RIBEIRO, R.P. Efeito da lectina jacalina (artocarpus integrifolia) sobre a sobrevivência e ativação in vitro de folículos primordiais caprinos. 2013. 89 f. Dissertação (MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2013. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2017-09-01T13:14:04Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_rpribeiro.pdf: 973114 bytes, checksum: 26b8c3ca48857ad4fe2a0408971c17f5 (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2017-10-03T14:46:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_rpribeiro.pdf: 973114 bytes, checksum: 26b8c3ca48857ad4fe2a0408971c17f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-03T14:46:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_rpribeiro.pdf: 973114 bytes, checksum: 26b8c3ca48857ad4fe2a0408971c17f5 (MD5) Previous issue date: 2013 / The aims of this study were to investigate the effect of different concentrations of jacalin and the interaction of jacalin and FSH on survival, activation and gene expression of goat primordial follicles cultured in vitro. For this, fragments of ovarian cortex were cultured in Minimum Essential Medium (MEM) supplemented with different concentrations of jacalin (0, 10, 25, 50 and 100 mg/mL - experiment I) for one and six days. After the end of cultured period, the fragments of ovarian cortex were fixed for histology. Then, the percentage of primordial follicles in uncultured or cultured ovarian tissue in different treatments were evaluated. After determining the most effective concentration of jacalin (50 μg/mL), ovarian cortex fragments were cultured in MEM supplemented with jacalin (50 μg/ml), FSH (50 ng/ml) or both (experiment II). After 6 days of culture, the ovarian fragments were fixed for histology. Furthermore, for each treatment, tissue samples were collected to evaluate the expression profile of mRNA for c-kit, KL, GDF-9, BMP-15 and PCNA in goats ovarian follicles cultured in vitro for 6 days. The results showed that after six days of culture, the presence of 50 μg/ml jacalin in culture medium increased the percentage of normal follicles, and promoted a reduction in the percentage of primordial follicles and increase of developing follicles, when compared to control medium. In experiment II, jacalin or FSH stimulated primordial follicle activation and contributed to maintain follicle viability, but there was no positive interaction between these two substances. The levels of mRNA for BMP-15 and KL after in vitro culture of ovarian fragments in different treatments was not altered. However, the presence of FSH increased levels of mRNA for c-kit and PCNA, while the GDF-9 expression was reduced in medium supplemented with jacalin. In conclusion, jacalin and FSH were able to promote the survival and activation of goat primordial follicles after 6 days of culture. The presence of FSH increased expression mRNA of PCNA and c-kit, while the presence of jacalin reduced the expression of GDF-9. / Os objetivos deste estudo foram investigar o efeito de diferentes concentrações de jacalina e da interação de jacalina e FSH sobre a sobrevivência, ativação e expressão gênica em folículos primordiais caprinos cultivados in vitro. Para isto, os fragmentos do córtex ovariano foram cultivados em Meio Essencial Mínimo (MEM) suplementado com diferentes concentrações de jacalina (0, 10, 25, 50 e 100 μg/mL - experimento I), por um e seis dias. Após o término do período de cultivo, os fragmentos de córtex ovariano foram fixados para histologia clássica. Em seguida, avaliou-se a percentagem de folículos primordiais ou em desenvolvimento no controle não cultivado e no tecido ovariano cultivado nos diferentes tratamentos. Após a determinação da concentração de jacalina mais eficiente (50 μg/mL), realizou-se o cultivo de fragmentos de córtex ovariano em MEM suplementado com a jacalina (50 μg/mL), FSH (50 ng/mL) ou ambos (experimento II). Após 6 dias de cultivo, os fragmentos ovarianos foram fixados para histologia clássica. Além disso, para cada tratamento, foram coletadas amostras de tecido para avaliar o perfil de expressão de RNAs mensageiros para BMP-15, KL, c-kit, GDF-9 e PCNA em folículos ovarianos caprinos cultivado in vitro por 6 dias. Os resultados demonstraram que após seis dias de cultivo, a presença de 50 μg/mL de jacalina no meio de cultivo promoveu um aumento de folículos morfologicamente normais, bem como uma redução da percentagem de folículos primordiais e aumento de folículos em desenvolvimento, quando comparado ao meio controle. No experimento II, demonstrou-se que jacalina ou FSH estimulam a ativação dos folículos e contribuem para a manutenção da viabilidade, mas não foi observada uma interação positiva entres essas duas substâncias. A expressão de RNAm para a BMP-15 e KL após o cultivo in vitro de fragmentos de ovário nos diferentes tratamentos por 6 dias não foi alterada. No entanto, a presença de FSH aumentou os níveis de RNAm para o c-kit e para o PCNA, enquanto que o GDF-9 teve sua expressão reduzida em meio suplementado com jacalina. Em conclusão, jacalina e FSH foram capazes de promover a sobrevivência e ativação de folículos primordiais caprinos após 6 dias de cultivo. A presença de FSH aumentou a expressão do RNAm para PCNA e c-kit, enquanto que a presença da jacalina reduziu a expressão do GDF-9.

A convergência entre a biotecnologia e a nanotecnologia tem levado ao desenvolvimento de novos nanobiocompósitos híbridos com funções sinérgicas que incorporam as propriedades de reconhecimento dos biomateriais com as propriedades eletrônicas, ópticas e catalíticas únicas das nanopartículas. Apesar do recente desenvolvimento na síntese de nanobiocompósitos, a aplicação biomédica destes materiais ainda apresenta muitos desafios, já que não apenas uma conjugação apropriada é requerida, mas também outros importantes aspectos relacionados à biocompatibilidade. O presente trabalho tem como objetivo expandir o campo da síntese e caracterização de nanoparticulas funcionalizadas com biomoléculas. Em especial, visamos o entendimento e caracterização das interações entre nanopartículas de ouro (AuNPs) e proteínas, por meio do estudo de dois sistemas distintos: AuNPs funcionalizadas com Jacalina, e AuNPs funcionalizadas com a proteína BeCen1. No primeiro sistema, o interesse advém da capacidade da lectina Jacalina de reconhecer o dissacarídeo (Galβ1-3GalNAc) associado a tumores. Neste caso, AuNPs formadas na presença do dendrímero poli(amidoamina) geração 4.0 (PAMAM G4) foram conjugadas com a Jacalina marcada com o fluóroforo Isotiocianato de fluoresceína (FITC). A formação do complexo AuNP-PAMAM G4/Jacalina foi confirmada por Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM), Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS), Espectroscopia de Absorção no UV-VIS e vibracional (FTIR). A interação entre as AuNP-PAMAM G4 e a Jacalina parece ser um processo dirigido por entropia com afinidade moderada e formação de complexo, segundo os resultados de Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) e supressão da fluorescência. Os resultados de Dicroísmo Circular (CD) mostraram que a conjugação da Jacalina com as AuNP-PAMAM G4 não alterou sua estrutura secundária. Testes realizados em cultura de células revelaram que o complexo apresenta maior afinidade e citotoxicidade pelas células de carcinoma do colo de útero humano (HeLa) se comparadas com fibroblastos saudáveis de adipócitos de camundongo (L929). Estes resultados são relevantes uma vez que demonstram o potencial do complexo AuNP-PAMAM G4/Jacalina-FTIR para aplicações biomédicas incluindo diagnóstico e tratamento de câncer. O segundo sistema é interessante devido a habilidade da proteína BeCen1 em formar filamentos nanométricos em função da temperatura. As AuNPs foram formadas na presença da proteína utilizando ácido fórmico diluído como agente redutor e o excesso de proteína foi separado por Cromatografia de Exclusão Molecular. Análises de CD revelaram uma pequena diminuição no conteúdo de α-hélices, confirmado por FTIR, o que pode estar relacionado à interação das AuNPs com os grupamentos amida desta proteína. Medidas de espalhamento de luz revelaram um aumento da turbidez da suspensão do complexo AuNP-BeCen1 com o aumento da temperatura e imagens de TEM, com e sem aquecimento, confirmaram uma mudança de padrão no arranjo das AuNPs. Estes resultados revelam a possibilidade de fabricação de nanobiocompósitos termorresponsivos, o que pode ser muito importante para aplicações em nanodispositivos. / The convergence between biotechnology and nanotechnology has led to the development of new hybrid nanocomposites that conjugate the bio-recognization properties of biomaterials and the unique electronic, optic and catalytic properties of the nanoparticles. Despite the recent advances in the development of nanobiocomposites, the biomedical applications of these materials are still limited, among other factors, by the low efficiency of functionalization and biocompatibility. The present study was aimed at developing proteinconjugated nanoparticles for application in nanomedicine. Our main focus were the understanding and characterization of the interactions between proteins and gold nanoparticles (AuNPs), which was accomplished using two distinct systems, viz.: Jacalin-functionalized AuNPs, and Becen1-functionalized AuNPs. In the former, the interest is due the capability of the protein Jacalin of recognize the disaccharide (Galβ1-3GalNAc), largely expressed in some tumors cells. AuNPs were synthesized in the presence of the polyamido amine generation 4.0 (PAMAM G4) and conjugated with a Jacalin target with the fluorescein isothiocyanate (FITC). The excess of protein was removed by centrifugation and the complex formation was confirmed by Transmission Electron Microscopy (TEM), Dynamic Light Scattering (DLS), UV-VIS Absorption and Vibrational Spectroscopy (FTIR). The interactions between AuNP-PAMAM G4 and Jacalin seemed to be driven by an entropic process with moderate affinity and complex formation, as revealed by Isothermal Titration Calorimetry (ITC) and quenching fluorescence measurements. Furthermore, Circular Dichroism (CD) analyses revealed that protein maintained its secondary structure upon conjugation with the nanoparticles. In vitro tests revealed that the AuNPs/Jacalin complexes presented higher affinity and cytotoxicity against human cervical cancer cell (HeLa) compared to healthy mouse fibroblasts (L929). These results are relevant, since the AuNP-PAMAM G4/Jacalin-FITC complex may be used for biomedical applications including cancer treatment and diagnostics. The second nanocomplex, comprising AuNPs and BeCen1, was chosen due to the ability of BeCen 1 to polymerize in the form of nanometric filaments as a function of temperature. The AuNPs were formed in the presence of the protein using diluted formic acid as reducing agent and the excess of protein was removed by Molecular Exclusion Chromatography. CD analysis showed a decrease in the -helix structures confirmed by FTIR, which may be related to the interaction between the AuNPs and the amide groups of the protein. Light scattering measurements revealed an increase in the turbidity of the dispersions upon increasing the temperature, indicating a change in the arrangement of the AuNPs. Such BeCen-1 induced alignment was confirmed by TEM images. The latter results point to the possibility of fabrication of novel thermoresponsive nanobiocomposites, which are of great relevance for nanodevices applications.

A convergência entre a biotecnologia e a nanotecnologia tem levado ao desenvolvimento de novos nanobiocompósitos híbridos com funções sinérgicas que incorporam as propriedades de reconhecimento dos biomateriais com as propriedades eletrônicas, ópticas e catalíticas únicas das nanopartículas. Apesar do recente desenvolvimento na síntese de nanobiocompósitos, a aplicação biomédica destes materiais ainda apresenta muitos desafios, já que não apenas uma conjugação apropriada é requerida, mas também outros importantes aspectos relacionados à biocompatibilidade. O presente trabalho tem como objetivo expandir o campo da síntese e caracterização de nanoparticulas funcionalizadas com biomoléculas. Em especial, visamos o entendimento e caracterização das interações entre nanopartículas de ouro (AuNPs) e proteínas, por meio do estudo de dois sistemas distintos: AuNPs funcionalizadas com Jacalina, e AuNPs funcionalizadas com a proteína BeCen1. No primeiro sistema, o interesse advém da capacidade da lectina Jacalina de reconhecer o dissacarídeo (Galβ1-3GalNAc) associado a tumores. Neste caso, AuNPs formadas na presença do dendrímero poli(amidoamina) geração 4.0 (PAMAM G4) foram conjugadas com a Jacalina marcada com o fluóroforo Isotiocianato de fluoresceína (FITC). A formação do complexo AuNP-PAMAM G4/Jacalina foi confirmada por Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM), Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS), Espectroscopia de Absorção no UV-VIS e vibracional (FTIR). A interação entre as AuNP-PAMAM G4 e a Jacalina parece ser um processo dirigido por entropia com afinidade moderada e formação de complexo, segundo os resultados de Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) e supressão da fluorescência. Os resultados de Dicroísmo Circular (CD) mostraram que a conjugação da Jacalina com as AuNP-PAMAM G4 não alterou sua estrutura secundária. Testes realizados em cultura de células revelaram que o complexo apresenta maior afinidade e citotoxicidade pelas células de carcinoma do colo de útero humano (HeLa) se comparadas com fibroblastos saudáveis de adipócitos de camundongo (L929). Estes resultados são relevantes uma vez que demonstram o potencial do complexo AuNP-PAMAM G4/Jacalina-FTIR para aplicações biomédicas incluindo diagnóstico e tratamento de câncer. O segundo sistema é interessante devido a habilidade da proteína BeCen1 em formar filamentos nanométricos em função da temperatura. As AuNPs foram formadas na presença da proteína utilizando ácido fórmico diluído como agente redutor e o excesso de proteína foi separado por Cromatografia de Exclusão Molecular. Análises de CD revelaram uma pequena diminuição no conteúdo de α-hélices, confirmado por FTIR, o que pode estar relacionado à interação das AuNPs com os grupamentos amida desta proteína. Medidas de espalhamento de luz revelaram um aumento da turbidez da suspensão do complexo AuNP-BeCen1 com o aumento da temperatura e imagens de TEM, com e sem aquecimento, confirmaram uma mudança de padrão no arranjo das AuNPs. Estes resultados revelam a possibilidade de fabricação de nanobiocompósitos termorresponsivos, o que pode ser muito importante para aplicações em nanodispositivos. / The convergence between biotechnology and nanotechnology has led to the development of new hybrid nanocomposites that conjugate the bio-recognization properties of biomaterials and the unique electronic, optic and catalytic properties of the nanoparticles. Despite the recent advances in the development of nanobiocomposites, the biomedical applications of these materials are still limited, among other factors, by the low efficiency of functionalization and biocompatibility. The present study was aimed at developing proteinconjugated nanoparticles for application in nanomedicine. Our main focus were the understanding and characterization of the interactions between proteins and gold nanoparticles (AuNPs), which was accomplished using two distinct systems, viz.: Jacalin-functionalized AuNPs, and Becen1-functionalized AuNPs. In the former, the interest is due the capability of the protein Jacalin of recognize the disaccharide (Galβ1-3GalNAc), largely expressed in some tumors cells. AuNPs were synthesized in the presence of the polyamido amine generation 4.0 (PAMAM G4) and conjugated with a Jacalin target with the fluorescein isothiocyanate (FITC). The excess of protein was removed by centrifugation and the complex formation was confirmed by Transmission Electron Microscopy (TEM), Dynamic Light Scattering (DLS), UV-VIS Absorption and Vibrational Spectroscopy (FTIR). The interactions between AuNP-PAMAM G4 and Jacalin seemed to be driven by an entropic process with moderate affinity and complex formation, as revealed by Isothermal Titration Calorimetry (ITC) and quenching fluorescence measurements. Furthermore, Circular Dichroism (CD) analyses revealed that protein maintained its secondary structure upon conjugation with the nanoparticles. In vitro tests revealed that the AuNPs/Jacalin complexes presented higher affinity and cytotoxicity against human cervical cancer cell (HeLa) compared to healthy mouse fibroblasts (L929). These results are relevant, since the AuNP-PAMAM G4/Jacalin-FITC complex may be used for biomedical applications including cancer treatment and diagnostics. The second nanocomplex, comprising AuNPs and BeCen1, was chosen due to the ability of BeCen 1 to polymerize in the form of nanometric filaments as a function of temperature. The AuNPs were formed in the presence of the protein using diluted formic acid as reducing agent and the excess of protein was removed by Molecular Exclusion Chromatography. CD analysis showed a decrease in the -helix structures confirmed by FTIR, which may be related to the interaction between the AuNPs and the amide groups of the protein. Light scattering measurements revealed an increase in the turbidity of the dispersions upon increasing the temperature, indicating a change in the arrangement of the AuNPs. Such BeCen-1 induced alignment was confirmed by TEM images. The latter results point to the possibility of fabrication of novel thermoresponsive nanobiocomposites, which are of great relevance for nanodevices applications.

O polissacarídeo quitosana é usado em aplicações biológicas, tais como entrega de drogas e engenharia de tecidos como matriz para o crescimento celular, devido à sua biocompatibilidade e biodegradabilidade. Uma das suas utilizações mais frequentes é na forma de membranas obtidas por casting com poli (etileno glicol) (PEG). Neste trabalho, membranas de quitosana-PEG foram modificadas e otimizadas com filmes nanoestruturados de concanavalina A (Con A) e jacalina. O processo de purificação não afetou as propriedades da quitosana, tais como cristalinidade, tamanho de cristalitos, grupos funcionais e grau de acetilação. A única exceção foi a diminuição da massa molecular, provavelmente pela quebra de cadeias por adição de ácido acético à solução. As membranas fabricadas com mistura de quitosana e PEG exibiram superfície mais rugosa, porosa, com energia de superfície mais elevada do que aquelas com quitosana pura. Misturas com 20 e 30% de PEG foram testadas, sendo as que contêm 20% mais adequadas para a funcionalização, devido ao maior tamanho dos poros, de acordo com imagens de microscopia de força atômica. Na funcionalização das membranas de quitosana-PEG com proteínas, o objetivo é obter a cobertura mais uniforme com maior energia de superfície. No processo de otimização, a deposição do filme nanoestruturado de proteína foi confirmada com PM-IRRAS, espectroscopia de fluorescência e dicroísmo circular, e a energia de superfície foi calculada usando o modelo de Owens- Wendt-Rabel-Kaelble a partir dos ângulos de contato para diferentes líquidos. Para Con A e jacalina, propriedades otimizadas foram obtidas com a menor concentração de proteína testada, 0,1 mg/mL, para um tempo de adsorção de 90 minutos. Além disso, o filme de jacalina levou à maior energia de superfície, ou seja, 56,7 mJ/m², comparado com 55,9 mJ/m² para amostras modificadas com Con A. Além disso, sob essas condições de otimização, a atividade da proteína foi mantida por 4 semanas para membranas armazenadas a 4ºC. Portanto, as membranas funcionalizadas são promissoras para crescimento celular e aplicações de engenharia de tecidos / The polysaccharide chitosan is used in various biological applications such as drug delivery and especially in tissue engineering as a matrix for cell growth due to its biocompatibility and biodegradability. One of its most frequent uses is in the form of membranes made via casting blended with poly(ethylene glycol) (PEG). In this work, chitosan-PEG membranes were optimized and modified with nanostructured films of concanavalin A (Con A) and jacalin. The purification process did not affect the chitosan properties, such as crystallinity, crystallite size, functional groups and degree of acetylation. The only exception was a decrease in the molecular mass, probably owing to chain scission by addition of acetic acid to the solution. The membranes made with chitosan and PEG exhibited a rougher, porous surface, with higher surface energy than those with neat chitosan. Blends with 20 and 30% PEG were tested, and those with 20% were considered as more suitable for functionalization owing to the larger size of the pores, according to atomic force microscopy images. The functionalization of the chitosan-PEG membranes with the proteins is aimed at achieving the most uniform coverage with the highest surface energy. In the optimization procedure, the deposition of the protein nanostructured film was confirmed with PM-IRRAS, fluorescence spectroscopy and circular dichroism, while the surface energy was calculated using the Owens-Wendt-Rabel-Kaelble model and the measured contact angles for several liquids. For both Con A and jacalin, optimized properties were obtained with the lowest protein concentration tested, viz. 0.1 mg/mL, for an adsorption time of 90 min. Furthermore, the jacalin film led to the highest surface energy, namely 56.7 mJ/m², to be compared with 55.9 mJ/m² for samples modified with Con A. Under these optimized conditions, the protein activity was kept for ca. 4 weeks if the coated membranes were stored at 4ºC. Therefore, the functionalized membranes are promising for cell growth and tissue engineering applications

Orientador: Prof. Dr. Alexandre Zatkovskis Carvalho / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2015. / A jacalina é uma lectina extraída da semente da jaca (Artocarpus heterophyllus), capaz de reconhecer resíduos de galactose, aglutinando de forma específica alguns tipos celulares, tendo sua aplicação bem estabelecida no isolamento da imunoglobulina A (IgA). Nosso grupo de pesquisa tem interesse no desenvolvimento de métodos e dispositivos econômicos e de fácil uso para separação e purificação de proteínas. Nesse sentido, o presente estudo teve como objetivo avaliar e otimizar a purificação da jacalina através de cromatografia de afinidade, empregando duas fases estacionárias diferentes. A montagem de colunas cromatográficas utilizando esferas baseadas na formação de hidrogéis de alginato de cálcio com goma guar mostrou-se inviável devido à perda da reticulação sofrida pelas esferas durante a etapa de lavagem da coluna. No entanto, a utilização de fibras de nylon grafitadas com goma guar a 0,5% como fase estacionária mostrou ser eficiente na purificação da jacalina. De acordo com a literatura, a quantidade de jacalina no extrato proteico bruto da semente de jaca é de aproximadamente 56%. Considerando esses valores, a técnica cromatográfica utilizando o nylon foi capaz de reter cerca de 75% do total de jacalina presente no extrato bruto. Também foram otimizadas as condições para análise da jacalina através de eletroforese capilar. A técnica se mostrou mais rápida e eficiente no intuito de caracterizar a jacalina quando comparada a eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Portanto, a cromatografia de afinidade utilizando fibras de nylon grafitadas com goma guar como suporte mostrou ser uma técnica simples, rápida e eficiente na purificação da lectina jacalina. / Jacalin is a lectin, extracted from jackfruit seeds (Artocarpus heterophyllus), which is able to recognize galactose residues, specifically agglutinating some cell types, and useful for isolation of immunoglobulin A (IgA). Our research group is interested in developing inexpensive and uncomplicated methods and devices for separation and purification of proteins. In this sense, the present study aimed to evaluate and optimize the purification of jacalin by affinity chromatography, employing two different stationary phases. Stationary phase based on calcium alginate hydrogels with guar gum showed impracticable columns due to reticulation losses. On the other hand, the use of nylon fibers graphited with guar gum 0.5% as stationary phase proved to be efficient to purify jacalin. As described in the literature, the amount of jacalin in the crude extract of jackfruit seeds is approximately 56%. Considering these values, the chromatographic technique using nylon was able to retain approximately 75% of jacalina from crude extract. Finally, experimental conditions were optimized for analysis of jacalin by means of capillary electrophoresis. This technique proved to be faster and more efficiently in order to characterize the jacalin if compared to electrophoresis on polyacrylamide gel system (SDS-PAGE). Therefore, affinity chromatography using nylon fibers graphited with guar gum as support proved to be a simple, fast and efficient technique for the purification of jacalin lectin.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Os objetivos deste estudo foram investigar o efeito de diferentes concentraÃÃes de jacalina e da interaÃÃo de jacalina e FSH sobre a sobrevivÃncia, ativaÃÃo e expressÃo gÃnica em folÃculos primordiais caprinos cultivados in vitro. Para isto, os fragmentos do cÃrtex ovariano foram cultivados em Meio Essencial MÃnimo (MEM) suplementado com diferentes concentraÃÃes de jacalina (0, 10, 25, 50 e 100 μg/mL - experimento I), por um e seis dias. ApÃs o tÃrmino do perÃodo de cultivo, os fragmentos de cÃrtex ovariano foram fixados para histologia clÃssica. Em seguida, avaliou-se a percentagem de folÃculos primordiais ou em desenvolvimento no controle nÃo cultivado e no tecido ovariano cultivado nos diferentes tratamentos. ApÃs a determinaÃÃo da concentraÃÃo de jacalina mais eficiente (50 μg/mL), realizou-se o cultivo de fragmentos de cÃrtex ovariano em MEM suplementado com a jacalina (50 μg/mL), FSH (50 ng/mL) ou ambos (experimento II). ApÃs 6 dias de cultivo, os fragmentos ovarianos foram fixados para histologia clÃssica. AlÃm disso, para cada tratamento, foram coletadas amostras de tecido para avaliar o perfil de expressÃo de RNAs mensageiros para BMP-15, KL, c-kit, GDF-9 e PCNA em folÃculos ovarianos caprinos cultivado in vitro por 6 dias. Os resultados demonstraram que apÃs seis dias de cultivo, a presenÃa de 50 μg/mL de jacalina no meio de cultivo promoveu um aumento de folÃculos morfologicamente normais, bem como uma reduÃÃo da percentagem de folÃculos primordiais e aumento de folÃculos em desenvolvimento, quando comparado ao meio controle. No experimento II, demonstrou-se que jacalina ou FSH estimulam a ativaÃÃo dos folÃculos e contribuem para a manutenÃÃo da viabilidade, mas nÃo foi observada uma interaÃÃo positiva entres essas duas substÃncias. A expressÃo de RNAm para a BMP-15 e KL apÃs o cultivo in vitro de fragmentos de ovÃrio nos diferentes tratamentos por 6 dias nÃo foi alterada. No entanto, a presenÃa de FSH aumentou os nÃveis de RNAm para o c-kit e para o PCNA, enquanto que o GDF-9 teve sua expressÃo reduzida em meio suplementado com jacalina. Em conclusÃo, jacalina e FSH foram capazes de promover a sobrevivÃncia e ativaÃÃo de folÃculos primordiais caprinos apÃs 6 dias de cultivo. A presenÃa de FSH aumentou a expressÃo do RNAm para PCNA e c-kit, enquanto que a presenÃa da jacalina reduziu a expressÃo do GDF-9. / The aims of this study were to investigate the effect of different concentrations of jacalin and the interaction of jacalin and FSH on survival, activation and gene expression of goat primordial follicles cultured in vitro. For this, fragments of ovarian cortex were cultured in Minimum Essential Medium (MEM) supplemented with different concentrations of jacalin (0, 10, 25, 50 and 100 mg/mL - experiment I) for one and six days. After the end of cultured period, the fragments of ovarian cortex were fixed for histology. Then, the percentage of primordial follicles in uncultured or cultured ovarian tissue in different treatments were evaluated. After determining the most effective concentration of jacalin (50 μg/mL), ovarian cortex fragments were cultured in MEM supplemented with jacalin (50 μg/ml), FSH (50 ng/ml) or both (experiment II). After 6 days of culture, the ovarian fragments were fixed for histology. Furthermore, for each treatment, tissue samples were collected to evaluate the expression profile of mRNA for c-kit, KL, GDF-9, BMP-15 and PCNA in goats ovarian follicles cultured in vitro for 6 days. The results showed that after six days of culture, the presence of 50 μg/ml jacalin in culture medium increased the percentage of normal follicles, and promoted a reduction in the percentage of primordial follicles and increase of developing follicles, when compared to control medium. In experiment II, jacalin or FSH stimulated primordial follicle activation and contributed to maintain follicle viability, but there was no positive interaction between these two substances. The levels of mRNA for BMP-15 and KL after in vitro culture of ovarian fragments in different treatments was not altered. However, the presence of FSH increased levels of mRNA for c-kit and PCNA, while the GDF-9 expression was reduced in medium supplemented with jacalin. In conclusion, jacalin and FSH were able to promote the survival and activation of goat primordial follicles after 6 days of culture. The presence of FSH increased expression mRNA of PCNA and c-kit, while the presence of jacalin reduced the expression of GDF-9.

O polissacarídeo quitosana é usado em aplicações biológicas, tais como entrega de drogas e engenharia de tecidos como matriz para o crescimento celular, devido à sua biocompatibilidade e biodegradabilidade. Uma das suas utilizações mais frequentes é na forma de membranas obtidas por casting com poli (etileno glicol) (PEG). Neste trabalho, membranas de quitosana-PEG foram modificadas e otimizadas com filmes nanoestruturados de concanavalina A (Con A) e jacalina. O processo de purificação não afetou as propriedades da quitosana, tais como cristalinidade, tamanho de cristalitos, grupos funcionais e grau de acetilação. A única exceção foi a diminuição da massa molecular, provavelmente pela quebra de cadeias por adição de ácido acético à solução. As membranas fabricadas com mistura de quitosana e PEG exibiram superfície mais rugosa, porosa, com energia de superfície mais elevada do que aquelas com quitosana pura. Misturas com 20 e 30% de PEG foram testadas, sendo as que contêm 20% mais adequadas para a funcionalização, devido ao maior tamanho dos poros, de acordo com imagens de microscopia de força atômica. Na funcionalização das membranas de quitosana-PEG com proteínas, o objetivo é obter a cobertura mais uniforme com maior energia de superfície. No processo de otimização, a deposição do filme nanoestruturado de proteína foi confirmada com PM-IRRAS, espectroscopia de fluorescência e dicroísmo circular, e a energia de superfície foi calculada usando o modelo de Owens- Wendt-Rabel-Kaelble a partir dos ângulos de contato para diferentes líquidos. Para Con A e jacalina, propriedades otimizadas foram obtidas com a menor concentração de proteína testada, 0,1 mg/mL, para um tempo de adsorção de 90 minutos. Além disso, o filme de jacalina levou à maior energia de superfície, ou seja, 56,7 mJ/m², comparado com 55,9 mJ/m² para amostras modificadas com Con A. Além disso, sob essas condições de otimização, a atividade da proteína foi mantida por 4 semanas para membranas armazenadas a 4ºC. Portanto, as membranas funcionalizadas são promissoras para crescimento celular e aplicações de engenharia de tecidos / The polysaccharide chitosan is used in various biological applications such as drug delivery and especially in tissue engineering as a matrix for cell growth due to its biocompatibility and biodegradability. One of its most frequent uses is in the form of membranes made via casting blended with poly(ethylene glycol) (PEG). In this work, chitosan-PEG membranes were optimized and modified with nanostructured films of concanavalin A (Con A) and jacalin. The purification process did not affect the chitosan properties, such as crystallinity, crystallite size, functional groups and degree of acetylation. The only exception was a decrease in the molecular mass, probably owing to chain scission by addition of acetic acid to the solution. The membranes made with chitosan and PEG exhibited a rougher, porous surface, with higher surface energy than those with neat chitosan. Blends with 20 and 30% PEG were tested, and those with 20% were considered as more suitable for functionalization owing to the larger size of the pores, according to atomic force microscopy images. The functionalization of the chitosan-PEG membranes with the proteins is aimed at achieving the most uniform coverage with the highest surface energy. In the optimization procedure, the deposition of the protein nanostructured film was confirmed with PM-IRRAS, fluorescence spectroscopy and circular dichroism, while the surface energy was calculated using the Owens-Wendt-Rabel-Kaelble model and the measured contact angles for several liquids. For both Con A and jacalin, optimized properties were obtained with the lowest protein concentration tested, viz. 0.1 mg/mL, for an adsorption time of 90 min. Furthermore, the jacalin film led to the highest surface energy, namely 56.7 mJ/m², to be compared with 55.9 mJ/m² for samples modified with Con A. Under these optimized conditions, the protein activity was kept for ca. 4 weeks if the coated membranes were stored at 4ºC. Therefore, the functionalized membranes are promising for cell growth and tissue engineering applications

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Lectins are proteins that bind specifically to carbohydrates and have important role in modulation of the immune response. KM+ and Jacalin (JAC) are lectins from the seeds from jackfruit (Artocarpus integrifolia) and ScLL is a lectin from the Synadenium carinatum latex. Neospora caninum is an apicomplexan parasite that causes neuromuscular disease in dogs and reproductive disorders in cattle, with serious economic impact on the livestock industry. The immunestimulatory role of plant lectins has been investigated in several parasitic infections, but not in neosporosis. This study aimed to evaluate the adjuvant effect and the immunestimulatory potential of KM+, JAC and ScLL in immunization of mice against neosporosis. C57BL 6 mouse groups were subcutaneously immunized three times at 15-day intervals with Neospora lysate antigen (NLA) associated with lectins (NLA+KM, NLA+JAC and NLA+ScLL groups), NLA alone, lectins alone (KM, JAC and ScLL groups), and PBS group (infection control). Animals were challenged with Nc-1 isolate (2x107 tachyzoites) and evaluated for morbidity, mortality, specific antibody response, cytokine production by spleen cells, cerebral parasite burden and histopathological lesions. Serological assays demonstrated higher levels of IgG to N. caninum for NLA+KM and NLA+ScLL than NLA+JAC and NLA groups. NLA+KM group induced higher levels of IgG2a isotype whereas NLA+ScLL induced higher levels of IgG1 isotype. In all groups, IgG1 response was higher than IgG2a response before and after challenge, but the IgG2a/IgG1 ratio increased after challenge in NLA+KM, NLA+ScLL and KM groups. Cytokine production after in vitro antigenic stimulation showed that NLA+KM induced high levels of IFN-g and IL-10, presenting the highest IFN-g/IL-10 ratio, followed by NLA+ScLL group, indicating a pattern of immune response toward Th1 type. NLA+JAC induced low levels of these cytokines and the lowest IFN-g/IL-10 ratio in relation to other groups, indicating a profile of Th2 type immune response. After parasite challenge, NLA+KM mice showed the highest survival with low brain parasite burden and moderate tissue inflammation, whereas NLA+ScLL mice presented intermediate survival with low brain parasite burden and low scores of morbidity and inflammation. NLA+JAC group exhibited intermediate survival, but with the highest brain parasite burden and mild inflammation. In conclusion, KM+ and ScLL lectins showed suitable adjuvant effect by increasing NLA immunogenicity and immunostimulatory role by conferring partial protection of mice immunized and challenged with lethal dose of N. caninum, while the JAC lectin showed no adequate adjuvant effect in the immunization against neosporosis. / Lectinas são proteínas que se ligam especificamente a carboidratos e possuem importantes papéis na modulação da resposta imune. KM+ e Jacalina (JAC) são lectinas da semente da jaca (Artocarpus integrifolia) e ScLL é uma lectina do látex da planta Synadenium carinatum. Neospora caninum é um parasito do filo Apicomplexa que causa doença neuromuscular em cães e desordens reprodutivas em bovinos, causando sério impacto econômico na indústria agropecuária. O papel imunoestimulador de lectinas de plantas tem sido investigado em diversas infecções parasitárias, mas não na neosporose. Esse estudo teve como objetivo avaliar o efeito adjuvante e o potencial imunoestimulador de KM+, JAC e ScLL na imunização de camundongos contra a neosporose. Grupos de camundongos C57BL/6 foram imunizados subcutaneamente por três vezes, em intervalos de quinze dias, com o antígeno de lisado total de Neospora (NLA) associado com as lectinas (grupos NLA+KM, NLA+JAC, NLA+ScLL), NLA somente, lectinas somente (KM, JAC e ScLL), além do grupo PBS (controle da infecção). Os animais foram desafiados com isolado Nc-1 (2x107 taquizoítas) e avaliados quanto aos escores de morbidade, mortalidade, resposta imune humoral específica, produção de citocinas por células do baço, carga parasitária cerebral e lesões histopatológicas. Resultados sorológicos demonstraram maiores níveis de IgG anti N. caninum produzidos pelos animais dos grupos NLA+KM e NLA+ScLL que NLA+JAC e NLA somente. O grupo NLA+KM induziu maiores níveis do isotipo IgG2a, enquanto NLA+ScLL induziu maiores níveis do isotipo IgG1. Em todos os grupos, a resposta de IgG1 foi maior do que de IgG2a antes e após o desafio, porém a razão IgG2a/IgG1 aumentou após o desafio nos grupos NLA+KM, NLA+ScLL e KM. A produção de citocinas após o estímulo antigênico in vitro demonstrou que NLA+KM induziu altos níveis de IFN-g e IL-10, apresentando a maior razão IFN-g/IL-10, seguido pelo grupo NLA+ScLL, indicando um padrão de resposta imune direcionado ao perfil Th1. NLA+JAC induziu baixos níveis destas citocinas e menor razão IFN-g/IL-10 em relação aos demais grupos, indicando um padrão de resposta imune do tipo Th2. Após o desafio com o parasito, camundongos do grupo NLA+KM apresentaram a maior sobrevida com baixa carga parasitária cerebral e moderada inflamação tecidual, enquanto animais imunizados com NLA+ScLL apresentaram sobrevida intermediária com baixa carga parasitária cerebral e baixos escores de morbidade e inflamação. O grupo NLA+JAC exibiu sobrevida intermediária, mas com alta carga parasitária cerebral e suave inflamação. Em conclusão, as lectinas KM+ e ScLL mostraram ser adjuvantes satisfatórios por aumentar a imunogenicidade do NLA e apresentaram efeito imunoestimulador por conferir proteção parcial dos camundongos imunizados e desafiados com dose letal de N. caninum, enquanto a lectina Jacalina não produziu efeito adjuvante suficiente na imunização contra a neosporose. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Application of Taenia saginata metacestodes as alternative antigen is an important alternative for neurocysticercosis (NC) serodiagnosis. The cross reaction with Echinococcus granulosus infection occurred in homologous and heterologous antigens, and could be avoid with different purified methods. This study analyzed antigen fractions obtained from crude saline extract of T. saginata metacestodes purified by affinity chromatography with the lectin jacalin (unbound and bound fraction), concanavalin A (unbound and bound fraction), concanavalin A using jacalina unbound fraction (unbound and bound fraction) and N-acetil (unbound and bound fraction). The fraction were tested for the detection of IgG antibodies by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and immunoblot for the laboratory diagnosis of human NC. The application of T. saginata metacestodes as an alternative antigen for use in ELISA and WB tests compared with the metacestodes antigen of Taenia solium in CFS samples was also analyzed. Serum samples were obtained from 142 individuals: 40 were diagnosed with NC, 62 presented Taenia sp. and other parasitic diseases and 40 were apparently healthy individuals. The CSF samples were obtained from 35 patients with definitive neurocysticercosis; and 35 patients with other neurological disorder. Among the fractions, unbound concanavalin A demonstrated statically higher sensitivity and specificity by ELISA (90% and 93.1 %, respectively). By Immunoblot, the concanavalin unbound showed 100% of sensitivity and specificity, where only serum samples from patients with NC recognized the protein of 64-68 kDa, so this antigen fraction may be used as specific antigen for diagnosis of NC. The sensitivity and specificity of ELISA using antigen obtained from T. solium applied to CSF samples results of 100%. When the tests were conducted using T. saginata metacestodes, results were 100% and 94.3%, respectively. The 47-52, 64-68 and 70 kDa antigens were recognized by only CSF samples from patients with NC. The results indicated that T. saginata metacestodes can be used as alternative antigen for NC diagnosis using LCR samples. / A utilização de metacestódeos de Taenia saginata como antígeno alternativo constitui uma importante ferramenta no sorodiagnóstico da neurocisticercose humana (NC). A reatividade cruzada com indivíduos infectados por Echinococcus granulosus é comum em antígenos homólogos e heterólogos, podendo ser evitada com diferentes métodos de purificação. O presente estudo analisou as diferentes frações antigênicas obtidas, a partir do extrato salino total de metacestódeos de T. saginata, por cromatografia de afinidade em coluna de Jacalina (fração ligante e não ligante), de Concanavalina A (fração ligante e não ligante), de Concanavalina A utilizando a fração não ligante de Jacalina (fração ligante e não ligante) e Coluna de N-acetil (fração ligante e não ligante). As frações foram avaliadas quanto a detecção de anticorpos IgG anti-metacestódeos de Taenia solium nos testes ELISA e Immunoblotting. Foi avaliada a utilização do extrato salino total de metacestódeos de T. saginata como antígeno alternativo nos testes ELISA e Immunoblotting para detecção de anticorpos IgG no LCR. Foram obtidas 142 amostras de soro, sendo 40 de pacientes com diagnóstico definitivo de NC, 62 de indivíduos infectados por Taenia sp e por outros parasitos e 40 de indivíduos saudáveis. Foram coletadas 70 amostras de LCR, sendo 35 de pacientes com diagnóstico definitivo de NC e 35 de indivíduos com outras manifestações neurológicas. Entre todas as frações analisadas, a fração não ligante de Concanavalina A demonstrou maior sensibilidade e especificidade pelo teste ELISA em amostras de soro (90% e 93,1%, respectivamente). Pelo Immunoblotting esta mesma fração demonstrou 100% de sensibilidade e especificidade, sendo que apenas pacientes com NC reconheceram a banda especifica de 64-68 kDa, indicando que esta fração antigênica pode se usada como antígeno especifico no sorodiagnóstico da NC humana. A sensibilidade e especificidade do teste ELISA utilizando o antígeno homólogo no LCR humano foi de 100%. Quando este teste foi conduzido com o antígeno heterólogo obteve-se 100% de sensibilidade e 94,3% de especificidade. Na reação de Immunoblotting as bandas antigênicas de 47-52, 64-68 e 70 kDa foram reconhecidas exclusivamente no LCR de pacientes com NC. Os resultados conferem ao extrato salino de T. saginata sensibilidade e especificidade para ser utilizado como antígeno alternativo para o diagnostico da NC no LCR. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas