l'interaction démontrée entre le pADPr et de multiples protéines a permis de confirmer un rôle de modulateur de nombreuses voies de signalisation tel que la réparation de l'ADN, apoptose, cycle cellulaire, surveillance de l'intégrité du génome, transcription et modulation de la chromatine. Ainsi, nous avons formulé l'hypothèse que le pADPr pourrait coordonner la réparation des lésions à l'ADN et la progression du cycle cellulaire avec la signalisation d'événement apoptotiques. Une approche efficace constituerait à identifier et caractériser les protéines (intermédiaires) associées au pADPr selon une logique temporelle. Les diverses actions du pADPr sur les processus biologiques dépendent (dans le cas de la majorité du pADPr, soit celui métabolisé par PARP-1) de la gravité des dommages induits à l'ADN. Par conséquent, il existe probablement des points de seuil faisant basculer les voies de signalisation de la réparation vers la mort cellulaire. Une approche réductionniste, dans ce type de problème, ne peut apporter des réponses satisfaisantes. L'utilisation de la protéomique quantitative semble être une approche plus appropriée. Un volet du travail présenté dans cette thèse visait à identifier des partenaires des PARP-1, PARP-2 et PARG dans le but de reconnaître les sentiers biochimiques qui pourraient inclure une composante de poly(ADP-ribosylation) dans leur régulation et définir des interactions fonctionnellement pertinentes. Par la suite, nous avons établi un réseau dynamique des complexes associés au pADPr en fonction du temps suivant un dommage alkylant induit par un stress génotoxique. Ainsi, certains événements modulés par le pADPr ont été analysés et cartographies. De plus, nous avons caractérisé un rôle novateur du pADPr dans la formation des granules de stress suite à un stress génotoxique. En conséquence, nos résultats ont permis d'édifier les premières bases pour la biologie des systèmes de la poly(ADP-ribosyl)ation en fournissant un répertoire d'interactions protéique exhaustif.

Les cellules de l’organisme réagissent au danger en relâchant des substances dont les nucléotides, qui sont à l’origine de l’inflammation et/ou fibrose notamment au niveau du foie. Ceux-ci activent leurs récepteurs P2 disséminés sur la plupart des cellules de l’organisme. Il existe des enzymes parmi lesquelles les NTPDases, habilitées à hydrolyser ces nucléotides, limitant ainsi leur activité pro¬inflammatoire. Notre laboratoire a identifié, cloné et localisé la NTPDase8, au niveau des canalicules biliaires du foie. Predisant une fonction dans l’inflammation hépato-biliaire in vivo, nous avons généré une lignée de souris déficiente en cette enzyme et des anticorps dirigés contre celle-ci. Durant ma maitrise, j’ai confirmé la déficience de l’enzyme (ADN, ARN et protéine) dans cette lignée de souris Entpd8-/-. Les souris déficientes se sont révélées plus inflammées sans traitement, mais moins atteintes par l’inflammation et la fibrose que les souris sauvages à la suite de deux modèles distincts de fibrose hépatique. / Body cells react, to danger signals by releasing in the external environment, substances such as nucleotides that are responsible for inflammation and/or fibrosis. Nucleotids activate their P2 receptors spread throughout the body. There are enzymes such as the NTPDases, which are empowered to hydrolyze these nucleotides thus limiting their P2 receptor-induced activation. Our laboratory has identified, cloned and located one of those enzymes referred as NTPDase8 at the level of the liver bile canaliculi. This location may lead to a particular function in liver inflammatory attacks. So, we generated NTPdase8 knock-out mice and antibodies against this protein. During my Master degree, I characterized NTPDase8-deficient mice to the level of DNA, RNA and protein. I then developed two models of liver fibrosis to assess the role of this enzyme in vivo. The knock-out mice which started more inflamed were found little less inflamed and fibrotic after the experiments than wild-type mice.

Notre projet visait en premier à étudier la protéolyse sécrétée par l'endomètre eutopique provenant de femmes atteintes de la maladie et la comparer avec l'endomètre eutopique provenant de femmes saines. Nous avons démontré une augmentation dans l'activité protéolytique et nous avons identifié une augmentation de la sécrétion et de l'expression de la MMP-9 par l'endomètre eutopique provenant de femmes souffrant de la maladie. Nous avons par la suite étudié l'effet de l'activité protéasique sur la dégradation de l'IL1 rll. Nous avons démontré que l'endomètre eutopique provenant de femmes souffrant de l'endométriose cause la dégradation de l'IL-lrlI. La troisième partie du projet consistait en l'identification de molécules bioactives sécrétées par les cellules endométriosiques qui seraient responsables de l'angiogénèse retrouvée chez les femmes souffrant de la maladie. Nous avons réussi à identifier la nm23b, une protéine qui possède une influence angiogénique chez certains cancers lorsqu'elle est surexprimée.

Le potentiel trans-épithélial (PTE) représente la différence de charges qui existe dans un tissu étanche composé de cellules pluristratifiées. La distribution inégale de certains ions à travers l'épiderme est responsable de sa présence dans la peau. Des mesures de PTE ont été effectuées à différents temps lors de la genèse de l'épiderme ainsi que durant la réépithélialisation d'une plaie sur un modèle de peau humaine reconstruite par génie tissulaire. L'intensité du PTE varie en fonction du temps dans les deux conditions et cette cinétique a été confirmée au cours de la réépithélialisation d'une plaie sur un modèle in vivo. L'expression des pompes Na⁺/K⁺ ATPase varie elles aussi en fonction du temps et l'utilisation de l'amiloride, un inhibiteur du transport cationique, module négativement la cinétique du PTE par rapport au groupe témoin en plus de retarder la réépithélialisation de la plaie.

Kératines (K), protéines constitutives des filaments intermédiaires (FI) de l'épithélium, englobent une vingtaine de protéines du cytosquelette, exprimées différenti-ellement selon la différenciation et regroupées en deux catégories: type I (K9-20) et type II (Kl-8). Dans le foie, les FI des hépatocytes sont composés uniquement des K8 et Kl8, marqueurs typiques de l'épithélium simple. En raison de son métabolisme unique et de sa relation avec le tracrus gastro-intestinal, le foie constitue une cible majeure de la toxicité induite par les médicaments, les xénobiotiques et le stress oxydatif. La présente étude révèle que les hépatocytes de souris ainsi que les hépatomes H4IIE dépourvues de K8 (K8-null et shK8b respectivement) sont plus résistants que leurs homologues contenant la K8 (WT et H4ev respectivement), suite à un excès de H2O2. Les cellules meurent via les mitochondries en lien avec une activation et une localisation altérées de la PKCô dans les cellules shK8b. Même si le H2O2 modifie différentiellement les niveaux de glutathione (GSH) et des espèces reactives de l'oxygène (ROS) dans les cellules H4ev versus shK8b, la réponse de mort est largement indépendante du niveau de GSH. En outre, nos résultats montrent que la différence dans le niveau de GSH provient d'une altération dans le métabolisme du glucose dans les cellules shK8b. Une stimulation du récepteur de l'insuline à la surface cellulaire déclenche préférentiellement une signalisation dépendante du glucose associée à l'activation de la voie PI3K/AKT, qui à son tour régule différentes activités métaboliques. Comparativement aux cellules H4ev, la stimulation par l'insuline des cellules shK8b présente une cinétique de production du glycogène plus rapide et plus élevée, associée à une signalisation préférentiellement liée à la voie G6P/mTOR/S6K. Par contre dans les hépatocytes, la cinétique différentielle de la production du glycogène en absence de K8 est maintenue, mais a lieu préférentiellement via la voie PI3K/AKT. D'une manière commune, ces altérations dans les voies de signalisation métaboliques amenées par la perte des FI de K8/K18 semblent être liées à une perturbation dans le transport membranaire du glucose à la surface. Ensemble, ces résultats fournissent la première évidence directe de la régulation par les FI de K8/K18 du métabolisme du glucose dépendent de l'insuline et de la mort cellulaire induite par les ROS dans les cellules hépatiques.

La présente étude avait pour objectif d’évaluer et comparer le potentiel de produits anti-mycotoxiniques et d’antioxydants non-enzymatiques à prévenir des effets indésirables du désoxynivalénol (DON) sur les performances de croissance, la digestibilité, la morphologie intestinale, l’activité des enzymes antioxydants et le statut oxydatif du porcelet. Dans une première expérience, les effets néfastes du DON et la capacité anti-mycotoxinique de quatre produits commerciaux (Intégrale®, Biofix Plus®, MXM® et Défusion®) ont été évaluée chez soixante porcelets sevrés et nourris avec des aliments contaminés par le DON. La concentration de 4 mg kg-1 de DON peut causer une chute de la prise alimentaire et de l’efficacité alimentaire ainsi que réduire la digestibilité de la matière sèche, du gras et de l’énergie par la diminution de la hauteur des villosités chez les porcelets contaminés au DON et, créer un stress oxydatif dans le jéjunum. Les anti-mycotoxines ont partiellement modifié le statut oxydatif de la muqueuse intestinale, et le seul additif anti-mycotoxinique, Defusion®, pouvait rétablir la croissance et la hauteur des villosités. Dans une seconde expérimentation, les effets négatifs du DON et la capacité antioxydante des produits non-enzymatiques tels que les vitamines (A, E et C), le sélenium organique (Se) / glutathione (GSH), la quercétine et la combinaison des antioxydants précédents ont été testés chez soixante douze porcelets sevrés et nourris avec des aliments contaminés au DON-ZEN (zéaralénone). Les effets néfastes de 3 mg kg-1 de DON n’ont pas été identifiés sur la prise alimentaire et l’efficacité alimentaire. Le stress oxydatif causé par le DON n’a pas été bien identifié dans le système systémique et la muqueuse intestinale. La présence de ZEN dans les traitements expérimentaux pouvait influencer sur l’évaluation des performances de croissance chez ces porcelets. La combinaison des antioxydants non-enzymatiques peut réduire le stress oxydatif en diminuant la teneur en malondialdéhyde (MDA) dans le plasma, le foie et dans l’iléon ainsi que la division cellulaire (PCNA) dans le jéjunum. Les résultats de deux études ont caractérisé les impacts du DON sur les performances de croissance, la digestibilité, la morphologie intestinale et le statut antioxydant. L’efficacité des produits anti-mycotoxiniques et des antioxydants non-enzymatiques a été déterminée pour la lutte contre le DON. Des études supplémentaires sont nécessaires pour déterminer les effets du DON sur les autres organes (le foie et les reins) et, le temps d’exposition au DON plus de trois semaines serait requis pour les prochaines expérimentations. / The aim of this study was to evaluate and compare the potential of anti-mycotoxin additives and non-enzymatic antioxidant substrates in preventing the effects of deoxynivalenol (DON) on growth performance, digestibility, intestinal morphology, antioxidant enzyme activities and oxidative status in piglets. In the first experiment, the adverse effects of DON and the antimycotoxin ability of four antimycotoxin products (Integral®, Biofix Plus®, MXM® and Defusion®) against DON were evaluated in sixty weaned piglets fed with the DON-contaminated diets. The concentration of 4 mg kg-1 of DON could reduce feed intake and feed efficiency, as well as decrease digestibility of dry matter, fat and energy by reducing the villus height of piglets fed the DON-contaminated diets and creat an oxidative stress in jejunum. The antimycotoxin products modified partially oxidative status of the intestinal mucosa, and the only antimycotoxin, Defusion®, could restore the growth performance and the villus height. In the second experiment, the adverse effects of DON and the antioxidant ability of non-enzymatic antioxidants such as vitamins (A, E and C), selenium (Se) / glutathione (GSH), quercetin and the combination of both of non-enzymatic antioxidants were tested in seventy-two weaned piglets fed with the DON-ZEN (zearalenone)-contaminated diets. The adverse effects of 3 mg kg-1 of DON was not observed on feed intake and feed efficiency. The oxidative stress induced by DON was not well characterized in the systemic system and intestinal mucosa. The presence of ZEN in experimental diets could influence on the evaluation of growth performance of piglets. Combination of non-enzymatic antioxidants could reduce the oxidative stress by decreasing the concentration of malondialdehyde (MDA) in plasma, liver and ileum, as well as the cell division (PCNA) in the jejunum. The results of two studies have characterized the impacts of DON on growth performance, digestibility, intestinal morphology and antioxidant status. The efficacy of antimycotoxin products and non-enzymatic antioxidants were determined for DON-prevention. Further studies are needed to assess the effects of DON in other organs (liver and kidneys), and the time of exposure to DON more than three weeks may be required for the next experiments.

Le foie, en tant qu'organe exerçant un rôle prédominant dans le métabolisme de plusieurs substances, tels le glucose, les médicaments et les xénobiotiques, constitue une cible de prédilection pour le stress oxydant. Les kératines (K), protéines de la famille des filaments intermédiaires (FI) retrouvées dans le tissu epithelial, englobent une vingtaine de protéines du cytosquelette regroupées en type I (K9-23) et type II (Kl-8). Leur expression implique différentes paires type I/type II, corrélant avec l'état de différenciation des cellules épithéliales. Chez les hépatocytes, principales cellules constituant le parenchyme hépatique, ainsi que chez les cellules d'hépatome, les K8/K18 sont les seuls FI retrouvés. La présente étude vise à définir le mécanisme permettant aux cellules de l'hépatome H4IIE-C3 dépourvues de K8/K18 (shK8b) de résister plus efficacement au stress oxydant produit par un surplus de H2O2 que les mêmes cellules possédant les K8/K18 (H4ev). Les résultats montrent que la résistance des shK8b au H2O2 ne provient pas d'une altération dans l'activation de voies signalétiques en réponse au stress oxydant. Par contre, le taux de glucose présent dans le milieu de culture affecte de manière différentielle la survie des H4ev versus shK8b au H2O2. De plus, une augmentation du niveau d'hexokinases en surface des mitochondries des shK8b corrèle avec la résistance de ces cellules au H2O2. Par ailleurs, une perturbation de cette association donne lieu à une augmentation de la sensibilité chez les shK8b se rapprochant du niveau observé chez les H4ev, tout en déclenchant une sortie du cytochrome c issu des mitochondries. Dans l'ensemble, les résultats obtenus suggèrent fortement que la résistance des shK8b au stress oxydant est principalement due à une altération dans l'utilisation du glucose, en lien avec l'association plus importante d'hexokinases aux mitochondries.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdorales, 2014-2015 / Cette étude a pour objectif de déterminer les impacts de la l’anémie ferriprive (AF) modérée durant la gestation et la lactation, sur les fonctions neurophysiologiques des voies auditives, ainsi que sur les fonctions métaboliques de la progéniture du cochon d’Inde (Cavia porcellus). Elle s’articule selon 2 volets d’études distincts (protocoles 1 et 2), basés tant sur la composition en fer des diètes, que sur la nature des acides gras (AG) qui les composent. Ainsi, les diètes du 1er protocole sont soit suffisantes en fer (SF : 144 mg / Kg), soit déficientes en ce dernier (DF : 11,7 mg / Kg), mais toutes deux exemptes d’AG polyinsaturés à longue chaîne (AGPI-LC) et présentant un ratio n-6:n-3 de 59:1. Dans le 2ème protocole, les diètes sont également SF (146 mg / Kg) ou DF (12,7 mg / Kg), mais intègrent des AGPI-LC et présentent un ratio n-6:n-3 de 11:1, afin de mimer un profil d’AG proche de celui de la diète nord-américaine. La terminologie « +AGPI » (SF+AGPI et DF+AGPI) reflétera cette diète. Les mères cobayes ont reçu leur alimentation respective durant les périodes d’habituation, reproduction, gestation et jusqu’au jour post-natal (JPN) 9. Les nouveau-nés ont été sevrés au JPN9 avec leur diète contrôle respective. Les potentiels évoqués auditifs du tronc cérébral (PEATC) et les prélèvements de tissus ont eu lieu au JPN24, moment où le statut hématologique des cobayes était restauré. Les PEATC des fratries DF ont présenté de profondes altérations auditives périphériques, caractérisées par une perte d’audition de type neurosensorielle (affectant particulièrement les basses fréquences), associée à un retard dans la vélocité de conduction du nerf auditif et à une sur-stimulation neurale (hyperacousie, chez les femelles uniquement). Parallèlement, l’expression cérébrale de la Δ6-désaturase, et les niveaux de cyclo-oxygénase II (COX II) et de prostaglandines (PG) étaient inchangés par rapport aux fratries SF. Au niveau central (Encephalum), une incorporation importante d’AG (essentiellement sous forme d’AGPI n-6) était caractérisée au sein des phospholipides (PL) des fratries DF. Chez ces derniers, une élévation marquée des AG totaux, saturés, monoinsaturés et AGPI n-6 plasmatiques était parallèlement caractérisée. Au sein du 2ème protocole, les fratries DF+AGPI et SF+AGPI ne présentaient pas de différence dans les temps de transmission périphérique (nerf auditif) et plus centrale (tronc cérébral), ainsi qu’au niveau de la synchronisation neurale. Malgré une similarité avec les fratries SF+AGPI dans l’acuité auditive, une forte proportion de perte d’audition neurosensorielle s’illustrait parmi le groupe DF+AGPI. Au sein de ce dernier, l’ARNm encéphalique de la Δ6-désaturase présentait une tendance à la diminution et seule la concentration en PGE2 était significativement réduite. Parallèlement, les AG des différents PL du cerveau apparaissaient faiblement affectés, alors que les concentrations érythrocytaires en AG totaux, AGS, AGPI-LC n-3 (dont l’ADH) étaient réduites. Les AG hépatiques ne subissaient aucun changement. En dépit de la réplétion en fer, ces études révèlent que la magnitude des effets de la DF gestationnelle sur les altérations neurophysiologiques et biochimiques chez la progéniture est étroitement liée au métabolisme lipidique. Les variations dans le profil en AGPI-LC des diètes DF peuvent induire des altérations particulièrement marquées au niveau des organes sensoriels périphériques chez la progéniture. Les mécanismes mis en jeu, ainsi que leurs incidences au niveau central restent à déterminer. / This research aims to determine the impacts of a moderate iron deficiency anæmia (IDA) during gestation and lactation on neurophysiological functions of the auditory pathways, as well as metabolic functions of the offspring in the guinea pig (Cavia porcellus). This thesis consists of 2 distinct studies (protocols 1 and 2), based on both the content of iron and the nature of the fatty acids (FA) in the diets. Thus, the diets of the 1st protocol are iron sufficient (IS: 144 mg / kg) or iron deficient (IDA: 11.7 mg / kg), but both are devoid of long chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFA) and have a ratio of n-6:n-3 equivalent to 59:1. In the 2nd protocol, diets are also IS (146 mg / kg) or IDA (12.7 mg / kg), but contain LC-PUFA and have a n-6:n-3 ratio of 11:1, in order to mimic a FA profile close from the one of the Northern-American diet. The « +PUFA » terminology (SF+PUFA and IDA+PUFA) will reflect this diet. Guinea pig dams received their respective diet during the periods of habituation, reproduction, gestation and until postnatal day (PNd) 9. Offspring were weaned at post-natal day (PNd) 9 with their respective control diet. Auditory brainstem response (ABR) and tissue samples took place at PNd24, a time point indicating when the hæmatological status of guinea pigs was restored. The ABR from IDA siblings showed profound peripheral auditory impairments, characterized by a sensorineural hearing loss type (particularly affecting the low frequencies), associated with a delay in the conduction velocity of the auditory nerve and increased neural stimulation (hyperacusis, in females only). Furthermore, brain expression of the Δ6-desaturase, and cyclooxygenase II (COX II) and prostaglandins (PG) levels were unchanged compared with siblings IS. At the central level (Encephalum), a significant FA incorporation (mainly in the form of n-6 PUFA) was characterized in phospholipids (PL) from IDA siblings. In the latter, a marked plasma elevation of total, saturated, monounsaturated FA and n-6 PUFA was characterized in parallel. In the second protocol, siblings IDA+PUFA and SF+PUFA showed no difference in peripheral (auditory nerve) and central (brainstem) transmission times, and in the neural synchronization. Despite a similarity with IS+PUFA siblings’ auditory acuity, a large proportion of sensorineural hearing loss was noted in the IDA+PUFA group. Within the latter, the brain Δ6-desaturase mRNA showed a trend to be decreased and only the PGE2 concentration was significantly reduced. Furthermore, FA from different brain PL appeared weakly affected, whereas concentrations of total FA, saturated FA (SFA), n-3 LC-PUFA (including docosahexænoic acid, DHA) in erythrocytes were reduced. Liver FA underwent no change. Despite iron repletion, these studies show that the magnitude in the impact of a gestational IDA on neurophysiological and biochemical alterations of offspring is closely related to their lipid metabolism. Changes in the offspring’s LC-PUFA profile following the gestational IDA diets may induce alterations particularly marked in their peripheral sensory organs. The mechanisms involved and their impact at the central level remain to be determined.

L'objectif de ce projet consiste à identifier des molécules fluorescentes, naturellement présentes dans les cellules, et dont l'évolution de leur concentration sera représentative du comportement métabolique de cellules en suspension. Ces molécules pourront servir au suivi du métabolisme cellulaire en temps réel durant une culture. Un besoin pour ce type d'outils se fait sentir afin de pouvoir développer et optimiser des bioprocédés, dont ceux utilisant des cellules végétales indifférenciées en suspension. La première étape fut la sélection et la caractérisation expérimentale de 11 molécules candidates à l'aide d'un spectrophomètre équipé d'un monochromateur quadruple. Après la réalisation des empreintes optiques des molécules, 16 zones d'intérêt dans le spectre d'autofluorescence furent identifiées et suivies dans le temps. Les signaux de la suspension complète, du milieu et des cellules filtrées furent analysés afin d'identifier 10 marqueurs métaboliques, caractérisés par 10 couples de longueurs d'ondes corrélés à des variables de culture. Cette méthode a permis d'identifier dix marqueurs métaboliques dans la suspension complète et laisse entrevoir la possibilité de plusieurs autres dans le milieu et les cellules filtrées. Le fait que certains marqueurs puissent se valider entre eux rajoute à la puissance de cette méthode. Il a donc été démontré que l'autofluorescence des cellules de plante indifférenciées en suspension contient assez d'information pour permettre le suivi de la croissance cellulaire en temps réel. La prochaine étape sera donc de valider ces marqueurs sur d'autres types de cellules.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.