A plethora of new functions of non-coding RNAs have been discovered in past few years. In fact, RNA is emerging as the central player in cellular regulation, taking on active roles in multiple regulatory layers from transcription, RNA maturation, and RNA modification to translational regulation. Nevertheless, very little is known about the evolution of this \Modern RNA World' and its components. In this contribution we attempt to provide at least a cursory overview of the diversity of non-coding RNAs and functional RNA motifs in non-translated regions of regular messenger RNAs (mRNAs) with an emphasis on evolutionary questions. This survey is complemented by an in-depth analysis of examples from different classes of RNAs focusing mostly on their evolution in the vertebrate lineage. We present a survey of Y RNA genes in vertebrates, studies of the molecular evolution of the U7 snRNA, the snoRNAs E1/U17, E2, and E3, the Y RNA family, the let-7 microRNA family, and the mRNA-like evf-1 gene. We furthermore discuss the statistical distribution of microRNAs in metazoans, which suggests an explosive increase in the microRNA repertoire in vertebrates. The analysis of the transcription of non-coding RNAs (ncRNAs) suggests that small RNAs in general are genetically mobile in the sense that their association with a hostgene (e.g. when transcribed from introns of a mRNA) can change on evolutionary time scales. The let-7 family demonstrates, that even the mode of transcription (as intron or as exon) can change among paralogous ncRNA.

The oocyte-to-zygote transition represents the only physiological event in mammalian life cycle, during which a differentiated cell is reprogrammed to become pluripotent. For its most part, the reprogramming relies on the accurate post-transcriptional control of maternally deposited mRNAs. Therefore, understanding the mechanisms of post-transcriptional regulation in the oocyte will help improve our knowledge of cell reprogramming. Short non- coding microRNAs have recently emerged as an important class of post-transcriptional regulators in a wide range of cellular and developmental processes. MicroRNAs repress their mRNA targets via recruitment of deadenylation and decapping complexes, which typically accumulate in cytoplasmic Processing bodies (P-bodies). The presented work uncovers an unexpected feature of the microRNA pathway which is found to be suppressed in fully-grown mouse oocytes and through the entire process of oocyte-to-zygote transition. This finding is consistent with the observation that microRNA-related P-bodies disassemble early during oocyte growth and are absent in fully-grown oocytes. Some of the proteins normally associated with P-bodies localize to the oocyte cortex. At the final stage of oocyte growth, these proteins, together with other RNA-binding factors, form subcortical...

The neuron navigator 2 (NAV2) gene is highly expressed in brain and involved in the nervous system development and may play a role in Alzheimer's disease (AD). We aimed to investigate the associations of 317 single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in the NAV2 gene with the risk and age at onset (AAO) of AD using a family-based sample (1266 AD cases and 1279 healthy relatives). Association with the risk of AD was assessed using family-based association test -generalized estimating equations (FBAT- GEE) statistics while the association with AAO as a quantitative trait was evaluated using the FBAT-Wilcoxon statistic. Single marker analysis showed that 20 SNPs were significantly associated with the risk of AD (top SNP rs7112354 with p = 8.46 × 10− 4) and 11 SNPs were associated with AAO (top SNP rs1354269 with p = 2.87 × 10− 3). Interestingly, two SNPs rs17614100 and rs12364788 were associated with both the risk (p = 1.7 × 10− 2 and 2.71 × 10− 2; respectively) and AAO (p = 1.85 × 10− 3 and 6.06 × 10− 3; respectively). Haplotype analyses further supported the results of single marker analyses. In addition, functional analysis showed that NAV2 mRNA had significant expression across ten human brain regions examined and significantly correlated with APOE expression in four of ten regions. The present study is the first study providing evidence of several genetic variants within the NAV2 gene influencing the risk and AAO of AD.

Genome regulation is an extremely complex phenomenon. There are various mechanisms in place to ensure smooth performance of the organism. Post-transcriptional regulation of gene expression is one such mechanism. Many proteins bind to mRNAs and regulate their translation. In this thesis, I have focused on the Cytoplasmic Polyadenylation Element Binding family of proteins (CPEB1-4); a group of sequence specific RNA binding proteins important for cell cycle progression, senescence, neuronal function and plasticity. CPEB protein binds mRNAs containing a short Cytoplasmic Polyadenylation Element (CPE) in 3’ untranslated Region (UTR) and regulates the polyadenylation of these mRNAs and thereby controls translation. In Chapter II, I have presented my work on the regulation of mitochondrial function by CPEB. CPEB knockout mice have brain specific defects in mitochondrial function owing to a reduction in Electron transport chain complex I component protein NDUFV2. CPEB controls the translation of this NDUFV2 mRNA and thus affects mitochondrial function. A consequence of this reduced bioenergetics is reduced growth and branching of neurons, again emphasizing the importance of this pathway. Chapter III focuses on the role of CPEB4 in neuronal survival and protection against apoptosis. CPEB4 shuttles between nucleus and cytoplasm and becomes nuclear in response to stimulation with ionotropic glutamate receptors, focal ischemia in vivo and when cultured neurons are deprived of oxygen and glucose; nuclear CPEB4 affords protection against apoptosis in ischemia model. The underlying cause for nuclear translocation is reduction in Endoplasmic Reticulum calcium levels. These studies give an insight into the function and dynamics of these two RNA binding proteins and provide a better understanding of cellular biology.

Most existing studies of receptor signaling are qualitative, which can lead scientists to misinterpret or overlook key information about the extent and timing of key events. To overcome these shortcomings, we have applied quantitative approaches to characterize receptor activation and signaling events. Most signaling studies focus on events occurring at a particular level in the system (e.g., on the membrane, at the level of phosphorylation of intracellular signaling molecules, or at the level of transcription). Instead, we are interested in taking a longitudinal view of signaling by achieving a quantitative understanding of a single signaling pathway from initial stimulation of the receptor by its growth factor (GF) ligand, through to gene expression, and functional cellular responses. As a model system for our studies, we used the growth factor receptor tyrosine kinase, REarranged during Transfection (RET), which requires a ligand and a glycosylphosphatidylinositol-anchored co-receptor for activation. RET mediates the response of cells to members of the glial cell-line derived neurotrophic factor (GDNF) family of neurotrophins, which are important in the development and maintenance of a subset of neuronal cells as well as in other cell types and tissues. We have characterized the molecular mechanisms of RET activation and signaling by pursuing the following four aims: 1) We developed a sensitive and robust luciferase reporter gene assay for RET signaling. 2) We characterized the dynamic relationship between receptor activation and downstream signaling events, including gene transcription and translation of three target genes. 3) We used the reporter gene assay, and other detection approaches, to test and quantify crosstalk between RET and other GF receptors. 4) We developed a FRET reporter system to enable monitoring of the assembly of the activated RET receptor complex on cells, as a means to distinguish between ligand-induced oligomerization and pre-associated oligomer mechanisms. Through these four aims, we have established new methods to quantitatively elucidate mechanisms of GF receptor activation, new insights into how signals are propagated from the receptor to the nucleus and into a functional response, and have established crosstalk between RET and other GF receptor pathways.

La voie de signalisation mTOR intègre une variété de signaux environnementaux pour réguler la croissance et le métabolisme cellulaire. Cette voie est altérée dans 70% des cancers. Les inhibiteurs allostériques de mTOR, comme la rapamycine et ses dérivés (évérolimus et temsirolimus), sont administrés aux patients atteints de tumeurs métastatiques du sein, du rein et neuroendocrines. Cependant, leur efficacité reste modeste et une majorité de patients rechutent. L'utilisation de rapalogues fait donc face à deux problèmes cliniques majeurs : 1/l’absence de biomarqueur qui permette de stratifier les patients qui bénéficieraient le plus d'un traitement par rapalogues ; 2/ l’existence de plusieurs mécanismes de résistance décrits ou non. L’objectif de mon travail de thèse est d’identifier des nouveaux gènes cible des rapalogues utilisables comme biomarqueurs prédicteurs de l’efficacité du traitement ou comme cibles thérapeutiques pour vaincre la résistance.Nous avons identifié le gène TRIB3 comme cible des rapalogues. Sous traitement, son expression est diminuée dans un panel de lignées tumorales et des échantillons tumoraux. Nous avons démontré que cette régulation est indépendante de l’inhibition de la voie mTOR, mais médiée par le répresseur transcriptionnel GCF2. Des analyses protéomiques à haut débit ont identifié TRIB3 en tant que composant du spliceosome. De plus, nous avons démontré que la régulation négative de TRIB3 est nécessaire aux rapalogues pour modifier l'épissage des pré-ARNm. A l’inverse, la surexpression de TRIB3 supprime ces effets des rapalogues. En conclusion, ce travail de thèse ouvre plusieurs perspectives: 1 / l'utilisation potentielle de TRIB3 comme biomarqueur pour prédire ou évaluer l'efficacité du traitement par les rapalogues; 2 / de nouvelles opportunités thérapeutiques ciblant ces mécanismes indépendants de mTor ; 3/ la combinaison possible des rapalogues avec des composés ciblant l’épissage afin de surmonter la résistance. / The mTOR signaling pathway senses variety of environmental cues and integrates them to regulate cellular growth and metabolism. This pathway is altered in 70% of cancers. Allosteric inhibitors of mTOR like rapamycin and its derivatives (everolimus and temsirolimus) have become standard of care in patients with metastatic breast, kidney and neuroendocrine tumors. Unfortunately, their role is modest and most of patients will relapse. Thus, in clinic there are two major concerns related to the use of rapalogs: 1/ the absence of accurate biomarker to stratify patients who would benefit from rapalogs treatment; 2/ the existence of known and unknown mechanisms of resistance. Accordingly, the aim of my PhD project is to identify new target genes of rapalogs that could be used as biomarkers to predict treatment efficacy, or as therapeutic targets, to overcome resistance.We identified TRIB3 gene as a novel target of rapalogs. Upon treatment, its expression is down-regulated both in a panel of cancer cell lines and in cancer patient samples. We showed that this regulation is independent of the mTOR signaling inhibition, but relies on a transcriptional regulation via the co-repressor GCF2. High-throughput proteomic analyses identified TRIB3 as a component of the spliceosome. Additionally, we demonstrated that the down-regulation of TRIB3 is necessary for rapalogs to alter pre-mRNA splicing. In contrast, the, overexpression of TRIB3 abolishes these effects of rapalogs. In conclusion, this PhD work leads to the following important perspectives: 1/ the potential use of TRIB3 as a biomarker to predict or asses the efficacy of rapalogs treatment; 2/ new window of therapeutic possibilities by targeting this mTOR - independent mechanism of action; 3/ the potential combination of rapalogs with splicing targeting agents to overcome resistance.

La synthèse des protéines est un mécanisme central de la vie cellulaire dont la compré-hension est un enjeu pour la recherche biomédicale. Des phénomènes comme les erreurs programméesde la traduction eucaryote ou l’initiation par des structures IRES virales sont impliqués dans les processusde réplication de virus et de bactéries. Mieux appréhender ces processus est une étape essentiellepour aboutir au développement d’approches thérapeutiques innovantes. Les études en molécule uniquepermettent d’observer chaque système réactionnel individuellement et donnent accès à des évènementsasynchrones difficilement observables en mesure d’ensemble, tels la traduction de protéines.Ce manuscrit de thèse présente une approche d’étude de la traduction par un ribosome eucaryote(mammifère) en molécule unique. Nous observons les systèmes traductionnels grâce à des marqueursfluorescents liés à des oligonucléotides pouvant s’hybrider sur les séquences d’ARN messagers traduites.L’observation de ces marqueurs est faite par microscopie de fluorescence en réflexion totale (TIRFM),les ARNm étant accrochés à la surface de l’échantillon. En lisant l’ARNm, le ribosome détache lesmarqueurs, et leurs instants de départ nous permettent de remonter à la dynamique de traductionde ribosomes individuels. Cette méthode permet d’obtenir des données cinétiques statistiques surun grand nombre de systèmes traductionnels en parallèle pouvant alors être ajustées par des lois deprobabilité. Partant de ce principe, mes travaux de thèse ont eu pour objectif d’étendre nos expériencesà une nouvelle problématique biologique : l’étude des évènements non canoniques de la traductioneucaryote. Pour cela nous avons apporté les modifications et les optimisations nécessaires au dispositifet au protocole expérimental pour l’adapter à ces nouveaux enjeux.Nos mesures de la cinétique in vitro de l’élongation eucaryote ont mis à jour un délai dû à uneinitiation non-canonique. En effet, nous réalisons le recrutement du ribosome par l’ARNm grâce àune structure virale de type IRES. Dans nos conditions d’expérience, l’incorporation d’un acide aminéprend environ une seconde tandis que cette structure induit un retard à la traduction de plusieursdizaines de secondes. Nous avons réalisé une étude comparative de plusieurs de ces structures viraleset avons montré que le délai mesuré était une caractérisitique conservée dans le cadre de l’initiation noncanonique. Ce résultat ouvre des perspectives d’études cinétiques tant pour approfondir nos conclusionssur les IRES que pour aborder d’autres évènements non canoniques tel que le décalage de la phase delecture ou le franchissement du codon stop. / The synthesis of proteins is a central mechanism of cellular life whose understandingis an issue for biomedical research. Phenomena such as programmed errors of eukaryotic translation orinitiation by viral IRES structures are involved in virus and bacterial replication processes. A Betterunderstanding of these processes is an essential step towards the development of innovative therapeuticapproaches.Single molecule studies allow each reaction system to be observed individually and give accessto asynchronous events, such as protein translation, that are difficult to observe in overall measurements.This phD manuscript presents a single molecule approach to study translation by a eukaryotic(mammalian) ribosome.We observe the translational systems thanks to fluorescent primers linked to oligonucleotides thatare hybridized to the translated mRNA sequences. These markers are observed by Total InternalReflection Fuorescence Microscopy (TIRFM) ; with the mRNAs attached to the sample surface. Whilereading the mRNA, the ribosome detaches the primers, and their instants of departure give us access tothe translation dynamics of individual ribosomes. This method makes it possible to obtain statisticalkinetic data on a large number of parallel translational systems, which can then be fitted by probabilitylaws. On the basis of this principle, my phD work aimed at extending our experiments to a newbiological issue : the study of non-canonical events in eukaryotic translation. To this end, we havemade the modifications and optimizations necessary for the set-up and the experimental protocol toadapt them to these new challenges.Our measurements of the in vitro kinetics of eukaryotic elongation have revealed a delay due tonon-canonical initiation. Indeed, the ribosome are recruited on the mRNA thanks to a viral, IREStype structure. Under our experimental conditions, the incorporation of an amino acid takes aboutone second while this structure induces a translation delay of several tens of seconds. We carried outa comparative study of several of these viral structures and showed that the measured delay was acharacteristic preserved in the framework of the non-canonical initiation. This result opens up prospectsfor kinetic studies both to deepen our conclusions on IRES and to address other non-canonical eventssuch as programmed frameshifting or STOP codon readthrough.

La qualité germinative (vigueur) des semences est un caractère agronomique majeur. Elle correspond à la capacité d'un lot de semences à germer de façon rapide et homogène dans une large gamme de conditions environnementales. Cette qualité germinative est notamment contrôlée par une interaction antagoniste entre deux phytohormones, l'acide abscissique (ABA) qui induit et maintient la dormance et les gibbérellines (GAs) qui stimulent la germination et la croissance de la plantule. La dormance, qui correspond à un blocage physiologique de la germination, est un paramètre non souhaitable d'un point de vue agronomique. Par conséquent la compréhension de la régulation hormonale sur la qualité des semences représente un intérêt fort pour la communauté scientifique mais aussi pour les acteurs de la filière "semences". De nombreuses études ont démontré l'existence d’une importante régulation de la synthèse des protéines au cours de l’imbibition des graines. Cette régulation traductionnelle contribuerait à la mise en place des programmes métaboliques différents en fonction de l’état physiologique des semences pour maintenir un état de dormance ou initier le processus de germination.Le travail réalisé dans le cadre de cette thèse s’est concentré à apporter des éléments nouveaux sur le rôle de l’ABA dans la détermination de la qualité physiologique des semences au cours du développement de la graine et au cours de la germination. L’impact de l’ABA a été particulièrement décortiqué à l’aide de mutant d’Arabidopsis thaliana présentant des teneurs en ABA endogènes contrastées. Par une approche multi-omique combinant des analyses transcriptomiques, protéomiques et métabolomiques, nous avons étudié les mécanismes moléculaires et biochimiques associées avec la mise en place de la qualité physiologique des semences en relation avec l’ABA. Nos résultats ont montré qu’au-delà du contenu en ABA, l’origine tissulaire de cette hormone dans les graines gouverne de nombreux réarrangements métaboliques qui participent au déterminisme de la profondeur de dormance et de la vigueur germinative. Il apparaît un lien entre l’ABA et l’activité traductionnelle, étroitement associé au métabolisme énergétique et à l’homéostasie RedOx.L’effet de l’ABA sur l’activité traductionnelle a été suivi par une adaptation des méthodes SILAC (stable-isotope labelled amino acids in cell culture) aux grains d’Arabidopsis. Cette technique a été utilisée pour décrire la dynamique du protéome dépendante du contenu en ABA des graines au cours de leur imbibition. Nos résultats montrent que cette approche originale permet d’enrichir les connaissances sur la biologie fondamentale des semences. En effet, nous avons montré que l’ABA est un régulateur clé de la synthèse protéique dans les graines et est un contributeur majeur dans la mise en place des différents programmes traductionnels. Cette approche a montré que l’ABA exerce un contrôle sur la traduction de plus de 400 ARNm au cours de l’imbibition des graines et ouvre de nouvelles pistes pour la compréhension de la régulation de la synthèse protéique chez les semences et chez les plantes. Ces données générées offrent un nouveau regard sur le processus germinatif et de sa régulation par l’ABA.Sur la base des données existantes au laboratoire et celles générées au cours de cette thèse, nous avons également développé une utilisation de bio-marqueurs pour l’évaluation de la qualité des semences et nous avons mis au point des traitements de semences innovants. Ces technologies ont été développé en accord avec les attentes des industriels de la filière « semences ». La récente obtention d’un financement pour ce projet de recherche appliquée démontre la complémentarité des recherches effectuées au sein du laboratoire avec les besoin des industriels de la filière « semences ». / Germination vigor is a main concern in agriculture. High seed vigor is defined as the capacity of a seed lot to germinate rapidly, uniformly and in a wide range of environmental conditions. Seed quality is controlled by a dynamic balance between two antagonistic hormones, abscisic acid (ABA), which induces and maintains dormancy and gibberellins (GAs), which stimulate seed germination and seedling establishment. Seed dormancy corresponds to a block to the completion of germination and is an undesirable characteristic from an agronomic point of view. Thus, investigation of seed quality toward a better understanding of hormonal regulation is of fundamental concern for scientific community and seed industry.Recent studies have highlighted the intensive regulation of protein synthesis during seed germination. Translational regulation would govern the implementation of different metabolic programs during seed imbibition in order to maintain seed dormancy or to initiate the germination process. In this thesis, we explore the role of ABA in the control of germination quality during seed development and seed germination, using Arabidopsis thaliana mutant displaying contrasted ABA content.By combined “omic” approaches, we have highlighted the impact of ABA level on metabolic rearrangements during seed maturation. Our results showed that ABA origin in the seeds governs many metabolic rearrangements controlling dormancy depth and germination vigor. In addition, the present work suggests an intimate linkage between translational activity and ABA content, in association with energetic pathways and redox homeostasis.The impact of ABA on proteome turnover during seed germination was studied by adapting a metabolic labeling of neosynthesized proteins based on SILAC methods (stable isotope labelled amino acids in cell culture) to Arabidopsis seeds. Our results suggest that ABA is a key regulator of protein synthesis and modulates metabolic changes during seed imbibition. Indeed, this novel approach has highlighted that ABA controls the translation of more than 400 mRNAs during seed imbibition. This work provides an original perspective on the contribution of ABA and mRNA translation in seed germination and provides a valuable basis for further investigation of translational regulation in seeds and in plants.Based on existing data and those generated during this thesis, we also developed innovative seed treatments and new biomarkers for seed quality assessment. Recent funding for a maturation program dedicated to improve these biotechnologies demonstrates that our research meets the needs of seed industry.

La localisation d’ARNm est un processus cellulaire post-transcriptionnel qui assure le transport de l’ARNm vers une région subcellulaire spécifique. Dans différents organismes, plusieurs ARNm ont été décrits d’être localisés, et des études systématiques ont été réalisées uniquement chez la drosophile. Afin d’analyser la localisation des ARNm dans un modèle de mammifères, nous avons développé deux approches. La première approche est une nouvelle technique, smiFISH (single molecule inexpensive Fluorescent In Situ Hybridization), qui utilise des sondes primaires non marquées et une sonde secondaire fluorescente. Cette technique, qui permet d’analyser les ARNm au niveau endogène, est flexible, résolutive et peu coûteuse. La deuxième approche est l’analyse de centaines d’ARNm dans une collection de lignées cellulaires HeLa, par l’utilisation d’un seul jeu de sondes. Ces deux stratégies ont montré qu’environ 8% des ARNm sont localisés dans les cellules HeLa, et ont permis de découvrir de nouvelles classes de localisation d’ARNm chez les mammifères, jamais décrites auparavant. En analysant les gènes de la famille des moteurs moléculaires, nous avons trouvé que six ARNm ont des localisations particulières, parmi lesquels KIF1C présente une co-localisation entre l’ARNm et la protéine, suggérant un rôle crucial dans certains processus biologiques cellulaires. / The mRNA localization is a post-transcriptional process which allows the transport of mRNA to a specific subcellular region. In different organisms, several mRNAs have been described to be localized, but systematic studies have been only performed in Drosophila. In order to analyze the mRNA localization in a mammalian model, we developed two approaches. The first approach is a new technique, smiFISH (single molecule inexpensive Fluorescent In Situ Hybridization), which uses unlabeled primary probe and a fluorescent secondary probe. This technique, which allows the analysis of mRNA at the endogenous level, is flexible and inexpensive. The second approach is the analysis of hundreds of mRNA using a collection of HeLa cell lines, with a single set of probes. Both strategies allowed us to show that about 8% of mRNA are localized in HeLa cells. In addition, we discovered new classes of mRNA localization in mammals, never described before. By analyzing the genes of the molecular motors family, we found that six mRNAs have specific localization patterns, including KIF1C for which mRNA and protein co-localize, suggesting a crucial role in certain cell biological processes.

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