Nanomaterials have received increasing attention during the last decades in the solid state field since they play a major role as catalyst and catalyst supports for many applications including fuel cells or gas sensors. The interest is mainly due to their high specific surface area, which leads to an increase of performance and a cost-effective solution for expensive or rare materials. However, many studies have reported the collapse of nanostructures at high temperature as one of the main drawbacks for their implementation in real devices and therefore, routes to thermally stabilize these materials must be explored. In this thesis, the unique features of ordered mesoporous materials fabricated by nanocasting are exploited to create quasi-universal thermal stabilization methodologies, allowing implementing and evaluating them in high temperature energy applications e.g. solid oxide fuel cells. The work developed is divided into seven parts. The first chapter introduces the basics of mesoporous materials, solid oxide fuel cells, catalysis and gas sensors. The second chapter focuses on the experimental procedures and the characterization tools employed. In the third chapter, a novel route to thermally stabilize 3-D open mesoporous structures is presented. The next three chapters, show the fabrication and evaluation of thermal stable mesoporous materials as electrodes for solid oxide fuel cells. Finally, chapter seven presents the suitability of mesoporous ceramic oxides as functional materials in humidity sensors. / Los nano-materiales han recibido especial atención durante estas últimas décadas en el campo del estado sólido dado el importante papel que desempeñan como catalizadores y/o soportes catalíticos en diversas aplicaciones, tales como las pilas de combustible o los sensores de gas. Este interés se debe principalmente a su elevada área específica, que da lugar a una mejora del rendimiento y es una solución efectiva para aquellas aplicaciones que requieran materiales de elevado coste. Sin embargo tal y como señalan muchos estudios, el colapso de estas nano-estructuras a elevadas temperaturas es uno de los mayores inconvenientes para su implementación en dispositivos reales, siendo por tanto necesario explorar nuevas rutas que consigan estabilizar estos materiales térmicamente. El objetivo de la presente tesis es desarrollar metodologías cuasi-universales de estabilización térmica, mediante la explotación de las características exclusivas que poseen los materiales mesoporosos ordenados fabricados a partir de un template. Lo cual nos permite implementarlos y evaluarlos en aplicaciones energéticas que operan a elevada temperatura p.ej. pilas de combustible de óxido sólido. El trabajo desarrollado se divide en siete partes. El primer capítulo introduce los fundamentos de los materiales mesoporosos, las pilas de combustible de óxido sólido, la catálisis y los sensores de gas. En el segundo capítulo se detallan los procedimientos experimentales y las técnicas de caracterización empleados. El tercer capítulo presenta una nueva metodología para estabilizar térmicamente los materiales mesoporosos de estructura 3-D abierta. Los siguientes tres capítulos, muestran la fabricación y el comportamiento electroquímico de materiales mesoporosos térmicamente estables trabajando como electrodos de pilas de combustible de óxido sólido. Por último, en el capítulo siete se demuestra la viabilidad de los óxidos cerámicos mesoporosos como materiales funcionales en sensores de humedad.

Al llarg d'aquesta tesi es presenten diferents metodologies originals basades en l'addició enantioselectiva de diorganozincs sobre aldehids catalitzada per β-aminoalcohols, desenvolupats amb anterioritat en el nostre grup de recerca. S'obtenen d'aquesta manera alcohols quirals, que són substàncies d'alt interès sintètic, amb elevades enantioselectivitats i molt bons rendiments químics.En concret, s'aconsegueix el desenvolupament d'un mètode altament eficaç per a l'addició de Et[sub2]Zn a aldehids propargílics mitjançant la transformació del triple enllaç en el corresponent complex de dicobalthexacarbonil. La reacció d'addició de l'organometàl·lic i la posterior desprotecció oxidativa amb nitrat cèric amònic permet l'obtenció de l'alcohol propargílic amb excel·lents enantioselectivitats. S'ha comprovat que aquest darrer procés transcorre sense pèrdua de l'enantioselectivitat en el producte i aprofitant aquesta metodologia, s'ha dissenyat una síntesi formal de l'enantiòmer del producte natural incrustoporina.S'ha dedicat un gran esforç a l'optimització de l'addició de Ph[sub2]Zn a aldehids, transformació que pot tenir lloc en absència de catalitzador. L'addició de diarilzincs sobre aldehids aromàtics ens porta a l'obtenció de diarilcarbinols que són substàncies importants per a la síntesi de productes d'interès farmacològic. En primer lloc, es realitzà un estudi en condicions d'alta dilució, obtenint resultats moderats, i tot seguit es realitzà l'estudi en presència d'excés de Et[sub2]Zn, obtenint bones conversions i excel·lents enantioselectivitats fins i tot utilitzant quantitats molt baixes de l'(R)-2-piperidino-1,1,2-trifeniletanol com a catalitzador de la reacció. Aquesta metodologia es basa en l'ús d'espècies modificades de zinc formades in situ en mesclar difenilzinc i dietilzinc (1:2) i s'ha aplicat a una àmplia gamma d'aldehids amb gran èxit. S'ha analitzat la dependència de l'enantioselectivitat d'aquest procés amb la temperatura de reacció. La monitorització d'aquest procés per React-IR, seguint la desaparició per IR del pic característic del carbonil de l'aldehid, ha permès comparar les velocitats d'addició de les diferents espècies d'organozinc, en presència i en absència de catalitzador i ha permès aprofundir en el coneixement del mecanisme d'aquesta reacció. Per primer cop, s'ha realitzat un estudi teòric del mecanisme de reacció i també s'han obtingut excel·lents resultats a l'utilitzar un anàleg del mateix lligand ancorat en suport polimèric. En l'estudi de la reacció d'addició de Ph[sub2]Zn sobre trimetil-cetones i trifluoro-cetones els resultats obtinguts no han estat els esperats.Finalment, també s'explora l'addició enantioselectiva de Me2Zn catalitzada per l'(R)-2-piperidino-1,1,2-trifeniletanol sobre el benzaldehid i l'heptanal obtenint enantioselectivitats molt bones i moderades, respectivament i altes conversions i s'ha estudiat l'efecte de l'ús d'additius en aquesta reacció.

El selenio es un elemento considerado esencial y a la vez tóxico para el organismo humano. Para establecer una correlación con la biodisponibilidad del elemento in vivo, se pueden emplear diversos métodos de bioaccesibilidad in vitro que simulen condiciones de digestión. De entre los métodos in vitro utilizados en la literatura, el método Physiologically Based Extraction Test (PBET) es uno de los métodos más sencillos y más ampliamente utilizado. La mayor parte del presente trabajo ha tratado sobre los estudios de bioaccesibilidad de selenio basados en el consumo de vegetales comestibles. Para determinar el contenido de Se en los vegetales, se diseñaron diferentes sistemas de crecimiento con condiciones controladas. En este estudio, las plantas comestibles (3 tipos de brotes y 9 tipos de vegetales) se cultivaron en dos medios suplementados (hidropónico y turba, respectivamente) para obtener plantas con un contenido de Se similar a aquéllas que crecen en zonas con una concentración de Se elevada. Para ello, se utilizaron suplementos de sales solubles de Se y el aditivo Selcote Ultra ®. Otra parte del estudio ha sido sobre la bioaccesibilidad de selenio en suelos. En el presente estudio los suelos analizados fueron procedentes del suroeste de los Estados Unidos y su contenido natural fue de 6,8 ± 0,1 mg kg - 1 y 7,6 ± 0,2 mg kg - 1. Durante el presente estudio, el contenido total de selenio y la concentración de las especies de selenio se determinaron en los diferentes materiales utilizando diversas técnicas y procedimientos. Respecto al medio hidropónico, se comprobó que el Se (VI) era más fácilmente absorbido por las plantas que la especie de Se (IV). Respecto a la determinación de Se total se observó que todos los vegetales estudiados absorbieron más cantidad de selenio a medida que aumentaba la concentración de este elemento en el medio fortificado con sales solubles, apareciendo síntomas de deterioro y de inhibición del crecimiento de los vegetales con las fortificaciones de selenio más elevadas. También se observó que las plantas crecidas en presencia del aditivo Selcote Ultra® absorbieron más lentamente el selenio presente en la turba, que las plantas crecidas con sales solubles de selenio. El selenio inorgánico absorbido por las plantas fue transformado principalmente en SeMet, excepto para las plantas del género Allium que contenían principalmente la especie γ-glutamil-Se-MeSeCys. Con respecto al trabajo experimental llevado a cabo durante la estancia de investigación en el Laboratorio de Química Analítica, Bio-Inorgánica y Medio Ambiente (LCABIE), de la Université de Pau et des Pays de l’Adour, se trabajó con diferentes técnicas y procedimientos y se consiguió ampliar la información obtenida con respecto a la especiación de Se. El método PBET se utilizó para estudiar la fracción bioaccesible de Se en suelos y plantas. Mediante la extracción PBET se comprobó que, para los suelos estudiados, la fracción considerada como bioaccesible fue atribuida principalmente a la etapa gastrointestinal del método PBET y correspondió al 50% de Se, incluyendo las especies de Se (IV) y Se (VI). Además, el método PBET de las especies de Se presentes en suelos, se equiparó a una extracción simple con ácido fosfórico. Respecto a los vegetales analizados (col y ajo), se consiguieron extraer las especies de selenio predominantes: selenometionina y γ-glutamil-Se-MeSeCys. También se observó que un porcentaje de este segundo selenocompuesto se degrada a Se-MeSeCys debido a la acción enzimática. En el caso de los vegetales, también se estudió el efecto de diferentes tratamientos aplicados previamente al método PBET (como el proceso de cocción). Se observó que el tratamiento de cocción de las muestras de col favoreció el incremento de la concentración de la especie selenometionina y redujo la concentración de Se (VI) en los extractos gastrointestinales del método PBET, debido a que un gran porcentaje de Se inorgánico se extrajo previamente en el proceso de cocción. Finalmente se han puesto de manifiesto los resultados más importantes obtenidos en el presente estudio y se han comparado con los datos encontrados en la literatura. / Selenium is considered both an essential and toxic element for the human health. Therefore, it is of great interest to study the presence and bioavailability of the selenocompounds in foods and the possible toxic effects from the ingestion of contaminated materials, which depend on their absorption and metabolism. Therefore, given the effects that different Se species can have in the organism, it is necessary to establish a method to study the bioaccessibility of this element, as a step prior to determining bioavailability. Among the in vitro methods used in the literature, the Physiologically Based Extracted Test (PBET) seems to be the easiest and most widely used method. A broader part of this study concerned Se bioaccessibility based on plant consumption. To determine the Se content in plants, different growth systems involving controlled conditions were designed. In this study, the edible plants (3 kinds of sprouts and 9 kinds of vegetables) were grown in two media supplemented (hydroponic and peat, respectively) to obtain plants with a natural Se content similar to those growing in areas with a high Se concentration. Another part of the study was about the Se bioaccessibility in soils. Little information is known about this topic, since most studies on bioaccessibility have concerned heavy metals (such as Pb, Cd, or Cr). In the present study the soils analyzed were obtained from the southwestern United States with Se natural content. During the present study, the total Se content and the concentration of the Se species were determined in the different materials using various techniques and procedures. The PBET method was then used to study the bioavailable fraction of Se in soils and plants. Finally, we highlighted the most important results obtained in the present study and we compared our results with data found in the literature.

Aquesta Tesi Doctoral ha estat pensada per avaluar, mitjançant l’estudi de virus contaminants, l’origen de la contaminació fecal i l’avast de la disseminació a l’aigua. Amb aquesta finalitat s’han utilitzat eines moleculars per a la detecció i quantificació de virus especifics humans, bovins i porcins i a més a més s’ha desenvolupat una nova eina per traçar la contaminació ovina a l’ambient. Els principals agents virals amb risc per als humans són d’origen humà però les femtes animals, amb potencials patògens zoonòtics, representen també un risc per a la salut humana. La intensificació de la producció animal o l’increment de plujes torrencials previst amb els escenaris proposats per al canvi climàtic presenten nous reptes per al control de la contaminació fecal a l’aigua. Bona part de la Tesi, ha anat lligada al projecte europeu VIROCLIME permetent dur a terme estudis a nivell internacional. S’ha caracteritzat la disseminació de virus humans contaminants a l’aigua d’un riu situat en una conca Mediterrània. Mitjançant el registre de variables hidro-climàtiques, la recollida de mostres d’aigua de riu, aigua de mar i aigua residual, i l’anàlisi de FIB i virus indicadors de contaminació fecal humana (HAdV i JCPyV), virus patògens (NoVGII, HEV), i un virus emergent (MCPyV), s’ha estudiat durant un any, l’impacte que l’aigua residual crua o els efluents de les depuradores tenen en la qualitat microbiològica del riu. En un segon estudi realitzat conjuntament amb laboratoris de Suècia, Grècia, Hongría i Brasil, s’ha pogut estandarditzar el mètode de floculació amb llet descremada, per a la concentració de virus, i els assajos de qPCR per identificar i traçar l’origen de la contaminació fecal a l’aigua. Durant 18 mesos de mostrejos a conques de rius situats a les regions Mediterrània, Àrtica, Continental i Tropical, s’han identificat virus humans (HAdV i JCPyV), bovins (BPyV) i porcins (PAdV), demostrant que aquestes eines virals són fiables i útils per a qualsevol àrea geogràfica o matriu d’aigua. Fins al principi d’aquesta tesi, només es disposava de marcadors virals de contaminació fecal porcina i bovina. Analitzant mostres de femta i orina d’ovella, amb un assaig de PCR d’ample espectre per a la detecció de poliomavirus, es van obtenir per primera vegada seqüències d’un putatiu nou poliomavirus oví. A partir d’aquí, s’han dissenyat dos assajos de PCR específics per poder traçar la contaminació fecal ovina a l’ambient. Arrel d’aquest treball, durant l’últim any de la tesi, es va plantejar una estada a Nova Zelanda perquè es tracta del país amb més ovelles per càpita i representa bona part de la indústria ramadera del país. Traçar i identificar l’origen de la contaminació fecal animal a l’aigua és doncs bàsic, tant per la gestió dels residus com per l’avaluació dels riscos per a la salut humana. El quart estudi inclòs a la tesi, es va dissenyar per identificar les fonts principals de contaminació fecal i avaluar, al mateix temps, les diferents eines de MST utilitzades a Nova Zelanda i al laboratori de la doctoranda. S’han recollit mostres de riu als territoris ramaders més importants de l’illa del sud, i s’han analitzat E. coli, virus específics indicadors de contaminació fecal humana (HAdV, JCPyV) bovina (BPyV) i ovina (OPyV), marcadors bacterians específics d’humans (BacH, BacHum-UCD, BiAdo) i de remugants (BacR) i esterols i estanols indicadors de contaminació fecal humana o de remugant. / This thesis was designed to evaluate, through the study of viruses, the source of the fecal contamination and its spread in water matrices. For this purpose molecular tools have been used for the detection and quantification of specific human porcine and bovine viruses, and a new tool has been developed to trace ovine pollution in the environment. Human waterborne viruses pose the main risk to humans, but animal feces, with potential zoonotic pathogens, also represent a risk to human health. The intensification of animal production and the predicted scenarios for climate change, with increase of torrential rains, present new challenges for the control of fecal contamination in water . Much of this work has been linked to the European project VIROCLIME allowing studies conducted worldwide. We characterized the spread of contaminant human viruses in a Mediterranean river basin . By recording hydro-climatic variables, collecting samples of river water, sea water and wastewater, and analysing FIB and human virus indicators of fecal pollution (HAdV and JCPyV), pathogenic viruses (NoVGII , HEV) and an emerging virus (MCPyV) we have studied, thoughouth a year, the impact of raw wastewater and efluents from the wastewater treatment plants the microbiological quality of the river. In a second study, conducted with laboratories in Sweden, Greece, Hungary and Brazil, we standardized the viral concentration method, Skimmed Milk Flocculation, and specific qPCR assays to identify and trace the origin of contamination in water. During an 18 months sampling period, in river basins located in the mediterranean region, arctic, continental and tropical regions, we identified human (HAdV and JCPyV), bovine (BPyV ) and porcine viruses (PAdV), demonstrating that these tools are reliable and useful for any geographic area or water matrix. At the beginning of this thesis, only porcine and bovine viral fecal indicators were available to trace fecal pollution. Since no ovine viral indicator was described before the present work, we designed a study to develop a new tool to trace sheep fecal contamination. Firstly we analyzed urine and stool samples from sheep, with a broad spectrum PCR assay for the detection of polyomavirus. We obtained sequences of a putative new ovine polyomavirus and designed two PCR assays specific for the new ovine virus. During the last year of the thesis raised a stay in New Zealand because it is the country with more sheep per capita and represents much of the livestock industry in the country. Trace and identify the source of animal fecal contamination in water is therefore essential for both waste management for the evaluation of risks to human health. The fourth study included in this thesis was designed to identify the main sources of fecal contamination and evaluate the same time , the different tools used MST in New Zealand and the student laboratory. River samples were collected at major livestock areas south of the island , and analyzed E.coli , viruses specific indicators of human fecal contamination (HAdV, JCPyV) bovine (BPyV) and sheep (OPyV) specific bacterial markers in humans (BacH, BacHum-UCD, BiAdo) and ruminants ( BacR) and sterols and stanols indicators of human fecal contamination or ruminants.

In this work it has been developed and implemented a data analysis pipeline for the discovery of biomarkers by high throughput shotgun proteomics. Specifically the solution has been optimized for the analysis of secretomes of tumor cell lines by label-free LC-MS/MS, with proteins quantified by peptide spectral counts. Along the development it has been shown the incidence and relevance of batch effects in the comparative analysis of label-free proteomics by LC-MS/MS. Also the features providing reproducibility to potential biomarkers have been identified. The model has been developed on empirical data obtained from a series of spiked experiments, and with the help of simulations to evaluate its performance. The pipeline comprises an exploratory data analysis (EDA) R/Bioconductor package, msmsEDA, based on multidimensional analysis tools and a R/Bioconductor inference package, msmsTests, based on generalized linear models (GLM) with Poisson or negative binomial distributions, or the quasi-likelihood GLM extension. Two graphical interfaces have also been produced to ease the use of the provided solution in a MS lab by non experts, and are freely available at GitHub. The designed model is devised to discover differentially expressed proteins in tumor cell line secretomes, using the cell as the unit of interest. The model allows blocking factors as a mean for batch effects correction. The normalization to cell units is embedded in the model through the use of offsets, and no previous data treatment is required. The two packages developed, msmsEDA and msmsTests, allow for: • Dataset quality assessment. • The identification of outliers • The identification of confounding factors or batch effects. • The discovery of potential biomarkers by using the distribution best fitting the available data. • The improvement of reproducibility by a post test filter based of effect size and signal levels. Different papers have been published in peer-reviewed proteomics journals develo-ping each data treatment step, and demonstrating its use and value in biological experiments carried out in the Tumor Biomarker lab at VHIO. / En la tesi s'ha desenvolupat, dissenyat i implementat una solució per l'anàlisi de dades de proteòmica comparativa en descobriment de biomarcadors. Específicament la solució s'ha optimitzat per l'anàlisi de secretomes de línies cel•lulars tumorals per LC-MS/MS sense marcatge, i quantificant pel nombre d'espectres de pèptids assignats a cada proteïna. Durant el desenvolupament de la metodologia s'ha demostrat la incidència i rellevància dels efectes batch en l'anàlisi comparatiu de pèptits sense marcar per LC-MS/MS. Així com les característiques que identifiquen un potencial biomarcador com a reproductible. Els models s'han desenvolupat amb l'ajut de dades empíriques obtingudes de mostres amb mescles controlades de proteïnes, i de simulacions. La solució informàtica que implementa el model desenvolupat consta de dos paquets R/Bioconductor, amb les respectives interfícies gràfiques que faciliten el seu ús a no experts. El primer paquet, msmsEDA, consta de funcions útils en l'anàlisi exploratòria de dades, i permet avaluar la qualitat del conjunt de dades d'un experiment de LC-MS/MS basat en comptatge d'espectres, així com explorar l'eventual presència de valors extrems, factors de confusió, o d'efectes batch. El segon paquet, msmsTests, encapsula funcions per la inferència en el descobriment de biomarcadors. El model emprat és un GLM que contempla la inclusió de factors per blocs per la correcció d'efectes batch, i incorpora una normalització generalitzada per offsets que permet la comparació de secretoma al nivell d'una cel•lula. Les distribucions implementades són la de Poisson i la binomial negativa, així com l'extensió de la quasiversemblança. En conjut el model desenvolupat i la implementació informàtica que se'n ha fet permet: • Avaluar la qualitat d'un conjunt de dades de LC-MS/MS. • Identificar valors extrems. • Identificar la presència de factors de confusió o d'efectes batch. • El descobriment de biomarcadors emprant la distribució que millor s'ajusti a les dades. • Assegurar un bon nivell de reproductibilitat mercès a un filtre post-test. Els paquets i llur documentació es troben lliurement disponibles a bioconductor.org, i les interfícies gràfiques a github.com.

Backbone N-methylation is becoming an increasingly important tool in peptide drug design, and has been widely used to optimize the activity and selectivity of peptide ligands as a result of conformational modulation. However, no systematic research has been conducted on modifying the peptide backbone with other N-alkyl substituents. The present doctoral thesis is aimed at introducing novel N-substituents into peptides, and comparing the conformational and biological properties of the resulting N-substituted peptides with those of their N-Me homologues. In a first project, we studied the effect of replacing backbone N-Me groups by an N-triethylene glycol (N-TEG) chain on hydrophobicity and conformation. For that, we chose Sansalvamide A peptide as a model, and we incorporated N-Me and N-TEG amino acids at the different positions of its cyclopentapeptide structure. We found that Fmoc-protected amino acids bearing the N-TEG group [i.e. N-CH2CH2(OCH2CH2)2OCH3] can be easily prepared in solution, and they are straightforward to incorporate into a resin-bound peptide. The acylation of N-TEG amines can be achieved in solid-phase by activating the following amino acid with triphosgene. In this way, N-TEG peptides are accessible by the same synthetic repertoire as that already established for N-Me peptides. Comparison of NMR data of our N-TEG vs. N-Me analogs gives evidence of similar conformational preferences for those peptides with the same N-alkylation pattern. Furthermore, comparison of their chromatographic retention parameters indicates that the incorporation of an N-TEG chain into a peptide provides a higher hydrophobicity than an N-Me group. In a second study, we chose Cilengitide as model peptide, and we replaced its backbone N-Me group by various N-oligoethylene glycol (N-OEG) chains of increasing size: namely N-OEG2, N-OEG11, and N-OEG23, which are respectively composed of 2, 11 and 23 ethylene oxide monomer units. The N-OEG2 cyclopeptide analog was straightforward to synthesize in solid-phase, using the same methodology as for the N-TEG analogs of Sansalvamide A peptide. The syntheses of the N-OEG11 and N-OEG23 cyclopeptides are hampered due to the increased steric hindrance exerted by the N-substituent, and could only be achieved by segment coupling, which takes place with epimerization and thus requires extensive product purification. The different N-OEG cyclopeptide analogs and the parent peptide were compared with respect to biological activity and lipophilicity. The N-OEG2 analog displayed the same capacity as Cilengitide to inhibit integrin-mediated adhesion of HUVEC and DAOY cells to their ligands vitronectin and fibrinogen. The N-OEG11 and N-OEG23 analogs also inhibited cell adhesion, though with less potency. Thus, replacement of the backbone N-Me group of Cilengitide by a short N-OEG chain provides a more lipophilic analog with a similar biological activity. Upon increasing the size of the N-OEG chain, lipophilicity is enhanced, but synthetic yields drop and the longer polymer chains may impede receptor binding. On the basis of our finding that N-alkyl chains exert similar conformational constraints as a backbone N-Me group when incorporated into a cyclic peptide, we studied the N-(4-azidobutyl) group as a linker to permit conjugation in peptides that lack derivatizable groups (i.e. N-terminus, C-terminus, and side-chain functionalities). We developed a robust strategy for the introduction of this linker into a peptide using standard solid-phase peptide synthesis techniques. With this methodology, we synthesized an analog of Cilengitide in which its backbone N-Me group was replaced by the N-(4-azidobutyl) group. This N-(4-azidobutylated) analog was used to prepare several conjugates with a polydisperse PEG chain (2 KDa), showing that our linker allows conjugation either via click chemistry or -after azide reduction- via acylation or reductive alkylation. This linker is orthogonal to protecting groups and resins commonly used in peptide chemistry, and chemically inert to a wide range of functionalities. NMR data indicated that Cilengitide and its N-(4-azidobutylated) analog have the same backbone conformation. Therefore, substitution of a backbone N-Me group by the N-(4-azidobutyl) linker is a valuable strategy to provide a reactive site for the attachment of molecules whilst preserving the original peptide sequence and conformation. In summary, we have found that peptides bearing larger N-substituents than an N-Me group can be easily synthesized, but difficulties arise upon increasing the size of N-alkyl group. For Sansalvamide A peptide and Cilengitide, replacement of a backbone N-Me group by a short N-OEG chain resulted in analogs with similar biological activity and conformational features. This concept was then employed for the design of the N-(4-azidobutyl) linker, which allows bioorthogonal conjugation of a desired molecule with minimal perturbation of a target peptide structure. Considering the high abundance of N-Me groups in biologically active peptides, we contend that modification at this position is a feasible alternative to introduce chemical diversity or alter pharmacologically important parameters when modification at any other position of the peptide is not wished or possible. / En química medicinal, la N-metilació de l’esquelet peptídic s’ha utilitzat àmpliament per a imposar restriccions conformacionals en pèptids i així optimitzar la seva activitat i selectivitat. D’altra banda, la introducció de grups N-Me en pèptids d’interès terapèutic també és una estratègia per a millorar la seva biodisponibilitat, ja que els pèptids N-metilats són més hidrofòbics, més resistents al trencament proteolític, i -en general- més permeables a través de les membranes biològiques. No obstant, s’han descrit molts pocs exemples en els quals s’hagi modificat l’esquelet peptídic amb d’altres grups N-alquil. Això es pot atribuir a la dificultat d’acilar residus N-alquilats amb grups més grans que N-Me, degut al major impediment estèric. L’objectiu principal de la present tesi ha estat explorar la viabilitat sintètica d’introduir nous N-substituents en pèptids, i comparar les propietats d’aquests nous pèptids N-substituïts amb les dels seus homòlegs N-metilats. En aquesta tesi demostrem que els pèptids modificats amb una cadena de N-trietilenglicol (N-TEG) es poden preparar amb mètodes ja establerts per a la síntesi de pèptids N-metilats. En incrementar la llargada de la cadena de N-oligoetilenglicol (N-OEG), l’acoblament sobre el residu N-alquilat no és viable en fase sòlida, però es pot aconseguir solució utilitzant un clorur d’àcid. Per a dos ciclopèptids model, vam sintetitzar diversos N-OEG anàlegs, i vam trobar que la introducció del grup N-OEG augmenta la hidrofobicitat de forma proporcional a la llargada de la cadena. També vam trobar que el reemplaçament del grup N-Me present en aquests pèptids per una cadena curta de N-OEG provoca una mínima pertorbació de la seva conformació i activitat biològica. En base aquesta observació, vam estudiar el grup N-(4-azidobutil) com a linker per a permetre la conjugació en pèptids que no poseeixen grups funcionals derivatitzables. Demostrem que el grup N-(4-azidobutil) es pot introduir en un pèptid utilitzant mètodes estàndard de síntesi en fase sòlida, i que la substitució d’un grup N-Me present en un pèptid pel nostre linker no altera la conformació del pèptid. També demostrem que grup N-(4-azidobutil) permet la conjugació mitjançant diverses transformacions químiques. Es tracta d’un linker ortogonal a la majoria de grups protectors emprats en síntesi de pèptids, i químicament inert a una gran varietat de grups funcionals. En conclusió, la modificació de l’esquelet peptídic amb d’altres N-substituents més grans que N-Me és factible, però sorgeixen dificultats sintètiques en incrementar el tamany del grup N-alquil. Considerant que el grup N-Me es troba present en nombrosos pèptids biològicament actius, la seva substitució per d’altres entitats químiques és una alternativa viable per a introduir diversitat estructural o alterar propietats farmacològiques importants quan no és possible o no interessa modificar d’altres posicions d’un pèptid.

La aplicación de enzimas en la industria constituye una de las aportaciones más recientes en las tecnologías de producción, debido a su elevada eficiencia catalítica, a que su uso no daña el medio ambiente y a su alta rentabilidad económica.En los últimos años ha aumentado de forma importante la aplicación de enzimas microbianos en la industria. La mayoría de estos enzimas son degradadores de polisacáridos de la pared celular vegetal, como celulosas, hemicelulosas y pectinas.La pectina es un polímero formado principalmente por cadenas de ácido galacturónico, parcialmente esterificado. Las pectinasas son las enzimas que degradan la pectina.El principal objetivo de la tesis fue caracterizar pectinasas con potencial aplicación industrial. Para ello, primero se realizó el análisis de los sistemas degradadores de pectina de las cepas bacterianas Paenibacillus sp. BP-23 y Bacillus sp. BP-7, aisladas previamente por el grupo de investigación a partir de suelo de arrozal del Delta del Ebro. El sistema pectinolítico de ambas cepas mostró una multiplicidad de bandas, motivo por el cual, se procedió a la clonación, purificación y caracterización de pectinasas a partir de las cepas analizadas y de Bacillus subtilis 168. Los estudios realizados indican que PelA de Paenibacillus sp. BP-23 e YvpA de Bacillus subtilis son enzimas nuevos, con características diferentes a las pectato liasas conocidas, que permiten identificar un subgrupo de enzimas dentro de las pectato liasas de la familia PL3. La inusual elevada actividad sobre pectina de los dos enzimas estudiados en este trabajo los hace buenos candidatos para aplicaciones biotecnológicas relacionadas con la degradación de pectina de sustratos naturales.En el contexto de la utilización creciente de enzimas en la industria se planteó la producción del más activo de ellos, la pectato liasa PelA, en cantidades elevadas para poder realizar ensayos de aplicación industrial, utilizando cepas huésped de Bacillus subtilis. Con este fin se construyeron vectores lanzadera que replican tanto en Bacillus subtilis como en Escherichia coli.Los resultados obtenidos en este trabajo suponen una aproximación a la tarea de sobreproducir pectato liasas, lo que ha permitido la identificación de problemas específicos de la expresión de los enzimas en estudio y posibilitarán la construcción futura de nuevas cepas recombinantes de productividad y rendimiento aumentado. / Pectins are linear polymers of alpha-D-galacturonic acid. They are found in the middle lamella and primary cell wall of plant tissues and they are degraded by pectinases.The aim of the thesis was the caracterization of pectinases with a potencial applications in the industry.Therefore, we analysed the petinolytic system of the bacterial strains Paenibacillus BP-23 and Bacillus BP-7, previously isolated from a rice field.The pectinolytic system of both strains a multiple glycanase system, some enzymes of which have been cloned and characterized.Paenibacillus sp BP-23 PelA and Bacillus subtilis YvpA, belong to pectate lyases PL3 family, and show and unusual features among pectin and pectate lyases. For this reason, we constructed several shuttles which were used to overexpres PelA in Bacillus subtilis.

La presente tesis se ha centrado en la identificación, purificación y caracterización bioquímica de las xilanasas Xyn10A, Xyn30D y Xyn11E de Paenibacillus barcinonensis. Conjuntamente se ha realizado la aplicación de estas enzimas en procesos de modificación de fibras papeleras, con el fin de evaluar su potencial uso en la industria del papel. Las xilanasas son enzimas que catalizan la hidrólisis del xilano, uno de los biopolímeros más abundantes que se ubica en la pared celular vegetal. Actualmente, las xilanasas han adquirido un gran interés comercial en procedimientos que degradan la pared vegetal ya que presentan, frente a los catalizadores químicos, las ventajas de ser biocatalizadores altamente selectivos y no contaminantes, características que las convierten en herramientas útiles para el desarrollo de tecnologías limpias. El trabajo de investigación realizado se enmarca dentro de otro proyecto de mayor envergadura enfocado a la búsqueda, identificación y caracterización de nuevas enzimas capaces de mejorar las propiedades de las fibras papeleras y obtener productos de valor añadido a partir de materiales lignocelulósicos. La xilanasa Xyn10A de P. barcinonensis pertenece a la familia 10 de las glicosil hidrolasas, GH10. Presenta máxima actividad sobre xilanos de maderas duras (haya y abedul) y un alto potencial para la producción de oligosacáridos derivados del xilano. La xilanasa Xyn30D fue identificada mediante el análisis del secretoma de P. barcinonensis. Esta enzima es el primer ejemplo de xilanasa modular de la familia GH30 descrito hasta la fecha. Tiene una estructura bimodular, consistente en el módulo catalítico unido a un módulo de unión a carbohidratos de la familia CBM35. La xilanasa Xyn30D, al igual que su módulo catalítico presenta actividad exclusivamente sobre glucuronoxilanos. Adicionalmente, el módulo catalítico de la xilanasa Xyn30D presenta la estructura lateral β9 característica de las xilanasas de la familia GH30 y la deleción de dicha estructura causa la pérdida de la actividad enzimática. Este resultado es la primera evidencia experimental del requerimiento de la estructura lateral β9 para la actividad de las xilanasas de la familia GH30. El módulo de unión a carbohidratos CBM35 de la xilanasa Xyn30D puede comportarse como una unidad funcional independiente y es capaz de unir las fracciones soluble e insoluble del glucuronoxilano, además de ácido glucurónico. Esta última unión es dependiente de calcio. La xilanasa Xyn11E es una xilanasa homóloga a las del subgrupo de xilanasas de punto isoeléctrico alcalino y bajo peso molecular de la familia GH11, y presenta máxima actividad sobre glucuronoxilanos. La xilanasa Xyn11E requiere de la coexpresión de la chaperona LppX para ser expresada heterólogamente en forma activa y soluble. La aplicación de xilanasas de P. barcinonensis en el blanqueo de pastas papeleras de sisal, especialmente de la xilanasa Xyn10A, permite obtener mejoras importantes tanto en el grado de deslignificación como en la disminución del contenido en ácidos hexenurónicos de las pastas. Existe una correlación positiva entre la capacidad de las xilanasas de liberar azúcares reductores de las pastas papeleras, durante la etapa enzimática previa a la secuencia de blanqueo, y la efectividad de las enzimas en disminuir el contenido en lignina y ácidos hexenurónicos. La aplicación del sobrenadantes crudos de P. barcinonensis como agente blanqueador de pastas de papel puede ser una alternativa de bajo coste para este proceso. Nuestros resultados sugieren que es muy difícil generalizar sobre la efectividad de una familia particular de glicosil hidrolasas para una determinada aplicación industrial, por lo que la idoneidad de una enzima para un proceso debe ser evaluada de forma individual. La utilización de cócteles enzimáticos que contengan varias enzimas puede ser conveniente en determinados procesos industriales para aumentar la eficiencia de los tratamientos. / This thesis has focused on the identification and characterization of xylanases from Paenibacillus barcinonensis with industrial applications. Xylanases are enzymes which catalyze the hydrolysis of xylan, one of the most abundant biopolymer in nature which is located in the plant cell wall. Currently, xylanases have acquired a strong commercial interest in procedures that degrade the plant cell wall, since they have, compared to chemical catalysts, the advantages of being highly selective biocatalysts and nonpolluting, characteristics that make them useful tools for developing of clean technologies. The research work is part of another bigger project focused on the search, identification and characterization of novel enzymes capable of improving the properties of papermaking fibers and get value added products from lignocellulosic materials. The research has focused on the identification of three xylanases Xyn10A, Xyn11E and Xyn30D from the family GH10, GH11 and GH30 respectively. They all have been cloned, heterologously overexpressed in Escherichia coli, purified and biochemically characterized. We had also performed the application of these enzymes in processes of papermaking fibers modification, in order to evaluate its potential use in the paper industry. Our results suggest that it is very difficult to generalize about the effectiveness of a particular family of glycosyl hydrolases for a particular industrial application, so that the suitability of an enzyme to a process must be evaluated individually. The use of enzyme cocktails containing multiple enzymes may be advantageous in certain industrial processes to increase the efficiency of the treatments.

Structural, petrological, microstructural and geochronological studies were combined with pseudosection modeling in the Roc de Frausa Massif (Eastern Pyrenees). The massif is constituted by Upper Proterozoic–Early Cambrian rocks and represents a mid crustal section intruded by igneous rocks. The aim is to compare the thermal evolution of different crustal levels in a single orogenic event. The rocks constituting the massif were part of the northern margin of Gondwana and were involved in the Variscan orogeny when Gondwana collided with Laurentia-Baltica. Two main Variscan deformation events are distinguished. D1 is marked by tight to isoclinal small-scale folds and a sub-horizontal foliation. D2 structures are tight upright folds facing to the NW with steep NE–SW axial planes. In the high-grade metamorphic domains it transposes S1 foliation by a sub-vertical S2 foliation. D3 structures are characterized by NW–SE folds compatible with steep dextral shear zones that retrograde the pre-Variscan rocks and the Variscan intrusives to greenschist facies. N and S of the studied area F3 folds involve Mesozoic rocks, and therefore it can be attributed to the Alpine orogeny. In the micaschists of the Upper crustal levels, andalusite porphyroblasts with S1 inclusion trails and sillimanite in S1 pressure shadows indicate heating from 580 °C to 640 °C. Cordierite includes the former minerals and does not exhibit pressure shadows pointing to isothermal decompression from 3.4 to 2.6 kbar. A calc-alkaline granitoid intruded on top of this level interkinematically between D1 and D2 (314–311 Ma). Intermediate crustal levels are dominated by schists with sillimanite−biotite−muscovite in the S1 fabric overgrown by cordierite and K-feldspar with no pressure shadows. These assemblages point to decompression from 5 to 3 kbar at 640−660 °C. A gabbro-diorite stock intruded in this level coeval with the D2 in two magmatic pulses (312 and 307 Ma). In the inner aureole four types of migmatites have been characterized, with different textures, mineral assemblages, mineral chemistry and whole-rock compositions. The biotite−sillimanite−K-feldspar−garnet assemblage together with garnet zoning is compatible with heating within the S1 fabric at peak-pressure of 7 kbar and 730 °C. F2 folds with subvertical melt-filled S2 foliation were overgrown by cordierite indicating mainly syn-D2 decompression to 4.5 kbar. The different whole-rock and mineral compositions and the preservation of the mineral assemblages of migmatitic rocks can be explained by different episodes of melt-loss and fluid infiltration in the metasediments at 790 °C and 5.5 kbar and incorporation of the fluids into the melt. The fluids would be released by the crystallizing gabbro-diorite. Lower crustal levels are dominated by fold-structured migmatites occurred in the interval 320–315 Ma. They present a biotite−cordierite composite S1-S2 biotite-bearing fabric with relic garnet embedded in plagioclase, thus precluding deciphering the early metamorphic evolution. Cordierite overgrowing both S1 and S2 fabric points to late equilibration at 3 kbar and 700 °C. The early metamorphic history associated with the S1 fabric is interpreted as a result of lower crustal horizontal flow and could be related to moderate crustal thickening. D2 event is characterized by decompression associated to highly heterogeneous exhumation of the metamorphic complex during the last stages of the Variscan evolution. / Se ha realizado un estudio estructural, petrológico, geoquímico, geocronológico y de modelización térmica en rocas pelíticas e ígneas del macizo de Roc de Frausa (Pirineo oriental) con la finalidad de comparar la evolución térmica de diferentes niveles de la corteza terrestre en un mismo evento orogénico. Las rocas que conforman el macizo formaban parte del margen norte de Gondwana y quedaron involucradas en la orogenia varisca al colisionar Gondwana con Laurentia-Baltica. Las rocas constituyen una serie Proterozoica superior a Paleozoica inferior afectadas por tres episodios deformativos, los dos primeros de edad varisca y el tercero alpina. En los micaesquistos con andalucita–sillimanita del nivel cortical superior, la andalucita y la sillimanita indican un incremento de temperatura de 580 °C a 640 °C coetáneo a la fábrica S1. La cordierita indica una descompresión isotérmica de 3.4 kbar a 2.6 kbar. Por encima de este nivel se emplazó un granitoide calco-alcalino intercinemáticamente entre D1 y D2 (314–311 Ma). Los niveles corticales medios están formados por esquistos con sillimanita-biotita-moscovita sin-S1 sobrecrecidos por cordierita y feldespato potásico post-S1. Estas asociaciones señalan una descompresión desde 5 a 3 kbar a 640–660 °C. Un stock gabro-diorítico intruyó sincrónico a D2 en dos pulsos magmáticos (312 y 307 Ma). En la aureola de contacto se distinguen cuatro tipos de migmatitas con diferentes texturas, asociaciones minerales y composiciones de roca y mineral que se explican mediante un modelo de perdida de fundido alternando con episodios de infiltración de fluido. Las asociaciones minerales indican condiciones PT de 7 kbar y 730 °C sin-D1 y una descompresión sin-D2 a 4.5 kbar. Los niveles corticales inferiores están formados por migmatitas cristalizadas entre 320–315 Ma. La cordierita sobrecrece las fábricas S1 y S2 ricas en biotita y con granate relicto incluido en plagioclasa e indica un equilibrio tardío a 3 kbar y 700 °C. D1 se interpreta como el resultado de un flujo horizontal de la corteza inferior, que podría relacionarse con un engrosamiento cortical moderado. D2 se caracteriza por una descompresión isotérmica que puede explicarse por una exhumación varisca tardía de los complejos metamórficos.

La toxina Cdt (“Cytolethal Distending Toxin”) fue descrita por primera vez en 1987 por Johnson y Lior como una nueva toxina producida por Escherichia coli. Es una toxina de tipo AB2 que bloquea el ciclo celular eucariota en las fases G2/M de la mitosis, cosa que provoca una distensión celular de hasta 5 veces el tamaño normal, y finalmente se produce la apoptosis. En la actualidad, la Cdt ha sido descrita en un gran número de bacterias Gram negativas como Vibrio, Helicobacter, o Campylobacter, entre otros. Está codificada por tres genes adyacentes (cdtA, cdtB y cdtC) que muestran diferentes grados de similitud entre géneros, siendo CdtB la subunidad catalítica que actúa como una ADNasa de tipo I, y CdtA y CdtC las subunidades que transportan a CdtB al núcleo. En E. coli han sido descritas 5 variantes, localizadas en el cromosoma (Cdt-II), en el plásmido pVir (Cdt-III) o rodeadas de secuencias homólogas a genes de fagos de tipo lambda o P2 (Cdt-I, Cdt-IV y Cdt-V). El hecho de que cdt se encuentre en diferentes géneros bacterianos con secuencias adyacentes homólogas a genes de fagos, así como que no aparezca asociado significativamente a otros factores de virulencia, sugiere que estos genes cdt son adquiridos por transferencia horizontal a través de fagos. Estos fagos Cdt pueden ser inducidos a partir de la cepa huésped y transmitir el gen de la toxina a otras cepas, causando la aparición de nuevas cepas virulentas. Además de en ambientes clínicos, se han encontrado fagos Cdt en agua residual y, tal como veremos en este estudio, también en agua de río, hecho que refuerza su potencial papel como transmisores de la toxina en el medio ambiente. Por tanto, un aspecto importante a tener en cuenta es la persistencia y la estabilidad de estos fagos en las diferentes condiciones ambientales. Por ello, en este trabajo, se ha estudiado la estabilidad de los fagos Cdt bajo diferentes condiciones de temperatura (4ºC, 22ºC y 37ºC) y pH (3, 7 y 9), y bajo diferentes tratamientos de inactivación: calor (60ºC y 70ºC, 30 y 60 min), luz UV (1, 5, 10 y 30 min), cloración (1, 3, 5, 10, 20 y 30 min) e inactivación natural. Para ello se han aislado dos fagos Cdt-V de muestras ambientales, y se han monitorizado mediante ensayos de infectividad (ufp/ml) y mediante cuantificación de copias genómicas por qPCR en cada una de las condiciones ensayadas. Además, se han comparado los resultados obtenidos con la estabilidad de fagos Stx, también de elevada persistencia ambiental, bajo las mismas condiciones. Por su propia naturaleza, y tal y como se ha visto en este trabajo y en estudios anteriores, los fagos son mucho más resistentes a ciertos tratamientos de desinfección e inactivación natural que las bacterias huésped, reafirmando su papel como reservorios de genes de virulencia en el medio ambiente. Además, se han descrito ciertas morfologías de fagos que permitirían una mayor persistencia a dichos tratamientos. Si los fagos consiguen sobrevivir a los tratamientos comúnmente utilizados en la eliminación de las bacterias, podrían transducir el gen de la toxina a otras cepas. Por tanto, no se puede descartar su potencial en la generación de nuevas cepas patógenas emergentes. Además de la persistencia de los fagos Cdt-V, también se ha estudiado su capacidad de inducción y de generación de lisógenos, así como su morfología y su estructura genética. Gracias a ello, se ha podido determinar a qué familia pertenecen y observar su capacidad de evolución y adaptación al lisogenizar a un nuevo huésped. / Cdt toxin (“Cytolethal Distending Toxin”) was first described by Johnson and Lior in 1987. It is an AB5 toxin that blocks the eukariotic cell cycle between G2 and M phases, which distends the cells, since cell division ceases but growth continues. Cdt is produced by different Gram negative pathogenic microorganisms, including Escherichia coli, Vibrio, Campylobacter and Helicobacter, among others. It consists of three subunits (CdtA, CdtB, and CdtC) that are encoded by three adjacent genes. The catalytic subunit CdtB is homologous to DNase I and it is the most conserved gene, and the other subunits act as binding proteins that deliver CdtB into target cells. Five variants of the toxin have been reported in E. coli, located in the chromosome (Cdt-II), in the conjugative plasmid pVir (Cdt-III) or flanked by lambda-like or P2 bacteriophage genes (Cdt-I, Cdt-IV and Cdt-V). The fact that Cdt is present in different microorganisms and, in some cases flanked by bacteriophage genes, and not significantly associated to other virulence factors, suggest that cdt genes are acquired by horizontal transfer by means of bacteriophages. These Cdt phages could be induced from the host and transduce the toxin to other strains, causing the emergence of new virulent strains. Cdt phages have not only been isolated from clinical samples, but also from environmental samples. For the potential role of these phages in cdt transduction, it is important to consider and study the persistence of Cdt phages in different environmental conditions. In this work, it has been studied the stability of two Cdt phages isolated from the environment under different conditions and inactivation treatments (temperature, pH, heat treatment, UV treatment, chlorination and natural inactivation). Moreover, the results were compared with Stx phages stability (that also have a significantly environmental prevalence) under the same conditions. The fact that Cdt and Stx phages and, in general, all phages, are more resistent to all the treatments and conditions than their natural hosts, reinforces their potential role as a reservoir of virulence genes in the environment. We have also characterized Cdt phages: its capacity of induction and lisogenization, morphology and genetic structure, to understand better the performance of these phages.