This thesis presents the results of applying new strategies to understand the mechanism and explore the sensing performance of metal oxide (MOX) nanowire based gas sensors by testing individual nanowire gas sensors, running density functional theory (DFT) calculations, using new materials, applying ex-situ analysis and temperature-pulsed operation mode. These MOX nanowires include SnO2, CuO decorated SnO2, CuO and ZnO, electrically contacted either individually or in bundles. With SnO2-NH3 as a model system, DFT calculations were made to draw the pictures of surface-gas interactions, which were combined with empirical modeling of individual nanowire sensors to determine the sensing mechanism of this system. The surface reaction routine that involves non lattice oxygen was found to responsible for the sensing effect. As an interfering substance to NH3 sensing, H2O was also studied in this approach. At the new material front, CuO decorated SnO2 nanowire showed significantly increased sensitivity toward H2S while keeping other gases, e.g., CO and NH3 low, offering good selectivity to this gas. Ex-situ analysis has shown that sulfurization and desulfurization reactions happened on CuO, confirming the charge transport channel depletion model proposed for this material. The less common p-type CuO was obtained with the facile thermal oxidation method. NH3, H2S and NO2 sensing have all indicated the key role of surface adsorbed oxygen species in its gas sensing. Due to its intrinsic property, the ZnO nanowires assembled onto micro hot plate (μHP) substrates by dielectrophoretic (DEP) alignment showed relative NH3 selectivity from CO. When operated in temperature-pulsed mode, sensitivity enhancement was seen at the low temperature end. Such effect was ascribed to the fast regulation of surface oxygen, H2O and NO2 in the pulsed mode. The current dissertation is organized as follows: Chapter 1 introduces the general background of the MOX gas sensors and the basic idea of computational chemistry. Chapter 2 gives a brief introduction to density functional theory, which is the major theoretical tool in this work. Chapter 3 describes the experimental and theoretical techniques that have been applied. Chapter 4 deals with the NH3/H2O sensing of SnO2 nanowire, DFT calculations and empirical modeling. The sensing mechanism of NH3 by SnO2 and the interfering principle of H2O were unveiled. Chapter 5 reports the H2S sensing of SnO2 and CuO decorated SnO2 nanowires and the study of the corresponding mechanisms. Chapter 6 explores the NH3, H2S and NO2 sensing properties of the individual CuO nanowire. The importance of surface oxygen species in gas sensing was demonstrated. Chapter 7 is about the DEP deposition of ZnO nanowires onto the μHP sensing substrate and the NH3 sensing in isothermal and temperature-pulsed mode. Chapter 8 reviews the present work, highlighting the main achievements and proposes future directions. / Aquesta tesi se centra en l’estudi dels mecanismes de detecció de gasos amb sensors basats en nanofils d’òxids metàl•lics. Amb aquest objectiu, s’han estudiat les respostes de sensors formats per un únic nanofil, s’ha modelitzat la seva resposta mitjançant càlculs DFT (Density Functional Theory) i s’han analitzat nous materials i explorat modes de funcionament no estàndards com és el polsat de temperatura. Als tres primers capítols de la dissertació se’n fa una introducció als dispositius basats amb òxids metàl•lics, es revisen els fonaments teòrics que hi ha darrera de les simulacions DFT i es presenten els mètodes experimentals que s’han fet servir per completar aquest treball doctoral. El quart capítol se n’ocupa de les interaccions del sistema SnO2-NH3 mitjançant la combinació de càlculs teòrics amb DFT i dades experimentals. Es presenta i valida el mecanisme de detecció de l’amoníac amb l’òxid d’estany així com es discuteix les interferències d’aquest contaminant amb la humitat. Al cinquè capítol es presenta la detecció de H2S amb heteroestructures formades per nanofils de SnO2 decorats amb nanopartícules de CuO. La gran sensitivitat a aquest gas que es troba experimentalment, especialment si es compara amb les respostes típiques obtingudes amb nanofils no decorats, s’ha analitzat i modelitzat. El capítol sisè explora la utilització d’òxid de coure, un semiconductor tipus p, com a sensor de gas; i les seves respostes a diferents contaminants es comparen amb les obtingudes amb l’òxid d’estany, el semiconductor tipus n de referència. Ja al capítol setè, es presenta el dipòsit controlat de nanofils de ZnO sobre hotplates mitjançant dielectroforesi (DEP) així com la millora de la sensitivitat quan els dispositius obtinguts són operats en mode de temperatura polsada. Finalment, el capítol vuitè i últim resumeix tots els capítols anteriors destacant els resultats més significatius aconseguits, i s’exploren noves línies de treball per a futures tesis.

Over time, many studies about deer antlers, based on classical morphometry, have been done. The present study propose a new perspective on the study of Iberian red deer antlers (Cervus elaphus hispanicus) from Sierra Morena (Spain), introducing new techniques able to provide more detailed information about them. The objectives addressed in this work have been principally focused on the use of geometric morphometrics methods and photogrammetric systems based on CAD-3D technology. Three-dimensional coordinates of 217 antlers concerning both the full and half antler structure, were adapted to each objective of the study and subjected to several statistics analyses. The exhaustive characterization of the shape changes of different antler parts with age was carried out, as well as the exploration of the existence of an optimal age for the obtention of the best antlers. The antlers of youngest individuals (2 to 3 years old) showed smaller but more elongated near the skull, with straighter and vertically oriented tines; while antlers of fully-grown individuals (6 to 9 years old) were shorter near the skull and more arched distally, with longer and curved tines. The allocation of an own antler categorization, based on measures of homologation protocols, made possible the observation of an antler improvement of individuals aged between 4-9 years, as well as some deterioration from 10 to 13 years. This is important for deer management in the area studied, which also might be applicable to other species. The high variability of antlers in terms of asymmetry was studied through the evaluation of the presence of Fluctuating asymmetry (FA) and Directional asymmetry (DA). Generally, previous studies show FA on antlers. However, the presence of FA and DA was significant in the antlers sampled, being the amount of DA higher than FA. The predominance of DA, rejected the possibility of considering FA as individual quality indicator. In addition, the DA presence involved new insights about the antler asymmetry and its development, pointing to to a more intense use of the right antler side. On the other hand, the annual capacity of antlers to regenerate, where multiple pathways interact, led us to the idea that antlers may act as modular structures. Accordingly, five modularity hypotheses of different biological interest, were proposed taking into account the variation among individuals and the variation suffered at direct developmental pathways. Modularity and integration were found, highlighting the tight relationship between both phenomena in antlers. This last fact, reflected the interaction of multiple pathways along the antler growth, as well as the existence of developmental interactions transmitting the effect of random perturbations throughout the whole structure. Thus, antlers generally act as single integrated modules, performing a common function as head and eyes protection during fights. However, the modularity observed suggested the relative independent behaviour of some antler parts, as the trez tines, during antler development. Finally, a Photogrammetric Interactive Measure Method (PhIMM), based on the combination of digital methods and the use of a parametric CAD system, was proposed to complete the study. This methodology, represents advantages from the data-taking point of view, since the use of digital photographs allows to sample in the field in an economic and fast way. Furthermore, the lack of taking measures in the field is not a problem, since the CAD technology allows to create three-dimensional models of the structures on which we can perform all the measurements desired, including volumes and perimeters. In addition, the information extracted from this models can be directly shown in excel sheets, facilitating the data processing and even the introduction in other programs. / La presente investigación estudia astas de ciervo Ibérico (Cervus elaphus hispanicus) mediante técnicas de morfometría geométrica y fotogrametría. Los cambios de forma de 217 cornamentas fueron caracterizados en función de la edad de los individuos. Especímenes de 2-3 años presentaron cornamentas pequeñas y alargadas, con puntas rectas y orientadas verticalmente. En cambio, las cornamentas de especímenes de 6-9 años, eran más cortas y arqueadas, con puntas largas y curvadas. La categorización propia de las astas, permitió observar una mejora de la calidad de las mismas en individuos de 4 a 9 años, y un deterioro en las de 10 a 13 años. La presencia de asimetría fluctuante (FA) y asimetría direccional (DA), también fue estudiada. Tanto FA como DA fueron significativas, siendo DA más abundante que FA. La predominancia de DA, imposibilitó considerar FA como indicador de calidad individual, y sugirió un uso más intenso de la rama derecha. Que las cornamentas pudieran ser estructuras modulares, llevó a proponer cinco hipótesis de modularidad, teniendo en cuenta tanto la variación entre individuos, como la debida a vías directas del desarrollo. La presencia de modularidad e integración en las cornamentas fue significativa. Ello reflejó tanto la interacción de múltiples vías durante el proceso de crecimiento de las cornamentas, como la existencia de interacciones capaces de transmitir perturbaciones aleatorias a lo largo de toda la estructura. Por lo tanto, las astas actuarían como un único módulo integrado. Sin embargo, la modularidad observada sugirió cierta independencia de partes como los candiles. La implementación de un método fotogramétrico interactivo de medida (PhIMM), basado en la toma de fotografías digitales y la utilización de un sistema CAD paramétrico, fue propuesto para completar el estudio. Dicha metodología, es ventajosa en la recolección de datos, puesto que la tecnología digital permite muestrear rápida y económicamente. Además, la falta del registro de ciertas medidas en el campo no es un problema, ya que la tecnología CAD permite crear modelos tridimensionales de las estructuras de interés, donde es posible realizar todas las medidas deseadas.

En esta memoria se recogen los resultados sobre preparación y caracterización de las propiedades físicas de sistemas magnéticos nanoestructurados. Para la fabricación de las nanoestructuras se han empleado dos estrategias diferentes: la estrategia ascendente (bottom‐up), que se basa en el autoensamblaje de componentes nanométricos elementales, en nuestro caso nanopartículas (NPs), y la estrategia descendente (top‐down), que fundamentalmente consiste en el empleo de las técnicas de litografía y grabado para definir motivos a escala micrométrica o nanométrica. Para ambas estrategias, se seleccionaron materiales magnéticos que, debido a sus propiedades físicas, se consideran muy buenos candidatos para futuras aplicaciones tecnológicas. En concreto, para la estrategia ascendente se sintetizaron coloides con NP’s de Co por su potencial interés en la fabricación de dispositivos de memorias magnéticas de alta densidad, con los cuales podría superarse el límite actual, que se encuentra alrededor de 1 Terabits/in2. Por su parte, para la estrategia descendente se seleccionó la manganita La0.66Sr0.33MnO3 porque gracias a su carácter semimetálico (polarización total de espín) y su elevada temperatura de Curie resulta ser uno de los mejores candidatos para la implementación de dispositivos de espintrónica. En el primer caso se han utilizado las técnicas de “drop casting” y “spin coating” y los resultados obtenidos en ambos casos demuestran que una baja dispersión de tamaño de las NPs (< 15% de dev. std. respecto al valor promedio) es de capital importancia para conseguir el autoensamblaje de las NPs en áreas grandes. Además, se han optimizado las condiciones experimentales (temperatura, velocidad de evaporación, tipo de solvente, mojabilidad del coloide, etc.) que permiten la formación de sistemas nanoestructurados homogéneos y con orden de largo alcance sobre sustratos de interés tecnológico, en particular sobre silicio. Respecto a la estrategia descendente, se demuestra que la técnica de grabado aquí propuesta constituye un avance frente a las técnicas tradicionales de ataque mediante métodos físicos que, si bien están perfectamente contrastadas para su uso en semiconductores, en el caso de los óxidos presentan diversos problemas. Su ventaja radica en que con ella se elimina la posibilidad de crear defectos en el material resultante como, por ejemplo: la implantación iónica o la generación de defectos cristalinos, los cuales deterioran las propiedades físicas del material. También se ha realizado un estudio de los fenómenos de la interfase formada por un óxido complejo como el LSMO y distintos materiales aislantes típicamente usados como barrera en la fabricación de uniones túnel. Para ello se han preparado diferentes bicapas integradas por LSMO y un material aislante: MgO, NdGaO3, SrTiO3 y LaAlO3. El método empleado aquí permite comparar cuantitativamente los resultados de las distintas barreras, sin necesidad de llevar a cabo el proceso completo de fabricación de las uniones túnel, y por tanto, permite conocer de manera experimental cuál de los distintos materiales de barrera proporciona la respuesta óptima. En esta memoria se aborda también el estudio de los fenómenos de electroresistencia en manganitas. Cuando se estudia la electroresistencia en dispositivos nanométricos sometidos a altas densidades de corriente (superiores a 1x105 A/cm2) frecuentemente surge el debate acerca de la importancia del efecto Joule. Con la intención de clarificar el papel del efecto Joule se ha diseñado un sistema que permite tener acceso a la temperatura local de las muestras durante la medición de las curvas características I‐V. Nuestros resultados demuestran que el comportamiento fuertemente no lineal de las curvas I‐V no puede ser atribuida exclusivamente al efecto Joule. Por otra parte, el aumento progresivo e irreversible de la resistencia en todo el rango de temperaturas y la disminución de la TC al inyectar altas densidades corriente, apuntan hacia una progresiva degradación de las muestras debida a la disminución del contenido de oxígeno. Esta hipótesis se confirma por el hecho de que un recocido de las muestras al aire a alta temperatura permite recobrar los valores iniciales de resistencia y TC. Finalmente, se ha realizado una investigación detallada del fenómeno de cambio reversible de resistencia en LSMO. La transición reversible entre los estados de alta y baja resistencia se ha inducido mediante la aplicación de un voltaje de bias a través de la punta conductora del AFM, se ha identificado el mecanismo que da lugar a dicho cambio y se ha determinado cual es el material activo en dicho cambio de resistencia. / This memory compiles the results obtained about the preparation and characterization of the physical properties of nanostrutured magnetic systems. For the fabrication of nanostructures two different strategies have been used: the bottom‐up strategy based on the self‐assembly of elemental nanometric pieces, in our case nanoparticles (NPs) and the topdown strategy, that imply the use of lithographic and etching techniques to define motives at the micro or nanometric scale. Using the first strategy, different samples have been prepared by means of the dropcasting and spin coating techniques. In both cases we have obtained self‐assembled monolayers of highly ordered Co magnetic nanoparticles (NPs) onto Si substrates. The influence of different parameters, such as substrate temperature, evaporation time, the solvent used and the wetting of the colloid, were analyzed. The top‐down procedure was used for fabricating La0.66Sr0.33MnO3 (LSMO)/insulating layer bilayers and La0.66Sr0.33MnO3 microbridges by lithographic and etching techniques. We have fabricated the LSMO/insulating layer bilayers to investigated interfacial effects between LSMO electrodes and different insulating layers, such as MgO, NdGaO3, SrTiO3 and LaAlO3. Our set up allows studying and comparing the electronic effects at the LSMO/insulating layer interface which could be of major interest for the implementation of oxide‐based magnetic tunneling junctions. Finally electroresistance and reversible resistive switching (RS) behavior were also investigated in sputtered LSMO thin films. To ascertain the role of Joule self‐heating effects I‐V characteristic curves were measured in LSMO microbridges with a nanometric Pt thermometer on top in order to gain access to the local variations of temperature. Strongly non‐linear I‐V characteristic curves were observed that cannot be explained by Joule heating effects alone. In addition, the progressive and irreversible augment of resistance, together with the reduction of TC, strongly suggest a progressive degradation of the samples due to oxygen depletion. For the RS studies the LSMO resistance state was locally modified by using a conducting scanning‐probe microscope. Our results indicate that the mechanism of RS in this type of manganites is chiefly an electronic effect. The effect is not only confined to the surface but its spatial extension and even the final resistance state condition can be modulated by the magnitude of potential and the time it is applied. The stability of the different resistance states as a function of temperature and magnetic field was also analyzed.

L'activitat antitumoral del cisplatí, cis-diaminodicloroplatí(II), va ser descoberta per Rosenberg i col. als anys seixanta. Des de llavors, l'efectivitat del cisplatí, d'una banda, i les seves limitacions, de l'altra, han motivat el desenvolupament de nous compostos de platí anàlegs al cisplatí. L'objectiu sempre és el mateix, assolir al màxima activitat i selectivitat amb la mínima toxicitat. Actualment s'empren quatre compostos de platí en el tractament del càncer, aquests són el cisplatí, el carboplatí, el nedaplatí i l'oxaliplatí. Aquest tipus de compostos acostumen a tenir dues posicions làbils, que influeixen en la farmacocinètica del compost, i dues posicions no làbils, que generalment estan ocupades per amines. Aquest o aquests lligands no làbils tenen influència sobre la manera en què el compost interacciona amb el DNA (principal diana biològica) i de com diferents proteïnes reconeixen aquestes lesions en el DNA.Aquest treball s'emmarca dins la síntesi de nous lligands no làbils per a l'obtenció d'una família de complexos de platí amb activitat citotòxica. Es volen establir, en última instància, correlacions estructura-activitat que contribueixin a una millor comprensió dels mecanismes d'actuació d'aquest tipus de compostos i a l'obtenció de nous complexos de platí amb propietats antiproliferatives prometedores. A continuació es resumeix el treball realitzat.· S'ha realitzat la síntesi de diamines terciàries mitjançant diferents mètodes sintètics, tots ells en pocs passos i rendiments acceptables. · La coordinació d'aquests lligands al platí(II) a través dels grups amino, no ha tingut lloc de la forma esperada, a causa de l'impediment estèric dels grups metils de les amines. Tanmateix s'han obtingut dos complexos de platí organometàl·lics, que no s'han descartat a l'hora de realitzar els estudis d'interacció amb el DNA i de citotoxicitat.· La síntesi de diamines es redireccionà cap a l'obtenció d'amines primàries, tant bicícliques com monocícliques. Les diferents síntesis s'han dut a terme mitjançant mètodes versàtils basats en la reacció de Diels Alder, via nitril o via azida, a partir de productes molt accessibles comercialment. S'ha obtingut tota una família de lligands amb un esquelet del tipus 1,2-bis(aminometil)ciclohexà, que presenten diferents característiques estructurals, amb la intenció d'estudiar la seva influència en l'activitat.· A partir de les diamines primàries obtingudes s'han sintetitzat els corresponents complexos de platí(II), on el lligand es coordina al platí a través dels grups amino formant l'anell de set baules esperat. Com a lligands làbils s'han emprat tant clorurs, com iodurs. La substitució de iodurs per altres lligands com els clorurs o l'oxalat, capaços de modificar la farmacocinètica dels compostos, és susceptible d'ésser optimitzada i s'estudiarà en el futur.· S'ha estudiat de forma qualitativa la seva interacció amb el DNA mitjançant diferents tècniques. El dicroïsme circular ha permès l'estudi dels canvis produïts en l'estructura secundària del DNA. Les modificacions produïdes en l'estructura terciària del DNA s'han vist mitjançant electroforesi en gel d'agarosa. Finalment s'han visualitzat les imatges amb al tècnica de microscòpia de forces atòmiques. En general es pot dir que tots els complexos, en major o menor mesura, són capaços de modificar l'estructura del DNA. S'han establert diferents relacions en funció de les característiques estructurals dels lligands no làbils dels complexos. / Since the discovery of its anticancer activity, several new analogs of cisplatin [cis-diamminedichloroplatinum(II), cis-PtCl2(NH3)2] have been synthesized and tested for biological activity. The main goal of this research is to increase the cytotoxicity of the drug relative to cisplatin, and to alleviate side effects that cisplatin treatment brings about. Moreover, in some cases, after the initial treatment tumours become resistant. So the development of drugs without acquired resistance is also an important research field. Some of these platinum compounds are now considered potent anticancer drugs, but only a few are currently being used (cisplatin, carboplatin, oxaloplatin and nedaplatin). Precise mechanism of antitumour action of platinum drugs is not completely understood, but DNA is believed to be the main target of this kind of drugs by forming bifunctional adducts. Within our research project we are working in designing new carrier ligands to establish structure-activity relationship rules. These rules may determine the influence of different functional groups and aid in moving rationally towards an improvement in activity.A new chemical library of 1,4-diaminoligands has been synthesized, in order to prepare the corresponding platinum(II) complexes. These diamines have the same skeleton, (1,2-bis(aminomethyl)ciclohexane), but different structural characteristics, to determine the influence of functional groups and their stereochemistry. Some aspects we are interested in are the influence of an hydroxyl group, the increase of lipophilicity or the steric hindrance. These ligands coordinate platinum(II) by the amino groups forming a seven-membered ring chelate. The synthesis were efficiently carried out starting from commercially available products in few steps. The platinum complexes were studied by elemental analyses, mass spectrometry, IR spectroscopy; and 400 MHz NMR spectroscopy.The ability of the complexes to modify the secondary and tertiary DNA structures was explored by means of circular dichroism (CD), electrophoretic mobility and Atomic Force Microscopy (AFM) techniques.

En aquesta tesi es descriu la íntesi d'una sèrie de lligands diaminats amb una estructura bàsica tipus 1,2-bis(aminometil)ciclohexà, amb diferents propietats estereoelectròniques, així com diferents substituents en l'anell de ciclohexà (hidroxil, metoxil, hexadecil èster, lligands bicícilics, etc.). Les diamines sintetitzades es poden dividir en tres grups: diamines sense substituents en l'anell de ciclohexà (s'estudiaren canvis estereoelectrònics), diamines amb substituents oxigenats en la posició C3 de l'anell de 6 baules (grups metoxil, hidroxil i hexadecil) i diamines amb lligands bicíclics. Les diamines es coordinaren al platí per tal d'obtenir els corrresponents compelxos de paltí(II) en cis anàlegs estructuralment al fàrmac anticancerígen cisplatí, es van obtenir complexos diclorats o diiodats, depenent de la reactivitat del lligand que va provocar que no es poguessin obtenir els compostos diclorats en ttos els casos. Un cop sintetitzats ic aracteritzats els compelxos, es realitzaren assajos d'interacció amb el DNA i assajos d'activitat biològica in vitro. Tots els compelxos es vana anlitzar per electroforesi, dicroïsme circular i microscòpia de forces atòmiques per observar si els complexos de paltí produien canvis en l'estructura secundària i terciària del DNA, observant que tots els compostos portaven a canvis en l'estructura del DNA i que, en alguns casos, aquests canvis es podien relacionar amb paràmetres estructurals dels lligands. Pel cas d'alguns dels compostos bicíclics que ja havien mostrat prèviament una prometadora activitat biològica, es varen dur a terme estudis d'interacció amb el DNA emprant noves metodologies biofísiques en una estada a l'Institut de Biofísica de Brno, a la República Txeca. Aquests estudis mostraren que els compelxos produeixen una interacció amb el DNA semblant a la del fàrmac cisplatí (Emprat com a patró) i, enc anvi, mostraren canvis interessants en la interacció amb la molècula gluatió (responsable d'alguns dels mecanismes de resistència en vers el cisplatí per part de les cèl·lules cancerígenes), en aquest cas s'observaren relacions entre l'activitat biològica in vitro i la interacció amb el glutatió. Finalment es van realitzar estudis de citotoxicitat in vitro amb la línia cel·lular HL 60, obtenint que els compostos sintetitzats presentaven una activitat biològica molt condicionada per la polaritat del lligand (els complexos menys polars donaren lloc a millors activitats). Tanmateix, presentaren una inferior citotoxicitat pitjors que la que mostrava el fàrmac cisplatí sota les mateixes condicions experimentals També s'avaluà l'activitat biològica per citometria de flux, el que ens va permetre establir si la mort cel·lular provocada pels nostres compelxos de platí es produïa per necrosi o per apoptosi (mort cel·lular programada), els resultats derivats d'aquesta tècnica mostraren que la gran majoria de complexos produïen la mort majoritàriament per apoptosi, tot i que en alguns casos el percentatge de mort per necrosi resulta similar o superior. / Synthesis of a series of a series of molecules having a 1,2-bis(aminometil)cyclohexane basic skeleton is described. These diamines have different substituents and stereolectronic properties in order to carry out SAR studies. The diamines were coordinated to platinum(II) yielding the corresponding diiodinated or dichlorinated platinum complexes having a cis structure similar to that of the anticancer drug cisplatin. The interaction of these complexes with DNA was analysed by means of different biochemical and biophysiscal assays such as: electrophoresis, circular dichroism or atomic force microscopy. Finally the potential cytotoxicity of the complexes was evaluated by assays of biological activity in vitro against HL 60 cell line, having results of IC50 values and also determining by flow cytometry the type of cellular death that produced our compounds, necrosis or apoptosis.

En els últims anys s'ha demostrat que els lípids no són només components estructurals de la membrana plasmàtica sinó que a més a més aquests desenvolupen diferents funcions cel·lulars. Concretament s'ha observat que els productes de degradació de les fosfolipases són importants en els processos d'inflamació, entre d'altres; i sembla ser que la fosfolipasa A2 independent de calci podria estar relacionada amb la esquizofrènia. La síntesis de nous potencials inhibidors d'aquesta proteïna per estudiar el metabolisme d'aquests lípids ha estat l'objectiu principal en el transcurs d'aquesta tesi doctoral.Per a dur a terme aquest treball, s'han sintetitzat diferents anàlegs a l'únic inhibidor selectiu d'aquest enzim (BEL), introduint diferents modificacions per intentar obtenir un inhibidor reversible igual de selectiu. Una d'aquestes modificacions va ser la introducció de la funcionalitat trifluorocetona, comú en diferents inhibidors de lipases, en l'esquelet de BEL. Desafortunadament, cap dels compostos sintetitzats sota aquest disseny no va presentar les propietats inhibitòries desitjades. Es va dissenyar una segona família de compostos introduint grups ariloxi- en la estructura de BEL; en aquest cas tampoc es van obtenir bons inhibidors, en canvi, dos d'aquests compostos van augmentar la activitat d'aquest enzim selectivament respecte a la fosfolipasa A2 dependent de calci (cPLA2).Una altra aproximació per dissenyar nous inhibidors va consistir en la síntesi d'anàlegs de substrat. Aquests compostos presentaven un grup n-hexadecilmercaptà a la posició sn-1 i el grup fosforilcolina a la posició sn-3 de l'esquelet de glicerol, amb diferents funcionalitat (amida, carbamat, sulfonamida...) i cadenes laterals diverses a la posició sn-2. Entre els diferents productes sintetitzats, alguns d'ells van presentar nivells d'inhibició destacables, no obstant quan es va estudiar la selectivitat sobre cPLA2 es va observar que també inhibien aquest enzim.Per tal de poder conèixer millor la estructura del centre actiu de l'enzim en estudi i poder dissenyar millors inhibidors es van clonar i expressar en bacteri dos fragments del centre catalític del enzim. Desafortunadament, aquests fragments s'expressaven en petites quantitats i s'agregaven en cossos d'inclusió i els diferents experiments que es van realitzar per resoldre aquests problemes no van conduir a resultats satisfactoris.Durant el transcurs de la tesi, es van preparar, també, diferents anàlegs de ceramida. Els assaigs preliminars d'aquests compostos en diferents enzims del metabolisme d'esfingolípids van mostrar que s'havia dissenyat i sintetitzat una nova família de compostos que obre una línia de recerca prometedora en el camp dels esfingolípids. / In last decades, researchers have demonstrated that lipids are not only structural compounds of cellular membranes. These compounds have several functions in cell metabolism, specifically, phospholipids are cleaved by phospholipases, and their metabolites are secondary messengers in inflammation pathways. Moreover calcium-independent phospholipase A2 (iPLA2) might be linked to schizophrenia. Synthesis of new inhibitors of this enzyme has been the main aim of this work.In our group we have designed different analogues of the only inhibitor of this enzyme (BEL). We introduced several modifications and functional groups, like trifluoroketones, in BEL's structure. Unfortunately, any of these compounds could not inhibit the activity of the enzyme. Some compounds that have an ariloxigroup in alpha position of ketone increase activity of iPLA2 and not produce the same effect in cPLA2.Then, we have synthesized analogues of the natural substrate of phospholipases with several modifications; thioether group in sn-1 position, phosphorilcholine group in sn-3 position and different functional groups (amide, carbamate, sulfonamide.) in sn-2 position.Some of these compounds show inhibition of iPLA2, moreover, they also inhibit cPLA2.To know more information about catalytic mechanism of this phospholipase and design new inhibitors we have cloned and expressed two fragments of catalytic site of the enzyme. However these proteins are not soluble and its levels of expression were very small, and we could not do structural studies like X-ray crystallization.Furthermore, we have designed and synthesized analogues of ceramide. Biological assays of these compounds in several enzymes of sphingolipid metabolism proved that this family opens a new research line in sphingolipid field.

S'ha desenvolupat una nova metodologia que permet unir covalentment l'oligonucleòtid antisentit i el seu mRNA diana mitjançant la formació d'entrecreuaments amb unitats de trans-Pt(NH3)2.En primer lloc, s'han sintetitzat dos derivats fosforamidit de nucleòsid amb grups imidazole i tioèter units a la nucleobase, respectivament, que permeten incorporar aquestes modificacions en oligonucleòtids seguint la metodologia estàndard del fosfit triester. La introducció d'aquests nous grups funcionals a l'extrem 5' no afecta substancialment l'estabilitat del dúplex amb la cadena complementària.S'han portat a terme assajos de platinació d'oligonucleòtids modificats de mida petita amb l'objectiu d'avaluar la capacitat dels nous grups funcionals de coordinar-se a l'ió metàl·lic, així com amb oligonucleòtids de seqüència mixta amb una o dues modificacions a l'extrem 5'. A partir dels resultats obtinguts s'han dissenyat dues estratègies d'entrecreuament: mitjançant hibridació de l'adducte intracadena oligonucleòtid modificat-transplatí a la cadena complementària, o bé partint del dúplex oligonucleòtid antisentit/cadena complementària i afegint transplatí. En ambdós casos s'ha obtingut el mateix adducte intercadena. La caracterització de tots els adductes platinats s'ha portat a terme per oxidació amb H2O2 i digestió enzimàtica, i posterior anàlisi per espectrometria de masses MALDI-TOF.Dels experiments realitzats s'ha conclòs que la millor combinació suposa la introducció del nucleòsid amb el grup imidazole a l'extrem 5' de l'oligonucleòtid antisentit, seguit del nucleòsid amb el grup tioèter. En la reacció amb transplatí es forma ràpidament i regioselectiva un adducte intracadena, en el qual el platí coordina un nitrogen imidazòlic i el sofre del tioèter. La reacció d'entrecreuament té lloc de manera que l'ió metàl·lic migra del sofre al nitrogen 7 d'una guanina situada enfront dels nucleòsids modificats, mantenint-se inalterada la unió al nitrogen imidazòlic de la cadena antisentit. La presència d'una unitat trans-Pt(NH3)2 entrecreuant ambdues cadenes comporta un gran augment de l'estabilitat tèrmica del dúplex. Finalment, s'ha demostrat que la reacció d'entrecreuament només té lloc quan existeix reconeixement entre l'oligonucleòtid modificat i la cadena complementària, resultat rellevant per a una possible aplicació d'aquesta metodologia en el camp de la teràpia antisentit on la diana tant pot ser el mRNA com els miRNAs. / IN ENGLISH:New methodology to allow a covalent union between an antisense oligonucleotide and the mRNA target has been developed. The crosslink is established through a trans-Pt(NH3)2 unit.First of all, two phosphoramidite nucleoside analogs with imidazole and thioether groups linked to the nucleobase, respectively, were synthesized. These derivatives allow the introduction of such modifications in oligonucleotides using standard phosphite triester methodology. The introduction of such modifications at the 5' end does not affect substantially the stability of the duplex with the complementary chain.Oligonucleotide platination assays have been carried out, first with small modified model chains to evaluate the ligand capability of the new functional groups, and then with mixed sequences containing either one or the two modifications at the 5' end. On the basis of the results obtained, two crosslinking strategies have been designed: hybridization of the modified oligonucleotide-transplatin intrachain adduct to the complementary chain, and mixing the antisense oligonucleotide, the complementary chain and transplatin. In the two cases, the same interchain adduct was obtained. All platinated adducts have been characterized by oxidation with H2O2 and enzymatic digestion, as well as MALDI-TOF mass spectrometric analysis. The conclusion from these experiments is that best results are obtained when imidazole-modified nucleoside is placed at the 5' end of the antisense oligonucleotide, next to the thioether-derivatized nucleoside. The reaction with transplatin gives quickly and regioselectively an intrachain adduct in which platinum coordinates one nitrogen of the imidazole ring and the sulfur of the thioether. The crosslinking reaction involves a rearrangement that takes the metal ion from sulfur to the nitrogen 7 of the guanine opposite the modified nucleosides, keeping unaltered the union to the imidazole nitrogen of the antisense chain. The presence of the trans-Pt(NH3)2 moiety crosslinking the two chains notably increases the thermal stability of the duplex. Finally, it has been demonstrated that crosslinking reactions only take place when there is molecular recognition between the antisense oligonucleotide and the complementary chain, which is highly relevant for the possible antisense application of this methodology for targeting either mRNA or miRNAs.

Tesi realitzada a l'Institut de Bioenginyeria de Catalunya (IBEC) / This thesis aims the development of a multi-electrode platform with applications on different biosensing fields: (i) detection of pathogenic bacteria E.coli O157:H7 and (ii) detection of the mycotoxin Ochratoxin A. For most label-free biosensors, including impedimetric biosensors, the principal limitation on multiplexing arises from the affinity step. Therefore, a great part of the research work described here deals with the characterization, optimization and evaluation of different functionalization strategies for biosensing. These surface functionalization strategies developed here are applied for the final development and fabrication of the multi­electrode biosensor. In Chapter 2, we take advantage of the outstanding properties of indium tin oxide (ITO) material for the development of an ITO-based immunosensor for detecting pathogenic E. coli O157:H7 bacteria. The sensor build-up consisted on a simple, efficient and direct covalent binding of anti-E. coli O157 antibodies onto the ITO substrates. The functionalization methodology was fully characterized by multiple techniques, showing the specific binding of E. coli O157:H7 to the antibody­functionalized surface. The detection capacity of the ITO-based immunosensor was finally tested by EIS and a novel highly sensitive and selective sensor was obtained. In Chapter 3, we develop a gold-based electrochemical immunosensor for the detection of pathogenic E. coli O157:H7 bacteria. Gold is bio-compatible, can be easy obtained and it is easy to pattern using photolithography. In order to enhance the sensor performance, the functionalization protocol was optimized and antibodies were immobilized onto gold electrodes following two different strategies. Both functionalization strategies were evaluated and characterized by several techniques and the strategy showing better antibody immobilization was selected for the development of a highly sensitive label-free immunosensor. The immunosensor showed a very low limit of detection and low interference with other pathogenic bacteria. In Chapter 4, we take advantage of the functionalization strategies developed in the previous chapter 3 to develop a miniaturized multi-electrodes array for the detection of pathogenic bacteria. The multi-electrodes were fabricated in gold and consisted of multiple equally independent electrodes. This allowed high-throughput and independent experiments, in parallel and under the same experimental conditions. Multi-electrodes were fabricated by standard photolithography techniques and characterized by several surface analysis and electrochemical techniques, confirming the quality of the fabrication process. We demonstrated the biosensing capabilities of the multi­electrode platform for the detection of pathogenic bacteria using different bioreceptors, including antibodies and antimicrobial peptides. In Chapter 5, we applied the multi-electrodes platform for the development of an aptamer­based sensor for the detection of mycotoxins. We focused on the specific case of ochratoxin A (OTA), one of the most abundant food-contaminating mycotoxins. Two strategies for aptamer immobilization were presented, both based on the hybridization onto the biosensor surface through partially complementary oligonucleotides. Electrochemical techniques were used to characterize all the functionalization steps. The developed multi-sensor was capable to detect OTA concentrations and the promising results obtained prove the successful application of the multi-electrodes strategy for the detection of mycotoxins and the advantages of using multi-electrode platform. / La detección de bacterias patógenas y micotoxinas es la clave para la prevención y la identificación de los problemas relacionados con la salud pública y seguridad alimentaria. En esta tesis hemos desarrollado una nueva plataforma de múltiples electrodos (multi-electrodo) para detección impedimétrica de bacterias patógenas y micotoxinas. Nos hemos centrado en la detección de bacterias E. coli O157: H7, ya que son responsable por brotes de origen alimentario graves. Se han caracterizado y estudiado la influencia de la (bio)interfaz del sensor para el desarrollo de un biosensor altamente sensible. Por esta razón, se probaron diferentes estrategias y materiales (óxido de indio - estaño y oro). Todos los pasos fueron completamente caracterizados por medio de múltiples técnicas y los resultados obtenidos mostraron que los biosensores desarrollados tenían una excelente respuesta en términos de sensibilidad y selectividad. Además, se obtuvieron resultados prometedores usando multi-electrodos. Estos fueron fabricados en oro y consistían en múltiples electrodos iguales e independientes que permiten el alto rendimiento y experimentos en paralelo en las mismas condiciones experimentales. Los multi-electrodos fueron caracterizados por varias técnicas de análisis de la superficie y técnicas electroquímicas, confirmando la calidad del proceso de fabricación. Hemos demostrado las capacidades de biosensores del multi-electrodo para la detección de bacterias patógenas utilizando diferentes bio-receptores, incluyendo anticuerpos y péptidos antimicrobianos. También se aplicaron los multi-electrodos para el desarrollo de sensores basados en aptámeros para la detección de micotoxinas. Nos centramos en concreto en el caso de la ocratoxina A (OTA), una de las más abundantes que contaminan los alimentos. Se presentaron dos estrategias para la inmovilización de aptámeros, ambas basadas en la hibridación de la superficie del biosensor a través de oligonucleótidos parcialmente complementarios. Se utilizaron técnicas electroquímicas para caracterizar todas las etapas de funcionalización. El multi-sensor desarrollado es capaz de detectar concentraciones de OTA y los prometedores resultados obtenidos demuestran la aplicación para la detección de micotoxinas y las ventajas de utilizar multi-electrodos.

Els malalts de Gaucher manquen de l’activitat normal de l’enzim lisosomal Glucocerebrosidasa (GCase), una β–glucosidasa que hidrolitza l’enllaç glicosídic entre la glucosa i la ceramida, i són incapaços de metabolitzar la Glucosilceramida, que s’acumula a l’interior dels lisosomes dels macròfags impedint que aquests funcionin correctament. La presència de mutacions en el gen precursor de la GCase provoca un plegament incorrecte de la proteïna en el recicle endoplasmàtic i impedeixen el seu transport al lisosoma on hidrolitza el substrat i, per tant, aquest últim s’acumula en els lisosomes. Per altra banda, la proteïna es degradada en el mateix reticle endoplasmàtic o en l’aparell de Golgi pels proteasomes. Els tractaments actuals per a aquesta malaltia es basen en la inhibició de la producció de substrat utilitzant inhibidors de l’enzim implicat en la seva biosíntesi o en l’augment de l’enzim mitjançant reemplaçament enzimàtic. Durant els últims anys s’han desenvolupat diverses estratègies terapèutiques per a la malaltia de Gaucher. Entre elles, una que ha despertat un gran interès consisteix en el disseny de xaperones farmacològiques, que són inhibidors competitius de l’enzim que, a concentracions subinhibitòries, s’uneixen a l’enzim mutant per a formar un complex que l’estabilitza, facilita el seu correcte plegament i posterior transport al lisosoma, resultant en un augment de l’activitat enzimàtica i una reducció del substrat acumulat. A partir de treballs previs en el nostre grup d’investigació en els que s’han obtingut una sèrie d’aminociclitols que es comporten com a inhibidors selectius de la GCase recombinant (imiglucerasa), en aquesta tesi s’ha treballat en el disseny i síntesi de nous potencials inhibidors de la GCase que actuïn com a xaperones farmacològiques, especialment sobre variants neuronopàtiques. Per aquestes raons, els objectius i l’estructuració del treball van ser els següents: 1) Síntesi dels epòxids ciclofelitol i (1R,6S)-epi-ciclofelitol i avaluació com a inhibidors irreversibles de la imiglucerasa i la β–glucosidasa d’Streptomyces sp. wt. 2) Síntesi d’una família d’aminociclitols C7N, relacionats estructuralment amb la Glucosilceramida, el substrat natural de la GCase. 3) Síntesi de noves sèries d’amino- i diaminociclitols, realitzant modificacions en la configuració d’alguns centres de l’anell de ciclitol i en la naturalesa dels substituents. 3) Disseny i síntesi d’una nova família de ciclitols amb estructura bicíclica formats per un anell polihidroxilat de 6 baules fusionat amb una isourea o una guanidina cíclica de 5 baules. Es va estudiar la importància que té la configuració dels centres en l’activitat inhibidora de la GCase. S’han fet una sèrie d’estudis biològics amb tots els productes sintetitzats. Alguns dels productes van presentar una elevada potència inhibidora de la GCase, tant d’aquest enzim en fibroblasts wild-type com de la imiglucerasa, amb valors de la Ki de l’ordre nanomolar i no van presentar una inhibició destacable sobre altres glicosidases. Després de comprovar que els compostos, que havien resultat ser potents inhibidors de la imiglucerasa, estabilitzen l’activitat d’aquest enzim en condicions de desnaturalització tèrmica, es va estudiar el potencial d’aquests compostos com a xaperones farmacològiques de la GCase amb la col•laboració del Dr. Terry D. Butters. Quan es van tractar els limfoblasts de malalts de Gaucher de les variants N370S o L444P amb alguns dels compostos a concentracions subinhibitòries, es van obtenir augments de l’activitat de la GCase en les cèl•lules tractades respecte a les cèl•lules no tractades. Les concentracions efectives dels compostos en aquest augment són de l’ordre micromolar, nanomolar o fins i tot subnanomolar. Dels resultats obtinguts es pot deduir que, a més de l’alta afinitat per la GCase, alguns compostos presenten la permeabilitat cel•lular, distribució subcel•lular i metabolisme cel•lular adequats per actuar com a xaperones farmacològiques a concentracions molt baixes, de l’ordre nanomolar o inferior. / Gaucher disease (GD) is the most prevalent lysosomal storage disorder caused by a deficiency in the activity of β–glucocerebrosidase (GCase), the lysosomal enzyme responsible for glucosylceramide metabolism into glucose and ceramide. GCase deficiency results in the accumulation of undegraded substrate in the lysosomes of macrophages causing severe symptoms. Approved treatments for GD include enzyme replacement therapy and pharmacological GCase substrate reduction, which are of limited efficacy for disease variants affecting the central nervous system. Recently, a third promising therapeutic option, the pharmacological chaperone therapy, has emerged. This therapy is based on the use of reversible competitive GCase inhibitors that are capable of enhancing its residual hydrolytic activity at sub-inhibitory concentrations by stabilizing the functional form of the misfolded protein and preventing its premature degradation in the endoplasmic reticulum. This improves enzyme trafficking to the lysosome and enhances its hydrolytic activity. The objectives of this thesis were: 1) The synthesis of (i) epoxides cyclophellitol and (1R,6S)- epicyclophellitol, (ii) C7N aminocyclitols derivatives, (iii) new amino- and diaminocyclitol derivatives, and (iv) polyhydroxylated bicyclic isoureas and guanidines. 2) Evaluation of these compounds as inhibitors of recombinant GCase and other glycosidases. Study the effect of the active compounds on the stabilization of recombinant GCase activity against thermal denaturation, to assess the potential of these compounds as pharmacological chaperones (PC). 3) Evaluation of selected compounds as inhibitors of GCase in wild-type human fibroblasts and exploration of the therapeutical potential as PC in human lymphoblasts derived from Gaucher patients homozygous for N370S or L444P variants. When assayed for effects on GCase activity, some of the compounds displayed selective inhibition of GCase with low micromolar to nanomolar IC50’s in isolated enzyme experiments. Interestingly, the active compounds also behaved as GCase inhibitors in wild-type human fibroblasts at nanomolar concentrations. The potential of these compounds as PC was determined by analyzing their capacity for increasing GCase activity in GD lymphoblasts derived from N370S and L444P variants. Some of the compounds are able to increase the GCase activity at low micromolar to subnanomolar concentrations. These results describe a promising series of potent GCase ligands having the cellular properties required for PC.

L’estudi de la presència i distribució dels contaminants orgànics persistents en el medi ambient és avui dia un tema de gran interès social degut als efectes nocius que aquests compostos provoquen en el organismes vius i a la seva capacitat per a bioacumular-se a través de la cadena tròfica. A més dels compostos que es troben en el llistat de substàncies perilloses del Conveni d’Estocolm (bifenils policlorats (PCBs), policlorodibenzo-p-dioxines i furans (PCDDs/Fs) i pesticides organoclorts), alguns que s’hi han afegit recentment (2009) com els polibromodifenil èters (PBDEs) o sulfonats de perfluorooctà, en els últims anys s’ha detectat en el medi ambient la presència de nous contaminants com les parafines clorades (CPs). Aquest fet, ha comportat que s’hagi proposat la seva inclusió en el llistat de compostos que s’estan avaluant per ser inclosos en el Conveni d’Estocolm i s’hagin inclòs en la directiva marc de l’aigua de la Unió Europea. Atès que la informació que es disposa actualment relativa a la seva presència i distribució en el medi ambient és encara limitada, és d’interès disposar de mètodes d’anàlisi ràpids i fiables que permetin la seva determinació amb una elevada sensibilitat i selectivitat L’objectiu principal d’aquesta tesis és el desenvolupament de metodologies analítica per a l’anàlisi de CPs i d’altres contaminants orgànics persistents per tal de estudiar la seva presència i distribució en mostres ambientals i alimentàries. En una primera part de la tesi s’ha estudiat l’aplicabilitat de l’extracció assistida per microones com a alternativa a les tècniques d’extracció tradicional per l’anàlisi de CPs en mostres de sediments, per tal de disposar d’un mètode ràpid i senzill per l’anàlisi d’aquest compostos en matrius abiòtiques d’elevada complexitat. Tanmateix, s’ha avaluat l’aplicabilitat d’un mètode multi-component per l’anàlisi de mescles de CPs i d’altres famílies de contaminants, com les PCDD/Fs, els PCBs i els PBDEs, en mostres de bivalves i peixos destinats al consum humà. En ambdós casos, els mètodes s’han aplicat a l’anàlisi de CPs i altres contaminants en sediments d’origen fluvial i marí fortament influenciats per l’activitat industrial i en productes del mar procedents d’àrees d’especial interès pesquer i ecològic, com és el Delta de l’Ebre. En una segona part d’aquesta tesi s’ha estudiat l’aplicabilitat de la cromatografia de gasos multidimensional integrada (GCxGC) per a la separació i caracterització de mescles de CPs i la seva determinació en mostres ambientals. Amb aquest objectiu, en primer lloc es van estudiar diferents combinacions de columnes en les dues dimensions per tal d’aconseguir la màxima separació entre els components de les mescles i estudiar la seva composició i naturalesa. En segon lloc, es va desenvolupar un mètode GCxGC acoblat amb un espectròmetre de masses amb analitzador de temps de vol (TOF-MS) per dur a terme la identificació i quantificació de les CPs en mostres ambientals. Per altra banda, s’ha avaluat la capacitat de la GCxGC en l’anàlisi de CPs i d’altres contaminants, com els PCBs i els PBDEs, en mostres de sediments per tal de disposar d’un mètode ràpid i fiable per a la determinació conjunta d’aquestes tres famílies de compostos. Finalment, en aquesta tesi s’ha estudiat l’aplicabilitat de l’acoblament GCxGC-MS amb analitzador quadrupolar com a alternativa al TOF, per a l’anàlisi de mescles de CPs. En aquest sentit s’ha pogut demostrar la idoneïtat d’aquest tipus d’analitzador, treballant en condicions que proporciona la màxima velocitat d’adquisició sense perdre informació espectral, ja que permet acostar-se a les prestacions del TOF i, en conseqüència, es pot utilitzar per l’anàlisi i caracterització de mescles de CPs i d’altres famílies de contaminants. / Today, the study of the presence and distribution of the persistent organic pollutants (POPs) in the environment is a matter of social interest since these compounds cause harmful effects on living organisms and exhibit a high capacity to bioaccumulate through the trophic chain. In recent years, new persistent pollutants, such as chlorinated paraffins (CPs), have been detected in the environment. These compounds show similar characteristics and properties than those included into the Stockholm Convention list, the initial one with polychlorinated biphenyls (PCBs), polychlorodibenzo-p-dioxins and dibenzofurans (PCDD/Fs), organochlorinated pesticides, and also those added later (2009), such as polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) or perfluorooctane sulfonate (PFOS). As a consequence, CPs have been proposed to be included into the POP list of the Stockholm Convention and are considered as priority substances by the Oslo and Paris Commission (OSPAR). Moreover, they have been included in the list of priority hazardous substances in the field of water policy of the European Union (Directive 2002/45/EC). Since information about the levels and distribution of CPs in environment is still limited and the characterization and quantification of CP mixtures is a complex task, there is a need to dispose of reliable, sensitive and selective analytical methods for their determination in environmental matrices. The aim of this work is double, on the one hand the development of methodologies for the analysis and characterization of CPs and on the other, the study of their presence and distribution in environmental and food samples.