Submitted by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T15:43:49Z No. of bitstreams: 1 Tese - Alexandre Haruo Inoue.pdf: 17247513 bytes, checksum: f4009bd7092467ab9fc57f854d3cabcd (MD5) / Approved for entry into archive by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T15:59:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Alexandre Haruo Inoue.pdf: 17247513 bytes, checksum: f4009bd7092467ab9fc57f854d3cabcd (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T15:59:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - Alexandre Haruo Inoue.pdf: 17247513 bytes, checksum: f4009bd7092467ab9fc57f854d3cabcd (MD5) / Durante seu processo de evolução, os tripanossomatídeos desenvolveram características distintas de outros eucariotos em relação à sua biologia. Desde a transcrição do DNA no núcleo até tradução do RNA mensageiro no citoplasma, estão envolvidos fatores às vezes únicos, que atuam principalmente na regulação gênica pós-transcricional. Entretanto, o transporte de mRNA do núcleo para o citoplasma é pouco compreendido nesses parasitas. Análises de genômica comparativa revelaram que somente algumas proteínas envolvidas na exportação estão conservadas em espécies divergentes, como tripanossomatídeos, indicando que essa via pode apresentar fatores diferentes, ainda não identificados, ou ela não é tão especializada e complexa como a via descrita em mamíferos e leveduras. Por isso, a função de componentes da via de exportação de mRNA, buscando entender como esse processo funciona em parasitas merece ser melhor investigada. Este trabalho tem como foco o estudo de uma proteína de 45 kDa de T. cruzi, denominada de Hel45, que apresentou alta similaridade com RNA helicases de transporte, envolvidas com a exportação de mRNA em mamíferos e leveduras. Uma análise de filogenia determinou que Hel45 é a ortóloga da eIF4AIII, uma RNA helicase componente de Exon junction complex (EJC) em células de mamíferos. No entanto, até o momento, não existem publicações descrevendo homólogos de eIF4AIII em tripanossomatídeos. Dados experimentais demonstraram que Hel45 é uma proteína que migra entre o núcleo e o citoplasma devido a um sinal de exportação nuclear (NES) funcional. Esta migração depende da transcrição ativa e do receptor de exportação de mRNA Mex67. As análises fenotípicas de uma linhagem de T. cruzi nocaute de Hel45 mostraram que a ausência da proteína não foi letal ao parasita, mas resultou no atraso do crescimento e diminuiu a taxa de metaciclogênese in vitro. Apesar de não causar o acúmulo de mRNA no núcleo, o nocaute afetou a tradução, pois diminuiu a formação de polissomos e a taxa de tradução. No entanto, este efeito não altera a expressão de proteínas de modo geral, visto que ensaios de proteômica revelaram que o nocaute interfere com a expressão de apenas algumas poucas proteínas, indicando que Hel45 pode estar relacionada à modulação da expressão de genes específicos ou existe uma via/proteína compensatória na ausência de Hel45. Foram obtidas evidências de que Hel45 está presente em complexos ribonucleoproteicos que não estão associados aos polissomos e análises de proteômica identificaram as proteínas destes complexos que devem interagir com Hel45. Dados obtidos até o momento mostraram que Mago e Y14, proteínas de EJC que interagem com eIF4AIII, podem estar associadas com Hel45, assim como, Sub2 e FOP, que são proteínas essenciais para o recrutamento de Mex67 durante exportação de mRNA em outras células eucarióticas. Outra proteína que pode estar interagindo com Hel45 é uma exclusiva de tripanossomatídeos, que contém um domínio NTF2-like, típico de receptores de exportação. Assim, o conjunto de dados obtidos indica que Hel45 está envolvida com o metabolismo de mRNA em T. cruzi. Desta forma, tem sustentação a hipótese de que seu papel seria semelhante à eIF4AIII, agindo como um fator que se associa ao mRNA já durante a etapa transcrição/processamento e que é exportado para o citoplasma.

O estudo da expressão gênica é de grande aplicabilidade nas áreas de pesquisa científica e clínica. Por ser um método pouco invasivo e permitir coletas seriadas, a utilização de amostras sanguíneas facilita a análise da transcrição gênica. O maior desafio para a precisão nos ensaios moleculares é manter uma amostra com qualidade desde a coleta, armazenamento e transporte até o momento de sua análise. Este estudo utilizou um sistema de conservação de RNA sanguíneo que manteve amostras de qualidade após a coleta, transporte e armazenamento, permitindo extração de RNA e identificação da expressão do gene MDR1 em cavalos da raça Crioulo. Foram coletadas amostras sanguíneas de 27 cavalos a campo em tubos PAXgene® Blood RNA, que após o transporte e armazenamento a -20°C por 90 dias foram processadas em laboratório. A extração do RNA sanguíneo foi realizada com o kit Nucleo Spin® RNA II, a conversão em cDNA foi com o kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription, utilizando a fluorimetria para as avaliações. A identificação da expressão do gene MDR1 em sangue conservado utilizou primer específico para cDNA e PCR em tempo real. Houve extração de RNA em todas as amostras coletadas, sendo que as leituras das concentrações de RNA das amostras com DNA contaminante não tiveram diferença estatística das amostras sem DNA contaminante. Ocorreu amplificação do gene MDR1 a partir do RNA das amostras, independente de contaminação de DNA. A coleta de sangue venoso dos cavalos a campo com os tubos PAXgene foi realizada sem complicações. A amplificação do mRNA com primer específico para transcrito do gene MDR1, de amostras submetidas aos métodos de coleta, armazenamento e processamento executados neste trabalho, confirma que o mRNA extraído, com a metodologia descrita, é viável, sendo sua expressão identificada em leucócitos sanguíneos de equinos da raça Crioulo. / Efficient nucleic acid extraction methods are paramount for gene expression studies and applications in the scientific and clinical research. Whole blood samples provide material for gene transcription analysis allowing serial trials with a not much invasive procedure. Still, a major challenge for molecular assays accuracy and reliability is to maintain RNA stability during sample collection and storage. A whole blood collection system for RNA preservation was used during collection, transport and storage of samples intended for RNA extraction and identification of the MDR1 gene in Crioulo horses. The blood samples were obtained from 27 horses in the field using the PAXgene® Blood RNA tubes. After 2h transport at room temperature, the samples were stored at -20oC for 90 days before processing. RNA extraction was performed with the Nucleo Spin® RNA II kit and cDNA conversion carried out with the High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit. RNA concentration was determined by fluorometry. MDR1 gene expression was assessed using real time polymerase chain reaction (PCR) with a specific primer for cDNA. RNA was successfully extracted from all samples. Total RNA yield from DNA contaminated samples was not statistically different from those without DNA contamination. MDR1 gene amplification occurred regardless of DNA contamination. There were no complications during horse handling and blood sampling direct into PAXgene tubes in the field. Successful amplification of MDR1 gene transcript with a specific primer showed that blood samples collected, stored and processed under the described methodology provided viable mRNA for down-stream applications of molecular analyses. This study allowed the identification of the gene MDR1 in blood leucocytes of Crioulo horses.

Introdução: A sobrevivência em curto prazo dos transplantes renais tem melhorado notavelmente nas últimas duas décadas. No entanto, a sobrevivência em longo prazo de enxertos e pacientes ainda são muito inferiores ao desejado e a maioria dos enxertos são perdidos por falecimento dos receptores e deterioração crônica da função do enxerto. Acredita-se que a maior parte das lesões que resultam em encurtamento da sobrevida do enxerto se iniciam logo após o transplante e muitas vezes são subclínicas. O desenvolvimento de biomarcadores não invasivos para identificar com precisão as lesões sub-clínicas, sem a necessidade de biópsias de protocolo, seria um grande passo para a prática clínica de transplantes de órgãos, uma vez que permitiria o reconhecimento precoce de eventos de agressões ao enxerto e poderia levar a adequadas ações terapêuticas potencialmente propiciando sobrevida mais prolongada dos aloenxertos. Objetivos: O objetivo do presente estudo foi avaliar o potencial diagnóstico de agressões sub-clínicas da análise molecular não-invasiva da expressão gênica de leucócitos do sangue periférico em receptores de transplante renal com função estável em curto prazo. Métodos: Cento e trinta e seis pacientes renais com função estável do enxerto foram arrolados no estudo e realizaram biópsia protocolar no 3º mês póstransplante. Foram coletadas amostras de sangue periférico concomitantemente para realizarmos a quantificação da expressão gênica de perforina, TIM3, FOXP3, TGF-B, CTGF e CD138 através da metodologia de PCR em tempo real. Resultados: Trinta e nove pacientes foram diagnosticados com rejeição aguda (28,7%), sendo 33 destes com alterações borderline, 5 com rejeição aguda Banff IA e um paciente com rejeição Banff IB, vinte pacientes apresentaram fibrose intersticial e atrofia tubular (14,7%), sete apresentaram necrose tubular aguda (5,1%), três infecções pelo vírus do polioma (2,2%) e um caso de nefrotoxicidade aguda por inibidores da calcineurina (0,8%). A mensuração da expressão gênica foi realizada através de qPCR e os pacientes com disfunção do enxerto apresentaram expressões diminuídas de perforina, TIM3, FOXP3 e TGF-β em relação aos pacientes com rejeição aguda e histologia normal do enxerto. Outras análises demonstraram que a perforina, TIM3 e FOXP3 também são capazes de excluir o diagnóstico de rejeição aguda, com valores preditivos negativos (VPN) de 83%, 83% e 79,6%, respectivamente. Em uma análise combinada dos 3 genes associados o VPN para rejeição aguda foi de 86.4%. A avaliação do RNA mensageiro dos genes TGF-B e CTGF mostrou que eles estão hiperexpressos nos enxertos com fibrose intersticial e atrofia tubular. Conclusões: Existe uma elevada incidência de agressões sub-clínicas dos enxertos renais que podem ser detectadas por biópsias protocolares. A mensuração do RNA mensageiro, em amostras do sangue periférico, mostrou ser uma ferramenta de potencial utilidade em identificar essas agressões de forma não-invasiva. / Background: Short term survival of kidney transplants has improved remarkably over the last two decades. However, long term survival of grafts and patients are still much lower than desired and most of the grafts are lost by recipients’ death and chronic graft function deterioration. It is believed that most of the injuries that result in graft shortening survival are initiated early after transplantation and many times are subclinical. The development of noninvasive biomarkers to accurately identify sub-clinical injuries, without the need of protocol biopsies, would be a major step forward in the practice of clinical organ transplantation since it would allow the early recognition of graft insulting events and lead to proper therapeutic actions potentially leading to more prolonged allograft survivals Objective: The aim of the present study was to evaluate the diagnosis potential of the non-invasive molecular analyzes of peripheral blood leukocytes gene expression in stable kidney recipients in the short-term. Methods: One hundred and thirty-six patients were enrolled in this study and underwent protocol biopsies at 3 months after grafting. Peripheral blood samples were collected concomitantly for the gene expression quantitation of perforin, TIM3, FOXP3, TGF-B, CTGF and CD138 through qPCR methodology. Results: Thirty-nine patients were diagnosed as acute rejection (28.7%), being 33 with borderline histological changes, 5 Banff IA acute rejection and 1 patient with Banff IB acute rejection, twenty patients had interstitial fibrosis and tubular atrophy (14.7%), seven had acute tubular necrosis (5.1%), three had poliomavirus infection (2.2%) and one patient had calcineurin inhibitor toxicity (0.8%). Gene expression was measured through qPCR and patients with graft dysfunction presented lower expressions of perforin, TIM3, FOXP3 and TGF-β than patients with acute rejection and normal graft histology. Other analyzes showed that perforin, TIM3 and FOXP3 are also able to rule out acute rejection, with negative predictive values (NPV) of 83%, 83% and 79.6% respectively. In a combined analysis of the 3 genes associated the NPV was 86.4%. CTGF and TGF-B mRNA were overexpressed in grafts with interstitial fibrosis and tubular atrophy. Conclusions: An elevated incidence of sub-clinical injuries can be detected by protocol biopsies of stable grafts. The evaluation of mRNA in the peripheral blood has shown to be a potentially useful tool to uncover these injuries noninvasively.

Philosophiae Doctor - PhD (Biochemistry) / Human Retinoblastoma Binding Protein 6 (RBBP6) is a 200 kDa protein that has been implicated in a number of crucial cellular processes. It forms part of the mRNA 3'-end processing complex in both humans and yeast, and it contains an RS-like domain and interacts with core splicing proteins, suggesting multiple roles in mRNA processing. Through its RING finger domain it has been implicated in catalysing ubiquitination of the tumour suppressor p53, the oncogene Y-Box Binding Protein 1 (YB-1) and the DNA replication-associated protein zBTB38. It is one of only a few proteins known to bind to both p53 and pRb. At the N-terminus of the protein is the DWNN domain, an ubiquitin-like domain which is found only in this protein family. Four protein isoforms of RBBP6 have been identified in humans, all of which contain the DWNN domain: isoform 1 contains 1972 residues, isoform 2 contains 1758 residues and isoform 4 contains 952 residues. Isoform 3, which contains the first 101 residues of the full length protein (isoform 1), including the DWNN domain, followed by an unique 17-amino acid tail, is reported to be expressed independently of the other isoforms and to be down-regulated in a number of cancers.

abstract: Exome sequencing was used to identify novel variants linked to amyotrophic lateral sclerosis (ALS), in a family without mutations in genes previously linked to ALS. A F115C mutation in the gene MATR3 was identified, and further examination of other ALS kindreds identified an additional three mutations in MATR3; S85C, P154S and T622A. Matrin 3 is an RNA/DNA binding protein as well as part of the nuclear matrix. Matrin 3 interacts with TDP-43, a protein that is both mutated in some forms of ALS, and found in pathological inclusions in most ALS patients. Matrin 3 pathology, including mislocalization and rare cytoplasmic inclusions, was identified in spinal cord tissue from a patient carrying a mutation in Matrin 3, as well as sporadic ALS patients. In an effort to determine the mechanism of Matrin 3 linked ALS, the protein interactome of wild-type and ALS-linked MATR3 mutations was examined. Immunoprecipitation followed by mass spectrometry experiments were performed using NSC-34 cells expressing human wild-type or mutant Matrin 3. Gene ontology analysis identified a novel role for Matrin 3 in mRNA transport centered on proteins in the TRanscription and EXport (TREX) complex, known to function in mRNA biogenesis and nuclear export. ALS-linked mutations in Matrin 3 led to its re-distribution within the nucleus, decreased co-localization with endogenous Matrin 3 and increased co-localization with specific TREX components. Expression of disease-causing Matrin 3 mutations led to nuclear mRNA export defects of both global mRNA and more specifically the mRNA of TDP-43 and FUS. Our findings identify ALS-causing mutations in the gene MATR3, as well as a potential pathogenic mechanism attributable to MATR3 mutations and further link cellular transport defects to ALS. / Dissertation/Thesis / Doctoral Dissertation Neuroscience 2018

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA10MA063.pdf: 806269 bytes, checksum: d98ad588b52836b1be3fce9b0b39e24e (MD5) Previous issue date: 2010-12-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Embryo cryopreservation is an important tool that allows the storage of genetic material for long time, without loss of functional activity or genetic damage. Cryopreservation of in vivo-produced embryos is well established and provides similar results than those obtained after fresh embryos transfer. However, in vitro-produced (IVP) bovine embryos are easily damaged by conventional methods of cryopreservation, resulting in low survival rates after re-warming. Such sensitivity seems to be related to an excessive amount of lipid in the embryos cytoplasm during in vitro development. This might occur due to serum containing medium cultured embryos. Mechanical removal of lipid droplets can improve survival of early developmental stages embryos after cryopreservation. Nevertheless, delipidation method are laborious and time-consuming, besides altering embryo development after transfer to the recipients. Therefore, studies have searched for non invasive and less laborious techniques to reduce the amount of cytoplasmic lipids of bovine IVP embryos, thus improving their cryotolerance. Trans-10, cis-12 CLA, a conjugated isomer of linoleic can inhibit the fatty acid synthesis, thus decreasing the amount of lipid in several human and animal cells. It is known that lipid synthesis reduction involve down-regulation of mRNA expression of lipogenic enzymes associated with fat synthesis. Studies showed that addition of t10, c12 CLA to culture media, can reduce lipid content of bovine IVP embryos, improving their cryotolerance. Therefore, this study evaluated two CLA isomers on cryotolerance of IVP bovine embryos, as well as the enzymes acetyl-CoA carboxylase (ACCa), stearoyl-CoA desaturase (SCD1) and fatty acid synthase (FASN) mRNA expression of these embryos. In Experiment 1, embryos were cultured in media with increasing concentrations of trans-10, cis-12 CLA isomer: control group (0 μM), 50CLA group (50 μM), 100CLA group (100 μM) and 200CLA group (200 μM), looking for the higher concentration that does not negatively affect embryo development. In Experiment 2, zygotes were cultured in medium containing 100 μM (determined in Experiment 1) of different CLA isomers: control (CLA free) group, t10, c12 CLA group, c9, t11 CLA group and Mixture (50% c9, t11 CLA + 50% t10, c12) group. In Experiment 3, zygotes were allocated in 2 groups: CLA group, containing 100 μM of t10, c12 CLA isomer (determined in Experiment 2) and control (CLA free) group. Blastocysts were separated according to their stage (Bx or Bl) and subjected to vitrification or freezing. As viability criteria, cleavage and blastocyst rates were assessed after IVC and reexpanding and hatching rates were assessed after re-warming. Cell counting and mRNA expression of the ACCa, SCD1 and FASN enzymes were also assessed. The highest concentration of t10, c12 CLA that did not impair blastocyst rates was 100μM.In Experiment 2, the highest hatching rate after re-warming was obtained in c9, t11 group, vitrified at Bx stage (68.6%), not differing from the other treatments vitrified at this stage. The lowest hatching rate was obtained in Mixture group, vitrified at Bl stage (8.0%), not differing from the groups t10, c12 and c9, t11, vitrified at the same stage. In all treatments, Bx stage embryos showed higher viability than Bl stage embryos, except for the Control group, in whose the viability was similar. In Experiment 3, the highest hatching rate was obtained in Bx stage Control vitrified group (67.4%), which was similar to the Bx stage vitrified CLA group. The xv lowest hatching rate was observed in Bl stage frozen CLA group (10.3%), not differing from the other cryopreserved treatments at the same stage. In all frozen groups, despite CLA addition, hatching rates were all similar. There was also no difference in cell counting or mRNA expression of the enzymes ACCa, SCD1 and FASN, among embryos.Under the conditions of this study, the addition of CLA isomers t10, c12 and c9, t11 to culture media does not improve cryotolerance of IVP bovine embryos, and the isomer t10, c12 CLA does not influences the cell number and mRNA expression of enzymes ACCa, SCD1 and FASN / A criopreservação de embriões é uma importante ferramenta que permite o armazenamento de material genético por período prolongado, sem causar perda de atividade funcional ou alterações genéticas nessas estruturas. A criopreservação de embriões gerados in vivo está bem estabelecida e proporciona resultados muito próximos aos obtidos após a transferência de embriões frescos. Já os embriões bovinos produzidos in vitro (PIV) são extremamente sensíveis aos métodos convencionais de criopreservação, apresentando reduzidas taxas de sobrevivência após o reaquecimento. Essa sensibilidade parece estar relacionada ao acúmulo excessivo de lipídeos no citoplasma dos embriões durante o desenvolvimento in vitro, principalmente quando o cultivo é realizado em meios adicionados de soro. Estudos realizados com embriões em estágios iniciais de desenvolvimento evidenciaram que a remoção física das gotas lipídicas é capaz de aumentar a tolerância destes embriões à criopreservação. Contudo, o método de delipidação é demasiadamente trabalhoso e demorado, além de alterar o potencial de desenvolvimento dos embriões após a transferência para as receptoras. Dessa forma, os estudos têm buscado métodos não invasivos e menos trabalhosos, que reduzam a quantidade de lipídeos no citoplasma dos embriões bovinos PIV, melhorando assim a sua criotolerância. O trans-10, cis-12 CLA, um isômero conjugado do ácido linoleico, é capaz de inibir a síntese de ácidos graxos, diminuindo o teor lipídico em diversos tecidos de animais e humanos. Sabe-se que um dos mecanismos pelos quais este isômero exerce esse efeito é através da diminuição da expressão de RNAm de enzimas responsáveis pela síntese de lipídeos. Estudos mostraram que a adição do t10, c12 CLA ao meio de cultivo pode reduzir o acúmulo lipídico de embriões bovinos PIV, aumentando a sua criotolerância. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar o efeito dos dois principais isômeros do CLA na criotolerância de embriões bovinos PIV e adicionalmente a expressão de RNAm das enzimas acetil-CoA carboxilase (ACCa), estearoil-CoA dessaturase (SCD1) e ácido graxo sintase (FASN) desses embriões. No Experimento 1, embriões foram cultivados em meio com concentrações crescentes do isômero t10, c12 CLA: grupo controle (0 μM), grupo 50CLA (50 μM), grupo 100CLA (100 μM) e grupo 200CLA (200 μM), buscando a maior concentração que não afete o posterior desenvolvimento embrionário. No Experimento 2, os zigotos foram cultivados em meio com 100 μM, (concentração apontada no Experimento 1) de diferentes isômeros de CLA, sendo: grupo controle, sem adição de CLA, grupo t10, c12 CLA, grupo c9, t11 CLA e grupo Mistura, com 50% de cada isômero. No Experimento 3, os zigotos foram distribuídos em 2 grupos: grupo CLA, contendo 100 μM do isômero t10, c12 CLA (determinado no Experimento 2) e grupo controle, sem CLA. Os blastocistos obtidos foram separados em função do estágio (Bx ou Bl) e submetidos ao processo de vitrificação ou congelamento. Como critérios de viabilidade foram avaliados as taxas de clivagem e de blastocistos após o cultivo, e de re-expansão e eclosão após o reaquecimento. Ainda, foi determinada a densidade celular e a expressão de RNAm das enzimas ACCa, SCD1 e FASN destes embriões. A maior concentração de t10, c12 CLA que não reduziu a taxa de blastocistos foi a de 100μM. No Experimento 2, a maior taxa de eclosão após o reaquecimento foi a do grupo c9, t11 vitrificado no estágio de Bx xiii (68,6%), que não diferiu dos demais tratamentos vitrificados neste estágio. A menor taxa de eclosão foi a do grupo Mistura (c9, t11 + t10, c12, no estágio de Bl (8,0%), que não diferiu dos grupos t10, c12 e c9, t11, vitrificados no mesmo estágio. Em todos os tratamentos, embriões em estágio de Bx apresentaram taxas superiores aos Bl, com exceção do grupo Controle, cujas taxas foram similares. No Experimento 3, a maior taxa de eclosão foi observada no grupo Controle com Bx vitrificados (67,4%), que não diferiu do grupo CLA, com Bx vitrificados. A menor taxa de eclosão foi a do grupo CLA com Bl congelados (10,3%), que não diferiu dos demais tratamentos criopreservados neste estágio. Nos grupos submetidos ao congelamento, as taxas de desenvolvimento foram semelhantes, independente da exposição ao CLA. Não houve diferença na densidade celular entre os embriões expostos ou não ao t10, c12 CLA, e nem na expressão de RNAm das enzimas ACCa, SCD1 e FASN. Conclui-se que nas condições deste estudo a adição dos isômeros do CLA t10, c12 e c9, t11 ao meio de cultivo não melhora a criotolerância de embriões bovinos PIV, bem como que o isômero t10, c12 CLA, não interfere na densidade celular e na expressão de RNAm das enzimas ACCa, SCD1 e FASN destes embriões

Orientador: Renée Laufer Amorim / Resumo: A próstata canina é um bom modelo para estudos comparados entre o cão e o homem, uma vez que essas duas espécies desenvolvem espontaneamente carcinoma de próstata (CP). Para melhor caracterização do CP canino, a presente pesquisa foi dividia em quatro capítulos que avaliam diferentes aspectos dos CPs em cães. A atrofia inflamatória proliferativa (PIA) é uma lesão pré-neoplásica descritas em humanos e pouco estuda em cães. Nós caracterizamos essa lesão em cães e identificamos uma forte relação entre a localização topográfica da PIA com os CPs. Além disso, foi identificada a perda de expressão gênica e proteica de PTEN e AR na PIA. Esses fatores associados corroboram com o potencial pré-neoplásico desta lesão em cães. Um achado interessante foi a alta expressão de P63 na PIA e em um grupo de CP caninos. Para melhor caracterizar este grupo, foi avaliada a expressão imuno-histoquímica de diferentes citoqueratinas e outras proteínas relacionadas ao desenvolvimento do CP em humanos. Os carcinomas que apresentam expressão de P63 apresentaram padrões morfológicos com escore de Gleason alto e um fenótipo mais agressivo quando comparado à tumores que não apresentação expressão de P63. Posteriormente, a expressão gênica e proteica de E-caderina, NKX3.1 e C-MYC foi avaliada em CP como marcadores nas diferentes lesões. Além disso, nós avaliamos a metilação como mecanismo regulatórios dos genes CDH1 e NKX3.1. Foi possível identificar a perda de E-caderina e NKX3.1 nos tumores, comparado à ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The canine prostate gland can be used as a model to human prostatic disease since dogs and men are the only species that spontaneously develop prostate carcinoma (PC). To better characterize the canine PC, this research was divided into four chapters that evaluated different aspects of the PC in dogs. The proliferative inflammatory atrophy (PIA) is a pre-neoplastic lesion described in humans and few studies in dogs describe it as a preneoplastic lesion. This study characterized PIA in dogs and identified a strong relationship between the PIA topography with PC. In addition, we identified the loss of PTEN and AR expression in PIA. These findings demonstrated the potential of PIA as a preneoplastic lesion in dogs. An interesting finding in this research was the high expression of P63 in PIA and a group of PC. This study found a group of PC showing P63 positive expression in neoplastic epithelial cells. Thus, these tumors were selected to better characterize them using immunohistochemistry. These tumors had an aggressive phenotype and presented high expression of AKT and C-MYC and loss of NKX3.1. Further, we selected a usual group of PC and evaluate the expression of E-cadherin, NKX3.1 and C-MYC. In addition, we evaluated the methylation as a regulatory mechanism of CDH1 and NKX3.1 genes. We have identified loss of E-cadherin and NKX3.1 in PC compared to normal prostate and C-MYC overexpression. The expression of E-cadherin was related to overall survival and Gleason score. The ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Introdução: A sobrevivência em curto prazo dos transplantes renais tem melhorado notavelmente nas últimas duas décadas. No entanto, a sobrevivência em longo prazo de enxertos e pacientes ainda são muito inferiores ao desejado e a maioria dos enxertos são perdidos por falecimento dos receptores e deterioração crônica da função do enxerto. Acredita-se que a maior parte das lesões que resultam em encurtamento da sobrevida do enxerto se iniciam logo após o transplante e muitas vezes são subclínicas. O desenvolvimento de biomarcadores não invasivos para identificar com precisão as lesões sub-clínicas, sem a necessidade de biópsias de protocolo, seria um grande passo para a prática clínica de transplantes de órgãos, uma vez que permitiria o reconhecimento precoce de eventos de agressões ao enxerto e poderia levar a adequadas ações terapêuticas potencialmente propiciando sobrevida mais prolongada dos aloenxertos. Objetivos: O objetivo do presente estudo foi avaliar o potencial diagnóstico de agressões sub-clínicas da análise molecular não-invasiva da expressão gênica de leucócitos do sangue periférico em receptores de transplante renal com função estável em curto prazo. Métodos: Cento e trinta e seis pacientes renais com função estável do enxerto foram arrolados no estudo e realizaram biópsia protocolar no 3º mês póstransplante. Foram coletadas amostras de sangue periférico concomitantemente para realizarmos a quantificação da expressão gênica de perforina, TIM3, FOXP3, TGF-B, CTGF e CD138 através da metodologia de PCR em tempo real. Resultados: Trinta e nove pacientes foram diagnosticados com rejeição aguda (28,7%), sendo 33 destes com alterações borderline, 5 com rejeição aguda Banff IA e um paciente com rejeição Banff IB, vinte pacientes apresentaram fibrose intersticial e atrofia tubular (14,7%), sete apresentaram necrose tubular aguda (5,1%), três infecções pelo vírus do polioma (2,2%) e um caso de nefrotoxicidade aguda por inibidores da calcineurina (0,8%). A mensuração da expressão gênica foi realizada através de qPCR e os pacientes com disfunção do enxerto apresentaram expressões diminuídas de perforina, TIM3, FOXP3 e TGF-β em relação aos pacientes com rejeição aguda e histologia normal do enxerto. Outras análises demonstraram que a perforina, TIM3 e FOXP3 também são capazes de excluir o diagnóstico de rejeição aguda, com valores preditivos negativos (VPN) de 83%, 83% e 79,6%, respectivamente. Em uma análise combinada dos 3 genes associados o VPN para rejeição aguda foi de 86.4%. A avaliação do RNA mensageiro dos genes TGF-B e CTGF mostrou que eles estão hiperexpressos nos enxertos com fibrose intersticial e atrofia tubular. Conclusões: Existe uma elevada incidência de agressões sub-clínicas dos enxertos renais que podem ser detectadas por biópsias protocolares. A mensuração do RNA mensageiro, em amostras do sangue periférico, mostrou ser uma ferramenta de potencial utilidade em identificar essas agressões de forma não-invasiva. / Background: Short term survival of kidney transplants has improved remarkably over the last two decades. However, long term survival of grafts and patients are still much lower than desired and most of the grafts are lost by recipients’ death and chronic graft function deterioration. It is believed that most of the injuries that result in graft shortening survival are initiated early after transplantation and many times are subclinical. The development of noninvasive biomarkers to accurately identify sub-clinical injuries, without the need of protocol biopsies, would be a major step forward in the practice of clinical organ transplantation since it would allow the early recognition of graft insulting events and lead to proper therapeutic actions potentially leading to more prolonged allograft survivals Objective: The aim of the present study was to evaluate the diagnosis potential of the non-invasive molecular analyzes of peripheral blood leukocytes gene expression in stable kidney recipients in the short-term. Methods: One hundred and thirty-six patients were enrolled in this study and underwent protocol biopsies at 3 months after grafting. Peripheral blood samples were collected concomitantly for the gene expression quantitation of perforin, TIM3, FOXP3, TGF-B, CTGF and CD138 through qPCR methodology. Results: Thirty-nine patients were diagnosed as acute rejection (28.7%), being 33 with borderline histological changes, 5 Banff IA acute rejection and 1 patient with Banff IB acute rejection, twenty patients had interstitial fibrosis and tubular atrophy (14.7%), seven had acute tubular necrosis (5.1%), three had poliomavirus infection (2.2%) and one patient had calcineurin inhibitor toxicity (0.8%). Gene expression was measured through qPCR and patients with graft dysfunction presented lower expressions of perforin, TIM3, FOXP3 and TGF-β than patients with acute rejection and normal graft histology. Other analyzes showed that perforin, TIM3 and FOXP3 are also able to rule out acute rejection, with negative predictive values (NPV) of 83%, 83% and 79.6% respectively. In a combined analysis of the 3 genes associated the NPV was 86.4%. CTGF and TGF-B mRNA were overexpressed in grafts with interstitial fibrosis and tubular atrophy. Conclusions: An elevated incidence of sub-clinical injuries can be detected by protocol biopsies of stable grafts. The evaluation of mRNA in the peripheral blood has shown to be a potentially useful tool to uncover these injuries noninvasively.

Introdução: A rejeição aguda mediada por anticorpos (RAMA) representa atualmente uma importante limitação para o sucesso do transplante renal. Seu diagnóstico é complexo e impreciso e avaliações moleculares com o desenvolvimento de biomarcadores não invasivos podem representar métodos promissores para seu diagnóstico. O objetivo do estudo foi avaliar, em pacientes transplantados renais, a expressão de genes relacionados à rejeição medida por anticorpos e celular, em tecido renal e no sangue periférico. Métodos: Estudo transversal com 56 pacientes transplantados renais divididos nas seguintes categorias diagnósticas de acordo com a classificação Banff 2007: RAMA, rejeição aguda celular (RAC), necrose tubular aguda (NTA), RAMA+RAC e normal. Foi utilizada a técnica de PCR Real-Time para a quantificação relativa dos genes: CD20, CD138, Fator de von Willebrand (FVW), TIM-3 e FOXP-3. Resultados: Pacientes com RAMA apresentaram, tanto no tecido renal quanto no sangue periférico, transcritos de mRNA para CD20 e TIM-3 significativamente aumentados (P<0,01), em relação aos grupos NTA e normal. Outros resultados com expressão significativamente maior na RAMA em relação ao grupo normal foram FOXP-3 no sangue (P<0,01), CD138 na biópsia (P<0,01) e FWV na biópsia e no sangue (P<0,05). As curvas ROC demonstraram áreas sobre a curva (ASC) de 0,950 (P<0,001) para CD20 no sangue periférico. Utilizando o ponto de corte 6,0 obtevese sensibilidade 94% e especificidade 88% para o diagnóstico de RAMA. CD138 no tecido renal apresentou ASC de 0, 905 (P<0,001), e com ponto de corte 6,0 encontrou-se sensibilidade 91% e especificidade 85%. Conclusão: A expressão de CD20, tanto em tecido renal como no sangue periférico, e de CD138 no tecido foram significativamente maiores em pacientes com RAMA. Mais estudos poderão confirmar estes achados e possibilitar a utilização da expressão destes e de outros genes como biomarcadores para o diagnóstico de RAMA. / Introduction: Acute antibody mediated rejection (ABMR) is currently a major limitation to the success of renal transplantation. Its diagnosis is complex and inaccurate and the development of non-invasive biomarkers can represent promising methods for that. The aim of this study was to evaluate, in kidney transplant patients, the expression of genes related to the antibody mediated rejection and cellular, in renal tissue and peripheral blood. Methods: Crosssectional study with 56 kidney transplant patients divided into the following diagnostic categories according by the Banff 2007 classification: ABMR, acute cellular rejection (ACR), acute tubular necrosis (ATN), ACR+ABMR and normal. We used Real Time PCR to quantify relative expression of genes: CD20, CD138, von Willebrand factor (vWF), FOXP-3 and TIM-3. Results: Patients with ABMR presented, both in renal tissue and in peripheral blood, CD20 and TIM-3 mRNA transcripts significantly increased (P <0.01), in relation to groups ATN and normal. Other results with significantly higher expression in ABMR in relation to the normal group were FOXP-3 in the peripheral blood (P <0.01), CD138 in tissue (P <0.01) and vWF renal tissue and blood (P <0.05). The ROC curves demonstrated area under the curve (AUC) of 0.950 (P <0.001) for CD20 in peripheral blood. Using the 6.0 cutoff point was obtained 94% sensitivity and 88% specificity for the diagnosis of RAMA. CD138 in renal tissue showed AUC 0, 905 (P <0.001), and 6.0 cutoff point was found 91% sensitivity and specificity 85%. Conclusion: The expression of CD20, both in renal tissue and in peripheral blood, and CD138 in tissue were significantly higher in patients with ABMR. More studies can confirm these findings and enable the use of the expression of these and other genes as biomarkers for the diagnosis of ABMR.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Os objetivos deste estudo foram investigar o efeito de diferentes concentraÃÃes de jacalina e da interaÃÃo de jacalina e FSH sobre a sobrevivÃncia, ativaÃÃo e expressÃo gÃnica em folÃculos primordiais caprinos cultivados in vitro. Para isto, os fragmentos do cÃrtex ovariano foram cultivados em Meio Essencial MÃnimo (MEM) suplementado com diferentes concentraÃÃes de jacalina (0, 10, 25, 50 e 100 &#956;g/mL - experimento I), por um e seis dias. ApÃs o tÃrmino do perÃodo de cultivo, os fragmentos de cÃrtex ovariano foram fixados para histologia clÃssica. Em seguida, avaliou-se a percentagem de folÃculos primordiais ou em desenvolvimento no controle nÃo cultivado e no tecido ovariano cultivado nos diferentes tratamentos. ApÃs a determinaÃÃo da concentraÃÃo de jacalina mais eficiente (50 &#956;g/mL), realizou-se o cultivo de fragmentos de cÃrtex ovariano em MEM suplementado com a jacalina (50 &#956;g/mL), FSH (50 ng/mL) ou ambos (experimento II). ApÃs 6 dias de cultivo, os fragmentos ovarianos foram fixados para histologia clÃssica. AlÃm disso, para cada tratamento, foram coletadas amostras de tecido para avaliar o perfil de expressÃo de RNAs mensageiros para BMP-15, KL, c-kit, GDF-9 e PCNA em folÃculos ovarianos caprinos cultivado in vitro por 6 dias. Os resultados demonstraram que apÃs seis dias de cultivo, a presenÃa de 50 &#956;g/mL de jacalina no meio de cultivo promoveu um aumento de folÃculos morfologicamente normais, bem como uma reduÃÃo da percentagem de folÃculos primordiais e aumento de folÃculos em desenvolvimento, quando comparado ao meio controle. No experimento II, demonstrou-se que jacalina ou FSH estimulam a ativaÃÃo dos folÃculos e contribuem para a manutenÃÃo da viabilidade, mas nÃo foi observada uma interaÃÃo positiva entres essas duas substÃncias. A expressÃo de RNAm para a BMP-15 e KL apÃs o cultivo in vitro de fragmentos de ovÃrio nos diferentes tratamentos por 6 dias nÃo foi alterada. No entanto, a presenÃa de FSH aumentou os nÃveis de RNAm para o c-kit e para o PCNA, enquanto que o GDF-9 teve sua expressÃo reduzida em meio suplementado com jacalina. Em conclusÃo, jacalina e FSH foram capazes de promover a sobrevivÃncia e ativaÃÃo de folÃculos primordiais caprinos apÃs 6 dias de cultivo. A presenÃa de FSH aumentou a expressÃo do RNAm para PCNA e c-kit, enquanto que a presenÃa da jacalina reduziu a expressÃo do GDF-9. / The aims of this study were to investigate the effect of different concentrations of jacalin and the interaction of jacalin and FSH on survival, activation and gene expression of goat primordial follicles cultured in vitro. For this, fragments of ovarian cortex were cultured in Minimum Essential Medium (MEM) supplemented with different concentrations of jacalin (0, 10, 25, 50 and 100 mg/mL - experiment I) for one and six days. After the end of cultured period, the fragments of ovarian cortex were fixed for histology. Then, the percentage of primordial follicles in uncultured or cultured ovarian tissue in different treatments were evaluated. After determining the most effective concentration of jacalin (50 &#956;g/mL), ovarian cortex fragments were cultured in MEM supplemented with jacalin (50 &#956;g/ml), FSH (50 ng/ml) or both (experiment II). After 6 days of culture, the ovarian fragments were fixed for histology. Furthermore, for each treatment, tissue samples were collected to evaluate the expression profile of mRNA for c-kit, KL, GDF-9, BMP-15 and PCNA in goats ovarian follicles cultured in vitro for 6 days. The results showed that after six days of culture, the presence of 50 &#956;g/ml jacalin in culture medium increased the percentage of normal follicles, and promoted a reduction in the percentage of primordial follicles and increase of developing follicles, when compared to control medium. In experiment II, jacalin or FSH stimulated primordial follicle activation and contributed to maintain follicle viability, but there was no positive interaction between these two substances. The levels of mRNA for BMP-15 and KL after in vitro culture of ovarian fragments in different treatments was not altered. However, the presence of FSH increased levels of mRNA for c-kit and PCNA, while the GDF-9 expression was reduced in medium supplemented with jacalin. In conclusion, jacalin and FSH were able to promote the survival and activation of goat primordial follicles after 6 days of culture. The presence of FSH increased expression mRNA of PCNA and c-kit, while the presence of jacalin reduced the expression of GDF-9.