Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El cáncer mamario es la neoplasia que se presenta con mayor frecuencia en la hembra canina reproductivamente entera. Diversos investigadores han demostrado que lovastatina exhibe un efecto antitumoral in vitro sobre diversas líneas celulares neoplásicas humanas, sin embargo, su potencial efecto aún no ha sido evaluado sobre células de carcinoma mamario canino. Lovastatina inhibe a la enzima hidroxi-metil-glutaril coenzima A (HMG-CoA) reductasa, bloqueando la biosíntesis de colesterol y de sus isoprenoides farnesil pirofosfato (FPP) y geranil-geranil pirofosfato (GGPP), importantes mediadores de algunas vías de transducción de señales asociadas a sobrevida celular. El objetivo de este estudio fue determinar los efectos de lovastatina sobre la proliferación, invasión y apoptosis de células de carcinoma mamario canino CF41.Mg. Se cultivaron células CF41.Mg y se trataron con lovastatina (0-20 μM) por diferentes tiempos. Luego, se evaluó viabilidad celular (método de reducción de MTS), invasión celular (método Transwell) y apoptosis (ensayo de Anexina V/Yoduro de Propidio). Lovastatina indujo una disminución significativa en la viabilidad celular (p ≤ 0.05), efecto que fue dependiente de su concentración y el tiempo. La invasión celular fue inhibida en respuesta a concentraciones no citotóxicas de lovastatina (p ≤ 0.05). Además, esta droga ejerció un efecto pro-apoptótico dependiente del tiempo (p ≤ 0.05). Estos resultados demuestran que lovastatina cumpliría un importante papel sobre la proliferación y capacidad invasiva de células de carcinoma mamario canino CF41.Mg, lo cual sustenta futuros estudios clínicos con esta droga / Mammary cancer is the tumor that occurs most frequently in the reproductively intact female dog. Several researchers have shown that lovastatin exhibits an in vitro antitumor effect on various human neoplastic cell lines, however, its potential effect has not yet been evaluated in canine mammary carcinoma cells. Lovastatin inhibits HMG-CoA reductase, blocking the biosynthesis of cholesterol and its isoprenoids FPP and GGPP, important mediators of some signal transduction pathways associated with cell survival. The aims of this study were to determine the effects of lovastatin on the proliferation, invasion and apoptosis of canine mammary carcinoma cells CF41.Mg. CF41.Mg cells were cultured and treated with lovastatin (0-20 μM) for different times. Then, cell viability (MTS reduction method), cell invasion (Transwell method) and apoptosis (Annexin V/Propidium Iodide assay) were evaluated. Lovastatin induced a significant decrease in cell viability (p ≤ 0.05), an effect that was dependent on its concentration and time. Cell invasion was inhibited in response to non-cytotoxic concentrations of lovastatin (p ≤ 0.05). In addition, lovastatin exerted a pro-apoptotic effect dependent on time (p ≤ 0.05). These results demonstrate that lovastatin would play an important role in the proliferation and invasive capacity of canine mammary carcinoma cells CF41.Mg, which supports future clinical studies with this drug / Proyecto Fondecyt 11110148

Investigaciones en nuestro y otros laboratorios han demostrado que la hormona 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3) modula los niveles de Ca2+ intracelular en células de músculo esquelético y tejido óseo por un mecanismo genómico, característico de hormonas esteroideas en el cual la hormona interacciona con un receptor intracelular específico (VDR: vitamin D receptor). Esta molécula exhibe una localización citoplásmica/nuclear, siendo el complejo hormona-receptor el responsable de la regulación de la expresión de genes portadores de elementos de respuesta a VDR. Sin embargo, 1,25(OH)2D3 modula también los niveles de Ca2+ intracelular a través de un mecanismo rápido, no genómico, independiente de la transcripción génica y de la síntesis proteica que implica acciones directas del esteroide sobre la membrana celular. Las acciones rápidas, no nucleares de 1,25(OH)2D3 requieren la activación de varios sistemas de señalización (adenilil ciclasa/AMPc/PKA; PLC/DAG/IP3/Ca2+/PKC), integrados en un mecanismo complejo que involucra proteínas G, interacción positiva entre las vías PKA y PKC e incremento en la fosforilación de proteínas de membrana. En conjunto, estos eventos conducen a una rápida y transitoria liberación de Ca2+ de los depósitos internos y activación de canales de Ca2+ dependientes de voltaje (VDCC) tipo L, con el consecuente influjo sostenido de Ca2+ desde el medio extracelular. En el presente trabajo empleando el indicador fluorescente de Ca2+ Fura-2, se caracterizaron los efectos de la hormona 1,25(OH)2D3 sobre los niveles de Ca2+ citosólico en cultivos de osteoblastos de rata. Estos estudios pusieron de manifiesto que la fase de influjo de Ca2+ inducido por 1,25(OH)2D3 es mediada por los canales VDCC ya caracterizados, indicando además que existe una contribución parcial a la entrada de Ca2+ mediada por canales no dependientes de voltaje operados por el nivel de Ca2+ de los depósitos internos. Se introduce así el novedoso concepto sobre la participación de canales SOC (Store Operated Channels; CCE: Capacitative Ca2+ Entry ) en la respuesta rápida de Ca2+ a la hormona. A partir de este hallazgo, estudiamos y caracterizamos esta entrada capacitativa de cationes en líneas celulares derivadas de epitelio mamario y de cáncer mamario, ambas de origen humano. Estos canales, activados por depleción y/o movilización de Ca2+ de depósitos internos, independientes de voltaje y regulados por múltiples eventos de señalización intracelular, estarían constituídos por proteínas de la familia de genes TRP, originalmente descriptos en células fotoreceptoras de Drosophila (mutantes trp: Transient Receptor Potential). Sus genes han sido clonados, secuenciados y su funcionalidad como canales responsables del influjo de Ca2+ tipo SOC, ha sido demostrada mediante expresión de proteínas TRP en sistemas heterólogos. Además, en el sistema fototransductor de Drosophila, TRP forma parte de un complejo de señalización multiproteico junto con RH1 (rodopsina), NORPA (PLC específica de células fotoreceptoras), INAC (PKC específica de células fotoreceptoras) y una proteína adaptadora (scaffold protein) denominada INAD (Inactivation No After potential D) responsable de asociar todos los componentes en un complejo. INAD posee dominios PDZ, responsables de su función adaptadora mediante interacciones proteína-proteína. Recientes estudios bioquímicos, moleculares y electrofisiológicos, sugieren que INAD representa una subunidad constitutiva del canal TRP con función adaptadora en la formación del complejo supramolecular de señalización. Esta organización multiproteica de los componentes de señalización proporciona las bases estructurales para una eficiente y rápida activación y regulación de la entrada de Ca2+ a través de canales TRP. Se describieron recientemente homólogos de INAD en distintos tipos de células de vertebrados, donde se observó que cumplen función adaptadora en la formación de complejos de señalización integrados por receptores hormonales, canales iónicos y quinasas. En este trabajo mostramos evidencias de una proteína homóloga a INAD en osteoblastos de rata y su participación en el influjo capacitativo. En síntesis, en la presente Tesis Doctoral se muestran evidencias de influjo capacitativo de calcio en distintos tipos celulares, habiendo caracterizado este influjo y estudiado exhaustivamente la modulación de cationes en el interior celular. Particularmente en osteoblastos, un sistema íntimamente relacionado con el metabolismo del calcio, demostramos la única evidencia existente sobre modulación de canales SOC por un esteroide y más precisamente, la participación de proteínas TRP e INAD asociadas a este mecanismo fisiológico vinculado a la homestasis de cationes intracelulares. / Evidences from our laboratory and others have demonstrated that the hormone 1,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25(OH)2D3) modulates intracellular Ca2+ levels in skeletal muscle cells and bone tissue through a genomic mechanism, typical for steroidal hormones via specific an intracellular receptor (VDR: Vitamin D Receptor). Such molecule exhibits a cytoplasmatic-nuclear localization and the hormone-receptor complex is responsible for gene expression regulation of VDR responsive elements. Nevertheless, 1,25(OH)2D3 also modulates intracellular Ca2+ levels through a non genomic, rapid mechanism, independent of gene transcription and protein synthesis, implying direct steroid actions on the cellular membrane. Rapid or non genomic actions of 1,25(OH)2D3 requires the activation of diverse signal systems (adenylyl cyclase/cAMP/PKA; PLC/DAG/IP3/Ca2+/PKC), forming a complex mechanism that involves G proteins, positive interaction between PKA and PKC and increased protein phosphorylation. Altogether, these events lead to a rapid and transient Ca2+ release from internal stores and activation of Voltage Dependent Ca2+ Channels (VDCC) type L, followed by a sustained Ca2+ influx from the extracellular medium. In the present work by using the fluorescent Fura-2 Ca2+ dye, the effect of 1,25(OH)2D3 hormone on cytosolic Ca2+ levels in rat osteoblast cells were characterized. We have demonstrated that the 1,25(OH)2D3-induced Ca2+ influx phase is mediated by the well known VDCC channels and also that a Ca2+ partial entry contribution may occur by a non voltage dependent channels and operated by the status of internal Ca2+ stores. In this way we introduce a novel concept of SOC channels (Store Operated Channels; Capacitative Ca2+Entry) in rapid response of Ca2+ for the hormone. Accordingly, we have studied and characterized the capacitative cation entry in other cellular system derived from breast epithelium and breast cancer, both from human origen. These channels, activated by depletion and/or Ca2+ mobilization from internal stores, voltage independent and regulated by multiple intracellular signal events, involve proteins encoded by the trp family genes, first described in photoreceptor cells from Drosophila (mutants in trp: Transient Receptor Potential). Trp genes have been cloned and sequenced, their functionality as channels responsible from Ca2+ influx type SOC has been demonstrated through heterologous expression of TRP proteins. In addition, in Drosophila photoreceptor system, TPR is part of a multiproteic signal complex together with RH1 (rhodopsin), NORPA (PLC specific of photoreceptor cells), INAC (PKC specific of photoreceptor cells) and a scaffold protein named INAD (Inactivation No After potential D) responsible for the association of all components into a complex. INAD exhibits PDZ domains, responsible of its adaptor function through protein-protein interaction. Recently several biochemical, molecular and electrophysiologycal studies, suggests that INAD represents a constitutive subunit of TRP channels with an adaptor function in the supramolecular signaling complex assemble. This multiproteic organization of the signaling components provides the structural basis for an efficient and rapid activation and regulation of Ca2+ entry through TRP channels. INAD homologous sequences have been recently described in different vertebrate cells types, whereas it has been observed that plays scaffolding functions allowing the assembly of a complex composed by hormone receptors, ion channels and kinases. We demonstrated the presence of an INAD homologous protein in rat osteoblasts and its relationship to the capacitative Ca2+ influx. In summary, the present Doctoral Thesis describes the capacitative calcium entry in different cell types. We have characterized this influx and exhaustively studied the intracellular cation modulation. In particular, we have focused our efforts on osteoblast cells, a system closely dependant on calcium metabolism, and present the first evidence of SOC channels modulation by a steroid hormone and more precisely, the involvement of TRP and INAD proteins associated to this physiological mechanism in the control of intracellular Ca2+ homeostasis.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Patología Animal. / Introducción. El cáncer mamario es el tipo de tumor más prevalente en la hembra canina. Información reciente demuestra que simvastatina exhibe un efecto antitumoral in vitro e induce autofagia sobre diversas líneas celulares neoplásicas. Sin embargo, no hay evidencia de que ocurra en células de carcinoma mamario canino. La autofagia es un proceso catabólico que permite a las células sobrevivir bajo condiciones de estrés metabólico, cumpliendo un rol dual en cáncer asociado a supresión y promoción tumoral dependiendo del contexto celular. En ese contexto, la autofagia jugaría un rol en la sobrevida y muerte de células tumorales en respuesta a agentes antitumorales. El objetivo de este estudio fue analizar los efectos de simvastatina sobre la autofagia y la viabilidad de células de carcinoma mamario canino CF41.Mg. Materiales y métodos. Células CF41. Mg fueron cultivadas y tratadas con simvastatina (1 y 5 M) por 24 horas y analizadas mediante citometría de flujo utilizando naranja de acridina. Se analizó la expresión de LC3 y beclina-1 en células tratadas con simvastatina y 3-metiladenina (inhibidor de autofagia) mediante inmunocitoquímica. Adicionalmente, se realizó un ensayo de viabilidad celular mediante el método de exclusión de azul tripan con células tratadas con simvastatina en presencia de Q-VD-OPh (inhibidor de apoptosis) y 3-metiladenina. Resultados Tanto la actividad autofágica como la expresión de LC3 y beclina-1 fueron inducidas por simvastatina (p<0.05). Estos efectos fueron revertidos por 3-metiladenina. Simvastatina inhibió la viabilidad celular en forma significativa, aún en presencia de 3-metiladenina (p<0.05). Q-VD-OPh bloqueó el efecto antiproliferativo desencadenado por simvastatina. Conclusiones El efecto antiproliferativo de simvastatina sobre células de carcinoma mamario canino CF41.Mg no es dependiente de la autofagia inducida por la misma droga. La citotoxicidad de simvastatina se explica casi completamente por la activación de caspasas / Introduction Mammary cancer is the most prevalent type of tumor in the female dogs. Recent data shows that simvastatin exhibit an antitumor effect in vitro and it is able to induce autophagy in some neoplastic cell lines. However, there is still no evidence in canine mammary cancer cells. Autophagy is a mayor catabolic process that allows the cells to survive under metabolic stress, performing a dual role in cancer associated to tumor suppression/progression depending on cellular context. Under this context, the autophagy may play a role in the survival and death of tumoral cell in response to anti-tumoral agents. The object of this study was to analyze the effects of simvastatin over the autophagy and viability of canine mammary carcinoma cells CF41.Mg. Materials and methods CF41.Mg cells were treated with simvastatin (1 y 5 M) for 24 hours and analyzed by flow cytometry using acridine orange dye. The expression of LC3 and beclin-1 in cells treated with simvastatin/3-methyladenine (autophagy inhibitor) by immunocytochemistry was analyzed. Cell proliferation assays with trypan blue dye in presence of simvastatin, Q-VD-OPh hydrate (pancaspase inhibitor) and 3-methyladenine were performed. Results Both autophagy activity and LC3/beclin-1 expression were induced by simvastatin (p<0.05). These effects were reversed by 3-methyladenine. This statin inhibited the cell viability, even in the presence of 3-methyladenine (p<0.05). Q-VD-OPh hydrate blocked the anti-proliferative effect of simvastatin. Conclusions The anti-proliferative effect of simvastatin over canine mammary carcinoma cells CF41.Mg it’s non-depending of the autophagy induced by the drug. The cytotoxicity of simvastatin it’s explained almost completely by the caspases activation / Financiamiento: Proyecto Fondecyt No. 11110148.

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias . / La neoplasia mamaria es la patología tumoral de mayor frecuencia de presentación en la hembra canina. Dado que las terapias disponibles son limitadas, no selectivas y pueden desencadenar potenciales efectos adversos, se hace necesario estudiar nuevas alternativas de tratamiento antitumoral más inocuas e idealmente selectivas. El extracto comercial derivado de la planta Solanum dulcamara L -BIRM- ha sido usado empíricamente para una amplia variedad de enfermedades, incluyendo cáncer. Sin embargo, hay escasos estudios que revelan su potencial antitumoral. BIRM induce un efecto antiproliferativo y pro-apoptótico sobre células de carcinoma de próstata humana, especialmente en células andrógeno-dependientes, donde disminuye la expresión y promueve la degradación del receptor de andrógenos (RA). Ya que sobre el 80% de las neoplasias mamarias caninas de alto grado histológico exhiben la presencia del RA, pareció interesante analizar si BIRM induce también efectos antiproliferativos sobre células de carcinoma mamario canino CF41.Mg, línea celular representativa de tumores mamarios de alto grado. Con este objeto, se estudió proliferación, capacidad clonogénica y potencial citotóxico de dichas células en presencia de BIRM. Complementariamente, se analizó el efecto del extracto sobre la habilidad de estas células para migrar e invadir. BIRM disminuyó la proliferación celular y capacidad clonogénica de las células estudiadas, efectos que fueron dependientes de la concentración. Afín a estos resultados, el extracto indujo un arresto en G0/G1. BIRM no es selectivo, dado que disminuyó también la proliferación de células no tumorales MDCK. Adicionalmente, BIRM indujo apoptosis y una disminución significativa en la migración e invasión de células CF41.Mg. Estos resultados demuestran que BIRM, induce un efecto antiproliferativo y anti-invasivo sobre células de carcinoma mamario canino y sustenta la idea que este representaría un potencial agente terapéutico para el manejo del cáncer mamario canino. / Mammary tumors are the most frequent oncologic pathology in the female dog. Since available therapies are limited, non-selective and may trigger potential adverse effects, it`s becomes necessary to study new, harmless and ideally selective antitumor treatment alternatives. Commercial herbal extract derived from Solanum DulcamaraL -BIRM- has been used empirically for a wide variety of diseases, including cancer. However, there are few studies that reveal its antitumor potential. BIRM induces an antiproliferative and pro-apoptotic effect on human prostate carcinoma cells, especially in androgen-dependent cells, where it decreases expression and promotes androgen receptor (AR) degradation. Since over 80% of high histological grade canine mammary tumors exhibit the presence of RA, it appeared interesting to analyze whether BIRM also induces antiproliferative effects on CF41.Mg canine mammary carcinoma cells, a cell line representative of high grade mammary tumors. For this purpose, proliferation, clonogenic capacity and potential cytotoxicity were studied in the presence of BIRM. In addition, the effect of the extract on the ability of CF41.Mg cells to migrate and invade was analyzed. BIRM decreased cell proliferation and clonogenic ability of the cells studied, effects that were concentration-dependent. In parallel, the extract induced an arrest in G0/G1. BIRM is not selective, since the proliferation of non-tumoral MDCK cells also decreased in presence of herbal extract. Moreover, BIRM induced apoptosis and a significant decrease in the migration and invasion of CF41.Mg. cells. These results demonstrate that BIRM induces an antiproliferative and anti-invasive effect on canine mammary carcinoma cells and, supports the idea that it would represent a potential new therapeutic agent for the management of canine mammary cancer.

Recientemente ha comenzado a surgir evidencia que relaciona a p300 con el cáncer. Sin embargo, aún no está claro cuál es el rol de la proteína en esta patología ya que hay evidencia que indica que puede funcionar como un supresor tumoral o como una oncoproteína. La información disponible sobre la relación entre p300 y el carcinoma mamario está basada generalmente en estudios en líneas celulares siendo escasos los trabajos en modelos animales o utilizando biopsias humanas. En este trabajo de tesis se pudo demostrar que la inhibición de la actividad acetilasa de p300 disminuye la supervivencia celular de las líneas LM3 y MDA-MB-231 e induce apoptosis en la línea celular LM3. Además se demostró que dicha inhibición disminuye la migración celular de las líneas LM3 y MDA-MB-231 y disminuye la invasión celular y la formación de lamelipodios en la línea celular LM3. En el modelo murino de trasplante singeneico de células LM3 se demostró que la inhibición de p300 reduce la carga tumoral, la invasión a la cavidad abdominal y el número de metástasis pulmonares. La reducción del tamaño tumoral fue acompañada de una disminución del índice mitótico y de los niveles de Ki-67 y de un incremento de la expresión de Bax. Al estudiar la expresión de p300 en el modelo murino transgénico MMTV-PymT y en el de carcinogénesis inducida con DMBA en rata se observó que p300 se encuentra altamente expresado y en una localización citoplasmática en las células del tumor comparado con las de la glándula mamaria normal. Además se observó que parte del p300 citoplasmático se encuentra en estructuras con características de agresomas en las células tumorales de un cultivo primario derivado de este último modelo animal, pero no en las células normales del mismo cultivo. En biopsias humanas de carcinomas mamarios se ha podido demostrar una mayor expresión de p300 en tejidos tumorales que en las zonas histológicamente normales adyacentes al tumor y que en el tejido mamario no maligno. También se detectó la inusual localización citoplasmática de p300 en los tejidos malignos y se pudo demostrar que esta localización se asocia con un menor tamaño tumoral, menor tasa de recaída y mayor sobrevida global de las pacientes y en los tumores triple negativos también con menor estadio tumoral. En conjunto, los resultados de esta tesis sugieren que la acción oncogénica de p300 se realiza en el núcleo a través de su acción sobre la regulación de la transcripción génica y que al ser trasladado al citoplasma esta acción no puede realizarse porque está fuera del núcleo, porque además en el citoplasma es degradado y/o secuestrado en agresomas y posiblemente también por que ejerce nuevas funciones específicas de su ubicación citoplasmática que pueden tener efectos antitumorales. También indican que la localización de p300 puede ser de potencial interés como factor pronóstico y señalan la necesidad de continuar investigando los mecanismos celulares y moleculares que la desregulación de esta proteína podría estar afectando, contribuyendo así al desarrollo del cáncer de mama. / Recently, an increasing body of evidence indicates that p300 could play a role in cancer. Nonetheless, the role of the protein in this disease remains unclear, since there is evidence indicating that it can function both as a tumor suppressor and as an oncoprotein. The available information about the relationship between p300 and breast carcinoma is usually based on studies in cell lines although there have been few studies using animal models or human biopsies. In this thesis we demonstrated that the inhibition of the p300 acetyltransferase activity decreases cellular viability in LM3 and MDA-MB-231 cell lines and induces apoptosis in LM3 cell line. Furthermore, we demonstrated that p300 inhibition reduces cellular invasion in LM3 and MDA-MB-231 cell lines and decreases the invasiveness and lamellipodium formation in LM3 cells. In a syngeneic murine model of subcutaneous transplantation of LM3 cells, we demonstrated that inhibition of p300 reduces tumor burden, tumor invasion into the abdominal cavity and lung metastases. This reduction in tumor burden was accompanied by a decrease in the mitotic index and Ki-67 levels and an increase in Bax expression. When we have studied the expression of p300 in the MMTV-PymT transgenic murine model and in the DMBA-induced rat model, we observed stronger expression and a cytoplasmic localization in the tumor cells in comparison with normal mammary glands. In addition, we have observed that cytoplasmic p300 is partially localized in aggresome-like structures in tumor- but not in normal mammary gland-derived primary cell cultures from the rat animal model. Moreover, the analysis of p300 expression in human breast cancer samples showed that p300 immunoreactivity is significantly higher in the cancerous tissues than in the non-malignant mammary tissues and in the histologically normal adjacent tissues. Interestingly, p300 was observed in the cytoplasm, and María Eugenia Fermento Página 9 the rate of cytoplasmic p300 was higher in breast cancer than in non-tumor tissues. Importantly, we found that cytoplasmic localization of p300 is associated with a reduced tumor size, lower recurrence rates and an increase in the overall survival time of patients. Furthermore, in triple negative breast cancer cytoplasmic p300 is also associated with lower tumor stage. Together, the results obtained in this thesis suggest that p300 acts as an oncogene when localized in the nucleus through its action upon the regulation of gene transcription. When p300 is translocated to the cytoplasm, its oncogenic action cannot be performed because it is outside of the nucleus, because it is degraded and/or sequestered in aggresomes and probably also because it may exert cytoplasmic specific functions which might have antitumor effects. Also, the results obtained in this thesis suggest that p300 localization could be potentially interesting as a prognostic factor and indicate the necessity to continue studying the cellular and molecular mechanisms in which the p300 is involved and whose deregulation could contribute to breast cancer development.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La neoplasia mamaria es una enfermedad que afecta comúnmente a hembras caninas. En el microambiente tumoral existe una subpoblación de células tumorales que exhiben características de troncalidad (CSC), que pueden formar esferas in vitro, resistir tratamientos antitumorales, explicando en parte la recurrencia de algunas neoplasias. Previamente, se ha descrito que esferas derivadas de células de carcinoma mamario canino CF41.Mg exhiben características de troncalidad. Melatonina ha mostrado efectos antitumorales sobre células tumorales mamarias; sin embargo, sus efectos han sido pobremente evaluados en CSC mamarias caninas. Melatonina modula la expresión de proteínas relacionadas con transición epitelio-mesénquima en CSC mamarias, como E-cadherina y OCT-4. El objetivo de este estudio fue determinar los efectos de melatonina sobre la proliferación, migración e invasión de células CF41.Mg y esferas derivadas de ellas. Se cultivaron células CF41.Mg en DMEM alto en glucosa suplementado con suero fetal bovino y L-glutamina. Las esferas se cultivaron en placas de ultra-baja adherencia con DMEM/F12 en presencia de EGF, bFGF, insulina, B27 y heparina. La proliferación (reducción de MTS) y los ensayos de migración/invasión (transwell) celular se realizaron en presencia de melatonina (0,01, 0,1 o 1 mM). Melatonina indujo un efecto antiproliferativo a 1 mM (P<0.05), sin embargo, el efecto sobre las esferas fue mayor (P<0.0001). La migración/invasión celular fue inhibida en respuesta a concentraciones no citotóxicas de melatonina (P<0.05) en ambos tipos celulares. Estos resultados indican que melatonina juega un papel en la actividad proliferativa e invasiva de células CF41.Mg, siendo un potencial agente contra CSC mamarias. / Mammary cancer is a common disease affecting female dogs. In the tumor microenvironment there is a subpopulation of cancer cells with stem cell-like features (CSC), that can form in vitro spheres and resist conventional antitumor treatments explaining in part the recurrence of some cancers. It has been previously reported that spheres derived from CF41.Mg canine mammary carcinoma cells exhibit some stemness features. Melatonin has shown antitumor effects on cancer mammary cells; nevertheless, its effects has been poorly evaluated on canine mammary CSC. Recent reports have showed that melatonin modulates the expression of proteins related to epithelial-mesenchymal transition in breast CSC, such as E-cadherin, vimentin and OCT-4. The aim of this study was to determine the effects of melatonin on proliferation, migration and invasion of canine mammary carcinoma CF41.Mg cells and spheres derived from them. CF41.Mg cells were grown in DMEM high glucose supplemented with FBS and L-glutamine. CF41.Mg-spheres were cultured in ultra-low attachment plates with serum-free DMEM/F12 in presence of EGF, bFGF, insulin, B27 and heparin. Cell proliferation (MTS reduction) and migration/invasion (transwell) assays were conducted in presence of melatonin (0.01, 0.1 or 1 mM). Melatonin induced an antiproliferative effect at 1 mM (P<0.05), however the effect on spheres was higher (P<0.0001) than in parental cells. Cell migration/invasion was inhibited in response to non-cytotoxic concentrations of melatonin (P<0.05) both in spheres and in parental cells. These results indicate that melatonin plays a role in the proliferative and invasive activity of CF41.Mg cells, representing a valuable potential agent against mammary CSC.