La hipótesis general de este trabajo se basa en que un protocolo de hipoxia hipobárica intermitente (IHH) combinada con ejercicio aeróbico ligero en normoxia, puede tener un efecto beneficioso en la regeneración de musculatura esquelética dañada y contribuir a una recuperación más rápida en este tipo de lesiones. Sin embargo, el conocido efecto hematopoyético de la exposición a hipoxia y del ejercicio, y el consiguiente aumento de hematocrito, podrían afectar a la dinámica del aporte de oxígeno a los tejidos, por lo que se hace necesario conocer y estudiar los potenciales efectos de estos tratamientos sobre la hematología y la reología sanguínea. Además, se ha dedicado especial atención a la presencia de células madre circulantes (CD34+) y a la población de “side population” (SP) en médula ósea para obtener evidencias de su posible incidencia en la recuperación de la lesión muscular. El núcleo fundamental de esta tesis doctoral está compuesto por dos estudios que tienen como objetivos: 1. Determinar si la respuesta hematopoyética durante un programa IHH, podría provocar alteraciones en el comportamiento hemorreológico, generando efectos negativos en el suministro de oxígeno a los tejidos. 2. Cuantificar y contrastar los efectos de la IHH y el ejercicio en el aumento del número de células progenitoras en la circulación sanguínea periférica. 3. Determinar los efectos de la IHH combinada o no con el ejercicio aeróbico ligero en normoxia, genera cambios en la presencia de SP. 4. Establecer la dinámica temporal en las modificaciones de la concentración de células madre CD34+ y SP en los diferentes grupos de animales, según las diferentes condiciones experimentales. La muestra se obtuvo de ratas Sprague-Dawley que fueron estudiadas en dos estados basales (no entrenadas y entrenadas) y comparadas durante la fase de recuperación de una lesión por contracción excéntrica repetida (inducida a ratas entrenadas) los días 1, 3, 7 y 14 posteriores a la lesión muscular. Los tres grupos experimentales estudiados durante la recuperación de sus lesiones musculares fueron: ratas con recuperación pasiva (CTRL); ratas expuestas a IHH después del daño muscular (HYP); y ratas entrenadas que además de IHH, realizaron sesiones de ejercicio aeróbico ligero (EHYP). Los resultados obtenidos en los estudios, nos permiten extraer las siguientes conclusiones: 1. Después de dos semanas de tratamiento, la IHH en combinación con ejercicio aeróbico ligero en normoxia, muestra parámetros hemorreológicos alterados en comparación a las demás condiciones experimentales. 2. Aunque la respuesta eritropoyética provocada por la exposición IHH tiende a aumentar la viscosidad de la sangre en el grupo EHYP, otros parámetros microrreológicos tales como mayor elasticidad y menor tiempo de relajación pueden contribuir a compensar este aumento. 3. Los ajustes compensatorios reológicos pueden considerarse como positivos desde un punto de vista funcional, pues contribuyen a mantener la microcirculación normal y un suministro adecuado de oxígeno, nutrientes y agentes químicos a los tejidos durante su proceso de reparación después de daño sufrido en el músculo esquelético. 4. La tinción DyeCycle Violet se retiene selectivamente para las células CD34+, que permite la discriminación de los dos subconjuntos de células, denominadas internamente como CD34+/DCVhigh y CD34+/DCVlow, debido a una intensidad más brillante o atenuada de la tinción. 5. En el séptimo día de la recuperación después de una lesión muscular, el grupo EHYP aumentó claramente el número de progenitores CD34+/CD45neg y CD34+/CD45+. 6. El grupo HYP aunque no muestra un aumento en células progenitoras después de la lesión muscular, es altamente sensible a la expresión de células SP las primeras horas de exposición. 7. La exposición a IHH parece ser decisiva en la expresión de la población SP, aunque el estímulo inducido por el ejercicio mostró un efecto inverso sobre su cinética. / The general hypothesis of this PhD dissertation document is based on the possible favorable effects of a protocol of intermittent hypobaric hypoxia (IHH) combined with light aerobic exercise in normoxia. We have tested if such IHH program can elicit a beneficial effect on the regeneration of skeletal muscle damage and contribute to a faster recovery in this type of injury. However, the well-known hematopoietic action of hypoxia exposure and exercise can alter the erythrocyte mass and even the circulatory dynamic at microcirculatory level. We have focused on the rheological properties of blood, presence of circulating stem cells and the dynamics of bone marrow side population (SP) cells. The core of this thesis is composed by two main studies whose general objective are: 1. To determine if the erythropoietic response elicited by intermittent hypobaric hypoxia exposure can alter blood rheology and thus affect in any way the oxygen delivery to tissues. 2. To outline if the IHH exposure can help to increase the number of peripheral blood circulating progenitor cells (CD34+) and bone marrow side population stem cells, in order to establish the usefulness of this intervention for skeletal muscle repair. Male Sprague-Dawley rats were studied in two basal states: untrained and trained and compared with trained rats that suffered skeletal muscle injury (down-hill running until exhaustion) at four stages (1, 3, 7 and 14 days) during damage recovery. Three experimental groups of wounded trained rats were studied: rats with passive recovery (CTRL); rats exposed to IHH after muscle damage (HYP); and, rats that, in addition to IHH, performed light aerobic exercise sessions (EHYP). The results obtained in this thesis allow us to conclude that the IHH in combination with light aerobic exercise in normoxia showed a higher erythropoietic effect, but without threatening the perfusion of damaged muscle because advantageous hemorheological adjustments. DyeCycle® Violet staining is selectively retained into CD34 + cells, thus allowing to the discrimination of two subsets of cells, internally referred as CD34+/DCVhigh and CD34+/DCVlow cells. Finally, IHH in combination with light aerobic exercise increased the number of CD34+/CD45neg and CD34+/CD45+ cells on the 7th day in EHYP group, although the exercise-induced stimulus showed a reverse effect on SP kinetics.

Tesi realitzada conjuntament amb la "Aarhus University, Institute of Bioscience" / The páramo is a high mountain ecosystem that includes the natural and semi-natural habitats located between the montane treeline and the permanent snowline in the humid Northern Andes. Given its recent origin and continental insularity among tropical lowlands, the páramo evolved as a biodiversity hotspot, with a vascular flora of more than 3400 species and high endemism. Moreover, the páramo provides many ecosystem services for human populations, essentially water supply and carbon storage. Anthropogenic activities, mostly agriculture and pasture practices, as well as climate change are major threats for the páramo’s ecological integrity. Consequently, further scientific research and conservation strategies must be oriented towards this unique region. Botanical and ecological knowledge on the páramo is extensive but heterogeneous. Moreover, most research studies and management strategies are carried out at local to national scale and given the vast extension of the páramo, regional studies are also needed. The principal limitation for regional páramo studies is the lack of a substantial source of good quality botanical data covering the entire region and freely accessible. To meet the needs for a regional data source, we created VegPáramo, a floristic and vegetation database containing 3000 vegetation plots sampled with the phytosociological method throughout the páramo region and proceeding from the existing literature and our fieldwork. We made VegPáramo accessible online through a webportal, www.vegparamo.com, from which the data can be freely consulted and downloaded. We then used the VegPáramo data to conduct a regional vegetation classification of the páramo. We used a clustering technique and classified the region into 17 clusters, 14 representing natural phytogeographical units of one or several plant communities and 3 artificial ensembles. We characterized the 17 clusters and estimated the alpha diversity and beta diversity to highlight species richness and floristic similarities. Our last study focused on the plant diversity patterns in the páramo region. We used the VegPáramo data and our classification results to estimate and compare plant diversity at local and regional scale in the altitudinal belts of the páramo. We evaluated the importance of the environment as driver of species richness using regression models. Finally, we modeled the predicted species richness in the páramo region and highlighted biodiversity hotspots. Our project contributes to a better understanding of the páramo biogeography and makes primarily suggestions for conservation. We believe further research should focus on the impacts of climate change on the páramo flora and vegetation. / La región biogeográfica que incluye los ecosistemas naturales y semi-naturales de alta montaña distribuidos entre el bosque montano y las nieves perpetuas en los Andes del Norte recibe el nombre de páramo, el cual es considerado un hotspot de biodiversidad, con más de 3.400 especies de plantas vasculares y un alto grado de endemismo. La gran biodiversidad del páramo se debe en gran parte a su reciente origen y a su insularidad continental. Los páramos proporcionan muchos servicios ecológicos a las poblaciones humanas, sobretodo en el subministro de agua y el secuestro de carbono. Las actividades antrópicas como la agricultura y el pastoreo, y el cambio climático son las principales amenazas para el equilibrio ecológico del ecosistema. Consecuentemente, es imprescindible aumentar nuestro conocimiento científico y proponer nuevas estrategias de gestión y de conservación. La mayoría de estudios botánicos y ecológicos sobre el páramo, al igual que los planes de gestión, se desarrollan desde escala local hasta nacional. Aunque estos estudios son aportaciones de gran valor científico, también es importante considerar el ecosistema en toda su extensión para obtener unos resultados y patrones válidos en la región biogeográfica. Los estudios regionales sobre la biogeografía de plantas en el páramo son muy escasos, siendo las principales limitaciones la dificultad de establecer colaboraciones científicas y de gestión internacionales y la falta de fuentes de datos biológicos de buena calidad y de libre acceso. Consecuentemente, construimos VegPáramo, una base de datos de flora y vegetación para el páramo andino, que contiene 3.000 inventarios de vegetación muestreados con el método fitosociológico en la región, y que proceden tanto de la literatura como de nuestro trabajo de campo. Creamos un portal web para VegPáramo, www.vegparamo.com, a partir del cual se pueden consultar y descargar los datos libremente. Usamos los datos de VegPáramo para clasificar la vegetación de páramo a nivel de la región. Con una metodología de clustering no-jerárquico, clasificamos el páramo en 17grupos (o clusters) de los cuales 14 representan a unidades fitogeográficas naturales conteniendo una o varias comunidades vegetales y 3 son artificiales. Caracterizamos los 17 grupos por su flora diagnóstica y los comparamos a nivel de diversidad alpha y beta. Finalmente, usamos los datos de VegPáramo y los resultados de nuestra clasificación para estimar y comparar la diversidad de plantas a escala local y regional en los pisos altitudinales del páramo con el objetivo de destacar y entender los principales patrones de riqueza florística en la región. Evaluamos el poder explicativo del ambiente en la riqueza florística mediante modelos de regresión. Finalmente, modelamos la riqueza florística potencial en la región y destacamos unos hotspots de biodiversidad. Nuestro proyecto contribuye a entender mejor el páramo como región biogeográfica y propone primeras sugerencias de áreas concretas para la conservación. Pensamos que los esfuerzos futuros de investigación y de gestión deberían enfocarse particularmente en los impactos del cambio climático sobre la flora y la vegetación del páramo.

Tesi realitzada a l'Institut de Química Avançada de Catalunya (IQAC-CSIC) / El principal objetivo de la presente tesis es la obtención de espumas de quitosano mediante la utilización de emulsiones altamente concentradas de tipo aceite en agua (O/W). Para alcanzar dicho objetivo, este trabajo ha requerido la realización de diversas fases: (a) la selección del sistema tensioactivo mediante el estudio del comportamiento fásico, (b) la preparación de emulsiones altamente concentradas de tipo aceite en agua (O/W) en presencia de quitosano en la fase externa, (c) el estudio de la influencia de distintos parámetros en el tamaño de gota de las emulsiones, (d) la obtención y caracterización de las espumas de quitosano estudiando sus propiedades estructurales, (e) la preparación y caracterización de nanofilms de quitosano entrecruzado como sistema modelo para el estudio de la respuesta al pH y (f) el estudio de la posible aplicación de las espumas de quitosano en la eliminación de colorantes. Los tensioactivos seleccionados para la preparación de las emulsiones fueron dos tensiactivos hidrófilos, Synperonic A7 y Pluronic® P123. Ambos tensioactivos se caracterizaron por poseer un variado comportamiento fásico, formando diferentes estructuras tensioactivas. A continuación, las emulsiones se caracterizaron mediante microscopía óptica para estudiar la variación del tamaño de gota en función del tiempo. Así, se determinó su estabilidad y la influencia sobre el tamaño de gota de la incorporación de quitosano, la variación de la concentración de tensioactivo y la velocidad de agitación durante la emulsificación. Dicho estudio se realizó durante 72 h a 40 ºC, condiciones utilizadas posteriormente para la obtención de las espumas de quitosano. La incorporación de quitosano produjo una reducción del tamaño de gota, efecto atribuido al incremento de la viscosidad de la fase continua de las emulsiones, debido al aumento de la cizalla durante la emulsificación. Dicho efecto podría mostrar un valor de diámetro mínimo, como indicaron los resultados con el tensioactivo Pluronic® P123. Este estudio también reflejó que las emulsiones presentaban un leve proceso de coalescencia y maduración de Ostwald, producidos de forma simultánea. La caracterización de estos sistemas mediante reología indicó un aumento importante del módulo elástico (G’LVR) con la incorporación de quitosano y el incremento de la concentración de tensioactivo que da lugar a estructuras de cristal líquido. El ligero proceso de coalescencia observado, produjo una reducción del módulo elástico en función del tiempo. No obstante, las emulsiones se consideraron suficientemente estables para ser utilizadas en la preparación de espumas de quitosano. El quitosano fue entrecruzado con un reactivo natural, la genipina. La caracterización del proceso de entrecruzamiento mediante reología demostró que éste podía considerarse finalizado a tiempos inferiores a 48 h. Las espumas de quitosano obtenidas presentaban una estructura macroporosa, con poros entre 200 y 500 nm y valores de superficie específica entre 25 y 63 m2/g. Finalmente, se estudió la respuesta al pH de nanofilms de quitosano como sistema modelo. Éstos mostraron respuesta al pH, con hinchamiento a pH ácido y encogimiento a pH básico, los cuales se podrían considerar reversibles. Se aplicaron entonces las espumas de quitosano como sistemas de adsorción de colorantes. La baja capacidad de adsorción presentada (~ 0,03 g colorante/g material) se atribuyó al alto entrecruzamiento de los materiales. La utilización de tensioactivos aceptados por la FDA (Food and Drug Administration), como el Pluronic® P123, junto con una reducción del grado de entrecruzamiento del quitosano para aumentar su capacidad de adsorción, podrían dar lugar a sistemas potencialmente aplicables en diversos sectores como en tratamiento de aguas residuales, industria cosmética, farmacéutica o médica. / The main objective of the present thesis is the preparation of chitosan foams using an emulsion-templating technique. For this purpose, different stages were accomplished: (a) selection of surfactant systems by the study of phase behaviour, (b) preparation of oil-in-water highly concentrated emulsions with chitosan in the external phase, (c) determination of the influence of different parameters in the emulsion droplet size, (d) preparation and characterization of chitosan foams, (e) study of the pH response of chitosan nanofilms and (f) evaluation of chitosan foams in dye removal. Chitosan incorporation produced a droplet size reduction that was attributed to the increase of the viscosity in the continuous phase, which produced a shear increase during the emulsification. These results could demonstrate the presence of a minimum droplet size value through increasing viscosity. The variation of droplet size also showed weak coalescence and Ostwald ripening processes, which took place simultaneously. The rheological characterization of these systems presented an important increase of elastic modulus (G’LVR) due to the chitosan incorporation and the surfactant concentration increase, which gave rise to the formation of liquid crystalline structures. Also, a decrease of G’LVR was detected as a function of time due to the weak coalescence process detected. These emulsions could be considered appropriate and stable systems, to use them for the preparation of chitosan foams. Chitosan was crosslinked with a natural reagent, genipin. The characterization of the crosslinking process by rheology demonstrated that it is almost completed before 48 h. The chitosan foams showed a macroporous structure, with pore diameter below 500 nm and surface area values from 25 to 63 m2/g. Finally, the pH response of chitosan nanofilms was investigated and they showed swelling at acid pH and shrinkage at basic pH, which could be considered reversible. Then, chitosan foams were applied as adsorbents for dye removal. Low removal capacities were obtained (~ 0,03 g dye/g material), attributed to the high chitosan crosslinking. The proposal reduction of crosslinking could give rise to potentially applicable systems as wastewater treatment, cosmetic, pharmacological or healthcare industries.

Tesi realitzada a l'Institut de Química Avançada de Catalunya (IQAC-CSIC) / El control integrat de plagues (IPM) és una estratègia respectuosa amb el medi ambient utilitzada per combatre les destructives plagues que anualment causen importants pèrdues econòmiques al sector agrícola, minimitzant l’ús de pesticides químics. L’aplicació de feromones pel control de plagues s’utilitza actualment amb èxit tot i que presenta algunes limitacions com el seu cost final més elevat que el dels pesticides biocides, una eficàcia garantida sols a nivells baixos d’infestació o la possible atracció de poblacions veïnes. Al llarg del present treball s’ha dut a terme l’obtenció de diversos compostos de tipus metilcetona i trifluorometilcetona anàlegs estructurals de la feromona sexual de diverses espècies d’arnes plaga, tots ells obtinguts amb un elevat rendiment global i una estereoselectivitat excel·lent. L’objectiu ha estat avaluar-ne el seu efecte antagonista i estudiar la seva aplicabilitat pel control de plagues com una alternativa a les pròpies feromones. Concretament, s’ha dut a terme la síntesi a escala multigram de la (10E,12E)-tetradeca-10,12-dien-2-ona (1), anàleg estructural de la feromona sexual de Cydia pomonella, important plaga de pomers, perers, presseguers i pruners, mitjançant un procediment on s’ha minimitzat tant el volum de dissolvent com la quantitat de reactius tòxics. Els assajos de confusió sexual en camp amb la metilcetona anàloga 1 han mostrat que aquesta no produeix una reducció de captures en relació a una parcel·la control tractada només amb feromona. S’ha desenvolupat la síntesi de 4 anàlegs monoènics de la feromona sexual de Lobesia botrana, principal plaga de la vinya, (E)-9-tetradecen-2-ona (2), (E)-1,1,1-trifluoro-9-tetradecen-2-ona (3), (Z)-11-tetradecen-2-ona (4) i (Z)-1,1,1-trifluoro-11-tetradecen-2-ona (5). Als experiments per avaluar l’activitat en camp d’aquests anàlegs no s’hi ha demostrat efecte inhibidor de l’atracció feromonal amb la mescla feromona-inhibidor 1:10. S’han obtingut 4 compostos anàlegs estructurals de la feromona de Grapholita molesta, plaga de presseguers, albercoquers, pruners i cirerers, (Z)-10-tetradecen-2-ona (6), (Z)-1,1,1-trifluoro-10-tetradecen-2-ona (7), (E)-10-tetradecen-2-ona (8) i (E)-1,1,1-trifluoro-10-tetradecen-2-ona (9). En proves electrofisiològiques (EAG), l’exposició dels mascles a vapors de 100 µg de les metilcetones 6 i 8 i la trifluorometilcetona 7 anàlogues a la feromona de G. molesta ha induït una disminució significativa de la resposta antenal a l’estímul feromonal. Entre aquests compostos, la trifluorometilcetona 7 és l’anàleg que ha produït la màxima inhibició de la resposta d’EAG (60%). Per la seva banda, en assajos de comportament en túnel de vent solament la trifluorometilcetona 7 ha produït una reducció significativa dels contactes amb la font emprant una mescla de feromona-inhibidor 1:10. Als assajos de camp s’ha observat activitat antagonista amb les metilcetones 6 i 8 a una dosi de feromona-inhibidor 1:10, mentre que la trifluorometilcetona 9 ha exhibit un cert efecte sinèrgic de captures en comparació amb la feromona sola. S’ha desenvolupat una nova ruta sintètica de la feromona sexual de Tuta absoluta, devastadora plaga de tomaqueres amb un rendiment global més elevat que qualsevol dels procediments anteriorment descrits (23.5%) i una puresa estereomèrica final excel·lent (97% E,Z,Z). S’han obtingut 8 anàlegs feromonals; (5E,10Z,13Z)-5,10,13-hexadecatrien-2-ona (10), (5E,10Z,13Z)-1,1,1-trifluoro-5,10,13-hexadecatrien-2-ona (11), (5E,10Z)-5,10-hexadecadien-2-ona (12), (5E,10Z)-1,1,1-trifluoro-5,10-hexadecadien-2-ona (13), (5E,13Z)-5,13-hexadecadien-2-ona (14), (5E,13Z)-1,1,1-trifluoro-5,13-hexadecadien-2-ona (15), (10Z,13Z)-10,13-hexadecadien-2-ona (16) i (10Z,13Z)-1,1,1-trifluoro-10,13-hexadecadien-2-ona (17). En assajos de camp, els anàlegs 10 i 13 han produït una disminució significativa i reproduïble de captures amb una mescla feromona-inhibidor 1:10, mentre que els anàlegs 11 i 12 han demostrat un efecte antagonista circumstancial. Per la seva banda, els anàlegs 14-17 no van mostrar cap efecte antagonista. S’ha assajat la identificació d’un possible component de la feromona sexual de Paysandisia archon, important plaga de palmeres, mitjançant la síntesi i elucidació estructural de l’acetat de (E)-2-octadecen-1-il (18), l’acetat de (Z)-2-octadecen-1-il (19) i l’acetat de (E)-3-octadecen-1-il (20). El producte 20 és el que presenta una similitud estructural més propera a la del possible component feromonal. / The integrated pest management (IPM) is a combination of environmentally friendly strategies for pest control in agriculture aimed to rationalize the use of chemical pesticides. For the last decades, synthetic sex pheromones of pest insects are being used in IPM with much success, although it has some limitations. In the present work it has been carried out the synthesis of several methyl ketones and trifluoromethyl ketones, which are structurally related to the sex pheromone of some species of pest moth. All these analogues have been obtained through optimized synthetic procedures resulting in a high overall yield and stereoselectivity. The antagonistic effect of the synthesized analogues has been determined in laboratory and field tests in order to evaluate their convenience as an alternative to pheromones for pest control. It has been developed in a multigram scale the synthesis of (10E,12E)-tetradeca-10,12-dien-2-one (1), analog of the apple pest, Cydia pomonella, sex pheromone. Mate disruption field experiments with methyl ketone 1 have not shown any reduction of captures compared with the use of pheromone. The monoenic analogues of grape wine pest, Lobesia botrana, (E)-9-tetradecen-2-one (2), (E)-1,1,1-trifluoro-9-tetradecen-2-one (3), (Z)-11-tetradecen-2-one (4) and (Z)-1,1,1-trifluoro-11-tetradecen-2-one (5), have been obtained. In field experiments these compounds have not shown antagonistic effect in a pheromone-inhibitor (1:10) proportion. It has been carried out the synthesis of the peach pest, Grapholita molesta, pheromone analogues: (Z)-10-tetradecen-2-one (6), (Z)-1,1,1-trifluoro-10-tetradecen-2-one (7), (E)-10-tetradecen-2-one (8) and (E)-1,1,1-trifluoro-10-tetradecen-2-one (9). In electrophysiology experiments, trifluoromethyl ketone 7 has induced a 60% of inhibition of the antennal response to a pheromone stimulus, and the same compound produced a significant inhibitory effect in wind tunnel tests. Further, methyl ketones 6 and 8 showed antagonistic activity in field experiments. A new synthetic route of the pheromone components of the devastating tomato pest, Tuta absoluta, has been achieved in a higher overall yield (23.5%) than previously reported and an excellent stereoselectivity. Additionally, eight pheromone analogues have been synthesized; (5E,10Z,13Z)-5,10,13-hexadecatrien-2-one (10), (5E,10Z,13Z)-1,1,1-trifluoro-5,10,13-hexadecatrien-2-one (11), (5E,10Z)-5,10-hexadecadien-2-one (12), (5E,10Z)-1,1,1-trifluoro-5,10-hexadecadien-2-one (13), (5E,13Z)-5,13-hexadecadien-2-one (14), (5E,13Z)-1,1,1-trifluoro-5,13-hexadecadien-2-one (15), (10Z,13Z)-10,13-hexadecadien-2-one (16) and (10Z,13Z)-1,1,1-trifluoro-10,13-hexadecadien-2-one (17). Analogues 10 and 13 have produced a reproducible significant reduction of captures in field tests. In order to identify a possible sex pheromone component of palm tree pest, Paysandisia archon, the following compounds have been obtained: (E)-2-octadecen-1-yl acetate (18), (Z)-2-octadecen-1-yl acetate (19) and (E)-3-octadecen-1-il acetate (20), among which compound 20 showed the closest structural similarity to the unknown pheromone component.

Tesi realitzada a l'Institut de Química Avançada de Catalunya (IQAC-CSIC) / Els iminociclitols són compostos alcaloides cíclics polihidroxilats mimètics de sucres, en els quals l’àtom d’oxigen endocíclic es troba substituït per un àtom de nitrogen. Són atractius farmacològicament ja que molts d'ells mostren activitat inhibidora d'enzims relacionats amb el processament d'hidrats de carboni i han resultat vitals pel desenvolupament de nous fàrmacs, com antiinflamatoris, antitumorals, antivírics i antibiòtics. Així doncs, és un repte i objectiu important disposar d’aquestes molècules polifuncionalitzades mitjançant síntesis senzilles. La síntesis orgànica clàssica d’aquestes molècules és complexa a causa de principalment tres factors: la necessitat de múltiples i complexes seqüències de protecció/desprotecció, dificultats en el control de la estereoselectivitat a causa de l’elevat nombre de centres estereogènics i en el seu aïllament i purificació. Per tant, una bona alternativa és la utilització d’enzims com catalitzadors en síntesis asimètriques donat els avantatges sobre les metodologies químiques clàssiques com són l’elevat grau de control de la estereoquímica i les condicions suaus de reacció. Les reaccions es duen a terme en medi aquós, fet que ofereix una opció mediambiental més atractiva. En la present Tesi es presenten excel·lents estratègies quimioenzimàtiques per a l'obtenció d'iminociclitols mono i bicíclics on l'etapa clau i central del procés és l'addició d'un donador a un aldehid acceptor catalitzada per aldolases natives o modificades genèticament. Les aldolases són un grup específic de liases que catalitzen de manera reversible la formació estereoselectiva d’enllaços caboni-carboni mitjançant una reacció aldòlica. Generalment aquests enzims són molt selectives en quan a llur tolerància del substrat donador (nucleòfil), però accepten una gran diversitat estructural d’aldehids acceptors (electròfil). En aquest treball s'han emprat aldolases dependents de glicina, de dihidroxiacetona fosfat (DHAP) i la D-fructosa 6-fosfat aldolasa d’Escherichia coli (FSA). En la primera part de la Tesi, es presenta un innovadora estratègia quimioenzimàtica que permet la síntesi d'una col·lecció de noves estructures de derivats polihidroxilats de l'àcid pipecòlic, homoiminociclitols piperidínics i pirrolidínics a partir de substrats simples i aquirals en tres passos sintètics i creant fins a cinc centres estereogènics. L'estratègia es basa en dues etapes claus d'addició aldòlica consecutives biocatalítiques. En la primera etapa clau biocatalítica s'empraren aldolases dependents de glicina, obtenint derivats d'àcid .-hidroxiamínics amb estereoquímica controlada. Llurs adductes aldòlics obtinguts es convertiren en els substrats de la segona etapa clau per mitjà de transformacions químiques senzilles. Les aldolases dependents de glicina D-treonina aldolasa són poc conegudes. Per això, prèviament es dugué a terme un estudi de la producció de la D-treonina aldolasa d'Achromobacter xylosoxidans i la seva aplicabilitat com a biocatalitzador. En la subsegüent etapa aldòlica clau, s'empraren les aldolases dependents de DHAP rhamnulosa 1-fosfat aldolasa i fuculosa 1-fosfat aldolasa, ambdues de E.coli, i la FSA. Finalment, els productes finals s'obtingueren per mitjà de l'aminació reductiva dels adductes aldòlics obtinguts. En la segona part del treball es presenta la síntesi d'una col·lecció de 47 iminociclitols mono i bicíclics de tipus pirrolidines, piperidines, pirrolizidines, indolizidines i quinolizidines. L'etapa clau en aquesta síntesi fou l'addició aldòlica dels donadors a-hidroxicarbonílics DHA, HA i GO a N-Cbz-aminoaldehids catalitzades per noves variants de FSA. L’iminosucre final s’obté per mitjà de la desprotecció del grup amino i aminació reductora en un sol pas per hidrogenació catalítica de l'adducte aldòlic. Les noves variants de FSA s'obtingueren prèviament en aquest treball a partir del redisseny del centre catalític de l'enzim per enginyeria de proteïnes a fi d'incrementar l'afinitat d'aquest biocatalitzador en les addicions aldòliques d'interès de DHA, HA i GO a N-Cbz-aminoaldehids voluminosos o conformacionalment restringits. Les noves variants de FSA es produïren a partir de les plataformes FSA A129S/A165G per DHA i HA i FSA L107Y/A129G/A165G per GO per mitjà de mutagènesi de lloc dirigit o de saturació de lloc. Les variants FSA A129S/R134X/A165G/S166G i FSA L107Y/A129G/R134X/A165G/S166G on X: P, R, S i V generaren conversions més elevades en les addicions aldòliques d'interès. / Iminocyclitols are an attractive class of glycomimetics which possess inhibitory properties against glycosidases and glycosyltranferases and an enormous therapeutic potential for the treatment of several diseases such as cancer, viral infections, type II diabetes, and lysosomal storage disorders, among others. The synthesis of these compounds can be obtained by chemoenzymatic strategies in an excellent and fashion way. A chemoenzymatic approach in organic synthesis is based on the combination of chemical reactions and biocatalytic, using microorganism or enzymes, to prepare organic compounds with minimal steps and high atom economy. Furthermore, the mild conditions required for enzymatic transformations and the use of water as a solvent makes biocatalysis one of the greenest technologies able to fulfill the ongoing need for economically and environmentally more sustainable industrial processes. Among enzymes, aldolases are one of the most promising classes of biocatalysts being able to construct chiral molecular frameworks from simple precursors by means of direct asymmetric aldol additions. In the first part of this Thesis a multistep chemoenzymatic synthesis for stereodiverse polyhydroxypipecolic acid analogues, homoiminocyclitols and polyhydroxylated piperidine and pyrrolidine derivatives combining glycine-dependent aldolases and both D-fructose-6-phosphate aldolase (FSA) or dihydroxyacetone phosphate (DHAP)-dependent aldolases is presented. The methodology allowed the preparation of known and innovative imine-derived molecules with a great structural diversity from simple achiral substrates. In the second part, a structure-guided redesign of D-fructose-6-phosphate aldolase from E. coli (FSA) was devised for improving the acceptor tolerance towards alpha-substituted and conformationally constrained aldehydes. FSA A129S/R134X/A165G/S166G and L107Y/A129G/R134X/A165G/S166G variants, where X was R, V, P, or S were the most suited biocatalysts for dihydroxyacetone, hydroxyacetone and glycolaldehyde additions to 20 alpha-substituted N-Cbz-aminoaldehydes including pyrrolidine and piperidine derivatives. Full kinetic stereocontrol for si-si face addition of the FSA-bound nucleophile to the N-Cbz-aminoaldehyde carbonyl was observed furnishing the corresponding D-threo configured aldol adduct in >95:5 dr as assessed by NMR. After reductive amination, 47 different iminocyclitols were identified and characterized. In some examples partial racemization of the corresponding aldehyde was observed, which appears to be produced mostly during the aldol addition reactions.

El principal objetivo de esta Tesis es el estudio de la viabilidad analítica de nuevos dispositivos electródicos como son los electrodos serigrafiados modificados con bismuto o antimonio como materiales alternativos al mercurio en la determinación y especiación de metales pesados mediante técnicas voltamperométricas. La tecnología del serigrafiado permite la fabricación de dispositivos económicos y desechables de sistemas electródicos como alternativa a los electrodos clásicos que se pueden adaptar a instrumentación portátil. Los electrodos serigrafiados (SPEs), pueden ser modificados con metales como el bismuto o el antimonio por métodos de electrodeposición vía in-situ o ex-situ, utilizando una solución de Bi(III) o de Sb(III); también pueden modificarse a través de un precursor metálico, o se puede obtener mediante la técnica de sputtering. Por otro lado existe un creciente interés en la búsqueda de materiales electródicos alternativos del mercurio, menos tóxicos que éste pero con un comportamiento electroquímico similar (amplio rango catódico de trabajo, sensibilidad y reproducibilidad), especialmente para cumplir con las crecientes demandas de dispositivos para monitoreo ambiental in-situ de metales pesados. Entre estos materiales, el bismuto y más recientemente el antimonio han demostrado tener un comportamiento analítico adecuado que los hace aparecer como una alternativa en la determinación de metales pesados mediante técnicas voltamperométricas. Para conseguir los objetivos planteados se han realizado diversos estudios que se comentan a continuación. En primer lugar se presentan los resultados obtenidos cuando se utilizan BiSPEs. Se caracterizan los dispositivos considerados (ex-situ BiSPCE, in-situ BiSPCE, BiOxSPCE y BispSPE) tanto física como analíticamente, se compara el comportamiento de los diferentes dispositivos entre ellos y el electrodo de gotas de mercurio y se aplican estos dispositivos a la determinación de Cd(II) y Pb(II) en un material de referencia (agua subterránea) y en aguas de pozo de El Salvador. Los BiSPEs demostraron ser una alternativa a los electrodos de mercurio en la determinación de estos metales. Además, de entre estos electrodos se presenta al BiSPE obtenido por técnicas de sputtering como una alternativa ventajosa a los BiFEs y a los BiSPCEs obtenidos modificando un SPCE vía in-situ o ex-situ, debido a que no es necesario ningún tratamiento antes del análisis de la muestra ya que presentan unos LOD muy favorables. El electrodo BispSPE demostró tener un comportamiento analítico similar al del HMDE en la determinación de Cd(II) y Pb(II) en muestras de aguas de pozos. En esta Tesis se ha utilizado por primera vez un electrodos serigrafiados de carbono modificados con bismuto vía ex–situ en estudios de complejación; en concreto se han estudiado las interacciones del Cd(II) con ligados de interés medioambiental por voltamperometría de impulsos diferencial y técnicas quimiométricas para el tratamiento de los datos. Estos dispositivos han demostrado ser una alternativa a los electrodos de mercurio y a los de película de bismuto en este tipo de estudios. En segundo lugar se han estudiado las posibilidades que presentan los electrodos serigrafiados modificados con antimonio en la determinación de metales pesados. En concreto se ha considerado un SPCE modificado vía in-situ y se ha aplicado a la determinación de Cd(II), Pb(II) y Cu(II) en un material certificado (agua subterránea). Este dispositivo demostró ser una opción al in-situ BiSPCE para la determinación de estos metales en particular para el Cu(II), no solo por presentar un menor LOD para este metal, sino porque no se observa competencia entre el Sb(III) y Cu(II) por depositarse en la superficie del electrodo. Como resultado de los estudios de investigación llevados a cabo en esta Tesis, se han publicado cuatro artículos en diferentes revistas científicas. Estas publicaciones son la base del trabajo expuesto en esta Tesis. / The main goal of this Thesis is to study the analytical possibilities of screen printed electrodes (SPEs) modified with bismuth or antimony as new alternative materials to mercury for the determination and speciation of heavy metals by voltammetric techniques. The screen printing technology permits the fabrication of low cost, small size and disposal devices, as an alternative to classic electrodes that can be suitable for portable instrumentation. The SPEs can be modified with metals as bismuth or antimony by electrodeposition methods via ex-situ or in-situ, also can be modified using a metallic precursor or by sputtering the metal on a ceramic substrate. First of all, SPE modified with bismuth were studied. The devices considered (ex-situ BiSPCE, in-situ BiSPCE, BiOxSPCE and BispSPE) were characterized microscopically and analytically compared between them and with the HMDE, and applied for the determination of heavy metals in natural samples. The BiSPEs proved to be an option to mercury electrodes for the analysis of these metals. Between them the electrode obtained by the sputtering techniques has demonstrated to be a good alternative to HMDE, and also to classic BiFEs. The provided LOD and LOQ for Pb(II) and Cd(II) analysis were in all cases at the level of μg L-1. Furthermore ex-situ BiSPCEs have been used for the first time for the analysis of the complexation of Cd(II) by thiol containing compounds as glutathione (GSH) and phytochelatin (PC2). The data were treated by multivariate curve resolution by alternating least squares (MCR-ALS), demonstrating that the results are in good agreement with those previously obtained with mercury electrodes. Finally, the possibilities of SPCEs modified with Sb(III) via in-situ for the determination of Cd(II), Pb(II) y Cu(II) in natural samples were studied. The SbSPEs were microscopically characterized and experimental parameters for the determination of heavy metals by anodic stripping voltammetry were optimized. The in-situ SbSPCE demonstrated to be a good alternative to in-situ bismuth film electrodes for the determination of these metals ions in particular for copper, since no competition between copper and antimony for surface sites was noticed.

This thesis aims at providing a better understanding of the micro- and nanofabrication of conducting polymers for biomedical devices and presents novel processes that widen the application range of conducting polymers in this field. The thesis is divided in four chapters, namely “Materials and Methods”, “Biocatalytically-produced polypyrrole thin films and microelectrodes on insulating surfaces”, “Azide-PEDOT electrodes. Application to DNA sensors” and “Fabrication of polypyrrole single nanowire devices”. Chapter 1, entitled “Materials and Methods”, describes the materials used in this work and the fabrication and characterization methods required for the development of the thesis. Here, theoretical and experimental details about the techniques employed, are provided. Chapter 2, entitled “Biocatalytically-produced polypyrrole thin films and microelectrodes on insulating surfaces”, presents a new on-surface biocatalytical procedure for the fabrication of polypyrrole microelectrodes on insulating surfaces, with resolutions comparable to the ones of conventional photolitography. This is an environmentally respectful microfabrication method that allows the entrapment of biomolecules during the polymer synthesis in a single step. As a proof of concept, biotin was trapped in the polypyrrole matrix and then released in a controlled way through electrical stimulation. It was proven that the polymer keeps its electroactivity after the fabrication and functionalization processes. This biocatalytical-based technique represents a straightforward method for the microfabrication of biological-active conducting polymers, which could be implemented in implantable devices for remotely controlled tissue interactions. Chapter 3, entitled “Azide-PEDOT electrodes. Application to DNA sensors”, describes the fabrication and testing of an electrochemical label-free DNA hybridization sensor, based on novel azidomethyl-modified poly(3,4-ethylenedioxythiophene) electrodes (azide-PEDOT electrodes). These azide-PEDOT electrodes were used as platforms for the immobilization of acetylene-DNA probes, complementary to the “Hepatitis C” virus. The acetylene-DNA probes were covalently grafted to the polymer backbone via the robust “Click” reaction, which a part from being a very selective functionalization method, preserves DNA from denaturation during the synthesis of the polymer. DNA hybridization was detected by Differential Pulse Voltammetry (DPV), where the electrochemical change of the polymer behaviour, produced by the recognition event, was directly evaluated. This fabrication procedure is a powerful tool for the preparation of label-free DNA sensors able to selectively recognize a specific DNA sequence, down to the nanomolar range. Finally, Chapter 4, entitled “Fabrication of polypyrrole single nanowire devices”, discusses the fabrication of polypyrrole at the nanoscale. Two fabrication techniques were investigated here, namely dip pen nanolithography and electrochemical polymerization on template-assisted surfaces. On one hand, the dip pen nanolithography proved to be a simple deposition technique with good control over size and location of the polypyrrole nanowires. On the other hand, the electrochemical polymerization on template-assisted surfaces provided as well nanoscaled polypyrrole, but added the possibility to chemically manipulate the polymer. This chemical manipulation was translated into polymer devices with different electrical properties. By the use of these techniques, the capability of fabricating single nanowire devices (ready to use in different applications) and arrays of ordered nanowires based on conducting polymers is demonstrated. Additionally, two appendixes can be found at the end of the thesis: Appendix A: “Fabrication of azide-PEDOT microwire-based devices” and Appendix B: “Fabrication of nanopatterns by electron-sensitive silanes”. They provide short experimental results obtained during the course of this work, which are first steps for future investigations. A general conclusions section can be found at the end of the thesis, where a summary of the main achievements and contributions of this thesis are listed. / Aunque los polímeros conductores se presentan como una alternativa viable a los materiales convencionalmente usados en aplicaciones biomédicas, las técnicas de fabricación adaptadas a ellos y el aprovechamiento de sus propiedades están lejos de ser completos. Existen importantes limitaciones en la fabricación de micro y nano estructuras basadas en polímeros conductores. Debido a la agresividad de las técnicas tradicionalmente usadas en microelectrónica, se hace necesaria la búsqueda de nuevas estrategias de fabricación adaptadas a polímeros conductores, así como de nuevos procesos que puedan mejorar el rendimiento de los dispositivos diseñados. En esta tesis titulada “Conducting polymers micro and nano electrodes. Application to biomolecule sensing and release”, se han investigado nuevas técnicas de fabricación y de funcionalización de polímeros conductores, poniendo un especial interés en su aplicación biomédica. Una nueva técnica de fabricación de microestructuras de polipirrol por método biocatalítico sobre superficies aislantes ha sido desarrollada con resoluciones comparables a las de la litografía óptica. Dicha técnica es compatible con la incorporación de biomoléculas durante el proceso de síntesis, lo que garantiza su utilización en entornos biológicos. Esto fue demostrado mediante la incorporación de biotina durante el proceso de polimerización y su posterior liberación, mediante estimulo eléctrico. También se ha desarrollado un nuevo sensor de ADN sin marcaje basado en electrodos de azida-PEDOT, para la detección de secuencias basadas en la “Hepatitis C”. Estos electrodos, permiten la directa y covalente funcionalización con secuencias de ADN, modificadas con grupos acetileno, por medio de la química “Click”. La hibridación fue detectada mediante la evaluación de la electroactividad del polímero tras el suceso de reconocimiento. Esta novedosa modalidad de sensores demostró ser selectiva y sensible, siendo capaz de detectar secuencias complementarias en el rango nM, sin necesidad de marcajes, ni complejas técnicas de microfabricación. Finalmente, se estudiaron dos técnicas de fabricación de nanohilos de polímero conductor: nanolitografía de dip-pen y electropolimerización sobre superficies con plantillas. Estos estudios proveen al incompleto campo de la fabricación de nanoestructuras de polímeros conductores de resultados adicionales, que amplían el campo de aplicación de dichos materiales.

Los bacteriófagos portadores de genes están relacionados con la patogenicidad de las bacterias a las que infectan. Los fagos representan, pues, potenciales elementos móviles entre especies bacterianas filogenéticamente cercanas. La producción de Stx se ha demostrado en otras enterobacterias distintas de "E. coli", por tanto, la transferencia del carácter mediada por lisogenización de los fagos portadores del gen de la Stx 2, podría explicar la presencia de las toxinas Stx en diferentes cepas bacterianas, así como el amplio rango de variabilidad de la familia de las toxinas de "Shigella".Hasta el momento, ningún estudio previo permitía estimar la cantidad de fagos portadores de genes implicados en patogenicidad circulantes en el medio ambiente. Los resultados obtenidos dan información sobre la cantidad de estos fagos en muestras de agua residual, de su amplia distribución y de su persistencia ante diferentes procesos de inactivación.A fin de detectar la presencia de los fagos portadores del gen de la Stx 2 en agua residual se aplicó una metodología basada en la amplificación del gen de la Stx 2, transportado por estos fagos, mediante la técnica de la PCR. Para ello se purificaron bacteriófagos a partir de diferentes volúmenes de agua residual del área urbana de Barcelona, se extrajo el ADN de dichos fagos y se amplificó un fragmento del gen de la Stx2 por PCR anidada.Los resultados obtenidos por PCR anidada se corroboraron mediante "Southern blot" y "dot blot", hibridando con una sonda radiactiva específica. Asimismo, los amplímeros obtenidos por PCR anidada fueron secuenciados y comparados con la secuencia del gen de la Stx 2, inserto en el bacteriófago 933 W (código EMBL X07865), verificándose que realmente se estaba amplificando el gen de la Stx 2.Se pretendió comprobar, además, si los fagos portadores del gen de la Stx 2 eran infecciosos para una cepa de "E. coli" 0157:H7. Para ello se realizaron cultivos de enriquecimiento con una cepa de "E. coli" 0157:H7 (ATCC 43888) no portadora del gen de la toxina. Estos cultivos se enriquecieron con fagos parcialmente purificados de agua residual y se incubaron a fin de permitir la multiplicación de los fagos. Se purificaron los fagos presentes en los sobrenadantes de los cultivos de enriquecimiento, se extrajo su ADN y se amplificó el gen de la Stx 2 por PCR anidada. La infectividad de estos fagos para 0157:H7 quedó demostrada con el hecho de que se detectaran en volúmenes de 0,1 ml de agua residual (llegando en una ocasión a ser detectados en 0,02 ml), después de haber infectado un cultivo de 0157:H7, mientras que no se detectaban en los mismos volúmenes cuando se analizaba directamente la muestra, sin enriquecimiento previo. La caracterización complementaria de los amplímeros obtenidos ("dot blot" y "SouthemBlot"), así como el estudio de las secuencias de dichos amplímeros mostraron que, efectivamente, se detectó el gen de la toxina presente en el genoma de fagos purificados de agua residual infecciosos para "E. coli" 0157:H7.Se quiso verificar si la infección de fagos portadores del gen de la Stx 2 a una cepa de "E. coli" 0157:H7 no portadora del gen de la toxina (ATCC 43888), podía inducir la producción de la toxina Stx 2 por parte de dicha cepa. Para comprobarlo, se detectó la subunidad A de la Stx 2 en el sobrenadante de los cultivos de 0157:H7 infectados con fagos purificados de agua residual, mediante "Westem blot" e inmunodetección con anticuerpos monoclonales específicos contra la subunidad A de la Stx 2. Dicha subunidad fue detectada en todos los sobrenadantes analizados.A fin de verificar si la toxina producida era o no funcional se realizaron pruebas de citotoxicidad. Para ello se inocularon 0,1 mI de los sobrenadantes obtenidos a partir de los cultivos de enriquecimiento sobre un cultivo de células Vero. Los resultados mostraron citotoxicidad en algunas de las pruebas realizadas. Estos resultados, así como los obtenidos mediante "Westem blot", demostraron que algunos de los fagos portadores del gen de la Stx 2 infecciosos para 0157:H7 presentes en agua residual, transportan el gen completo en su genoma y que éste se expresa en su totalidad.A partir de los resultados obtenidos mediante PCR anidada, se realizó la estimación del número de fagos portadores del gen de la Stx 2 en agua residual del área urbana de Barcelona. Para ello, se agruparon todas las muestras de un mismo origen y se calculó, para cada volumen de muestra analizada, el número de muestras que presentaron resultado positivo respecto al total de muestras analizadas. A estos resultados se aplicó la técnica del Número Más Probable. La aproximación realizada indicó que el número de fagos portadores del gen de la Stx 2 infecciosos para 0157:H7 en aguas residuales del área urbana de Barcelona oscila entre 1 y 10 fagos/ml de agua residual. Esto representa aproximadamente el 1 % del conjunto de fagos infecciosos para 0157:H7.Siguiendo la misma metodología, se pudo detectar también la presencia de fagos portadores del gen de la Stx 2 en aguas residuales de distintos orígenes geográficos, algunas de ellas con contaminación de origen animal. Por ello hay que considerar la presencia de fagos portadores del gen de la Stx 2 en agua residual como un hecho general, aunque más variable que la presencia de "E.coli", colifagos somáticos o los fagos que infectan a 0157:H7.Asimismo, se estudiaron las secuencias del fragmento del gen de la Stx 2 amplificado mediante PCR anidada. Este estudio mostró que en su mayoría los amplímeros mostraban idéntica secuencia que el gen de la Stx 2. Sin embargo, algunos de los amplímeros secuenciados mostraban ciertas diferencias, demostrando la variabilidad de los fagos-Stx 2. Este estudio abre la posibilidad de que existan fagos portadores de genes que codifican para alguna variable de la Stx 2, por lo que consideramos que la metodología empleada podría ser útil para determinar la presencia de fagos portadores de los genes que codifican para las variables de la Stx 2.Se realizaron estudios a fin de evaluar la persistencia de los fagos portadores del gen de la Stx 2, demostraron que estos fagos presentan una gran persistencia ante diferentes procesos de inactivación natural y tratamientos de depuración siempre muy superior a "E. coli" 0I57:H7.Por último, se realizó un estudio basado en la inactivación diferencial de distintas morfologías de colifagos somáticos frente a diferentes procesos de inactivación natural y tratamientos de depuración. Los resultados obtenidos indicaron que los fagos del tipo "Siphoviridae" presentan mayor persistencia a los procesos de inactivación que otros tipos morfológicos de bacteriófagos. Teniendo en cuenta que los fagos portadores del gen de la Stx 2 corresponden a la familia "Siphoviridae", esto implica que estos fagos son más persistentes ante procesos de inactivación atendiendo a su morfología. Dado que los bacteriófagos son, en general, más resistentes que "E. coli" a la desinfección (Sobsey y col., 1989), a tratamientos de depuración (Jofre y col., 1995) y a la inactivación natural en aguas (Bell, 1976; Kott y col., 1968), se puede pensar que en realidad los bacteriófagos son los que actúan como reservorio natural de genes en el medio ambiente.Creemos que este trabajo abre interesantes perspectivas sobre el estudio de fagos que son portadores de genes que codifican para la Stx, y que debe determinarse la importancia de los fagos en la transferencia de estos genes entre diferentes especies de enterobacterias en condiciones naturales. Otros autores (Datz y col., 1996; Martins y col., 1992, Beutin y col., 1997) sugieren asimismo que serian interesantes más estudios encaminados a determinar la distribución de los bacteriófagos en ambientes acuáticos y determinar el papel que juegan como elementos de transmisión entre diferentes cepas bacterianas. Esta información podría dar lugar a que la política sanitaria actual, referida tanto a tratamientos de depuración de aguas como a prácticas sanitarias con alimentos, fuese ajustada a fin de minimizar riesgos. / Shiga toxin-converting bacteriophages are involved in the pathogenicity of some enteric bacteria such as "Escherichia coli" 0I57:H7, but data on the occurrence and distribution of such phages in nature were not available.We developed an experimental approach to detect the presence of the Shiga toxin 2 (Stx2), encoding bacteriophages in sewage from Barcelona area. The Stx 2 gene was amplified by PCR from phages concentrated from sewage. MoReover, the phages carrying the Stx 2 gene were detected in supematants from bacteriophage enrichment cultures using a Stx 2 negative "E. coli" 0157:H7 infected with phages purified from sewage. Additionally, the A subunit of Stx 2 was detected in the supematants of the bacteriophage enrichment cultures, which also showed cytotoxic activity for Vero cells. Applying the most probable number technique to the obtained results, it was estimated that the number of phages infectious for "E. coli" 0157:H7 and carrying the Stx 2 gene was in the range of 1 to 10 per ml of sewage (approximately 1% of all phages infecting "E. coli" 0157:H7).We also detected the presence of phages carrying the Stx 2 gene in sewage samples from different geographic origins (8 different countries).A sequence of a fragment of the Stx 2 gene carried by these phages showed some variability and suggests that phages could carry Stx 2-variant genes.Studies of the persistence of phages carrying Stx 2 gene against the persistence of the strain of "E. coli" 0157:H7 to natural inactivation and to disinfection processes indicated that phages carrying the Stx 2 gene show higher persistence to inactivation processes than "E. coli" 0157:H7.Studies to evaluate the different persistence of different bacteriophage morphological types under inactivation processes (using water samples where natural inactivation occurs and for treatment processes) showed than "Siphoviridae" phages with flexible tails persist better to all these processes than other bacteriophage morphological types. As phages carrying Stx 2 gene are members of Siphoviridae family, these phages may be expected to be very persistent to inactivation processes. We concluded that phages carrying Stx 2 gene may be the reservoir of the Stx 2 gene in natural environments.

A partir de una muestra de sedimento marino procedente de la Antártida se aisló una cepa adaptada al frío que llamaba la atención por el aspecto mucoso de sus colonias, lo cual sugería la producción de material extracelular. Esta cepa también destacó por desprender un olor característico que se atribuyó a la producción de compuestos orgánicos volátiles de azufre (VOSCs). Con el objetivo de caracterizar el nuevo aislamiento antártico, se procedió a realizar su clasificación taxonómica polifásica mediante pruebas genéticas, fenotípicas y quimiotaxonómicas. Posteriormente, se caracterizó el material extracelular producido por la nueva bacteria antártica a nivel estructural y químico. También se estudiaron sus propiedades, principalmente su capacidad emulsionante, crioprotectora y osmoprotectora, con el fin de explorar posibles aplicaciones biotecnológicas. En la última parte de este estudio, se analizaron los VOSCs producidos por el nuevo aislamiento antártico y se identificó el dimetilsulfuro (DMS) como el principal de ellos. El DMS es un gas de gran importancia debido a que es la mayor fuente de origen biológico que se transfiere desde los océanos a la atmósfera en el ciclo global del azufre. Además, es un potente quimioatrayente para aves, crustáceos y mamíferos marinos y ha sido ampliamente estudiado por su posible efecto en la regulación del clima. Se estudiaron los posibles sustratos para la producción de DMS en esta bacteria adaptada al frío y se identificó y caracterizó una nueva ruta de síntesis de DMS a partir de metanotiol (MeSH) e independiente de dimetilsulfoniopropionato (DMSP). Se identificó el gen implicado en la producción de DMS a partir de MeSH y se demostró que su expresión no estaba afectada por ninguno de los sustratos o condiciones ensayadas y tampoco estaba localizado cerca de ningún gen relacionado con el metabolismo del azufre. Este gen codifica una proteína con 4-6 dominios transmembrana que sin embargo se localiza en agregrados fibrilares citoplasmáticos que están ausentes en el mutante. Además, esta proteína está presente en una amplia variedad de importantes grupos taxonómicos incluyendo Pseudomonas sp., múltiples cepas de actinobacterias de los géneros Gordonia, Rhodococcus y Mycobacterium, incluyendo a los patógenos M.tuberculosis y M.avium; miembros de los rhizobiales incluyendo los fijadores de N2 Bradyrhizobium y Mesorhizobium y cianobacterias fijadoras de N2 incluyendo Cyanothece sp., Pseudoanabaena sp., y Nodosilinea sp. Finalmente, la proteína que cataliza la conversión de MeSH en DMS, está presente en la mayoría de metagenomas consultados, aunque se observan abundancias relativas más elevadas en ambientes terrestres, particularmente en metagenomas de suelo. / A cold-adapted bacterial strain was isolated from an Antarctic marine sediment sample. This strain caught the attention because of the mucous appearance of its colonies, which indicated the production of extracellular material. Notably, this isolate produced a characteristic smell that was apportioned to volatile organic sulfurous compounds (VOSCs). With the aim of characterising the new Antarctic isolate, its polyphasic taxonomy classification was performed by genetic, phenotypic and chemotaxonomic analyses. The extracellular material produced by the Antarctic strain was also chemically and structurally characterised and its properties were studied, focusing on its emulsifying, cryoprotectant and osmoprotectant capacities to evaluate its potential biotechnological applications. In the final component of this study, the VOSCs produced by the new Antarctic isolate were analysed and dimethylsulfide (DMS) was identified as the main compound. DMS is a very important gas because it is the most abundant biogenically derived form of sulfur transferred from the sea to the air in the global sulfur cycle. Also, it is a potent chemoattractant for birds, crustaceans and marine mammals and it has been widely studied for its potential effects on climate regulation. Possible substrates for DMS production were studied and a novel pathway for DMS synthesis from methanetiol (MeSH) and independent of dimethylsulfoniopropionate (DMSP) was identified and characterised in this new Antarctic strain. The gene involved in DMS production from MeSH was identified and it was shown that is not regulated in response to none of the substrates and conditions tested, and neither is it located near any genes related to sulfur metabolism. This gene encodes a protein with 4-6 transmembrane domains but localises in cytoplasmic fibers that are absent in the mutant. Moreover, this protein is present in many varied and important taxonomic groups including Pseudomonas sp., multiple strains of actinobacteria of the genus Mycobacterium, including the pathogens M. tuberculosis and M. avium, Gordonia and Rhodoccocus; rhizobiales members including the N2-fixing Bradyrhizobium and Mesorhizobium and N2-fixing cyanobacteria such as Cyanothece sp., Pseudoanabaena sp., and Nodosilinea sp. Finally, the protein that catalyses the conversion of MeSH into DMS, is present in most of the metagenomes analysed, but higher relative abundances are seen in terrestrial environments, particularly in soil metagenomes.

Durante la exposición de un ectotermo tanto a temperaturas fisiológicas como extremas, se producen una serie de respuestas ventilatorias como sistema de termorregulación y adaptación al nuevo ambiente y que son distintas dependiendo del periodo de aclimatación del individuo. Además, los reptiles presentan un patrón ventilatorio particular, con una ventilación intermitente, experimentado amplias fluctuaciones en las tensiones de gas pulmonar durante los periodos de apnea. Los datos existentes de respuestas ventilatorias frente a cambios de temperatura, sobre todo extremas, en tortugas son escasos, e inexistentes en la tortuga de agua dulce "Mauremys caspica", por lo que nos propusimos una serie de objetivos, que son:- Elaborar un modelo para el estudio comparado del intercambio de gases pulmonares en animales ectotermos, definiendo más claramente las relaciones existentes entre patrón ventilatorio y temperatura en los reptiles.- Conocer las respuestas ventilatorias frente a distintas temperaturas fisiológicas (15, 25, 35 °C) Y extremas (5, 40ºC) durante la ventilación espontánea de la tortuga de agua dulce "Mauremys caspica".- Analizar la mecánica pulmonar de esta especie durante un ciclo ventilatorio, teniendo en cuenta el efecto del caparazón sobre la expansión pulmonar en los quelonios.- Definir su comportamiento termorregulador y analizar su temperatura critica máxima con el fin de obtener un rango de temperaturas extremas para analizar su ventilación pulmonar.En el estudio de mecánica ventilatoria del sistema pulmonar total de esta especie, los datos de compliancia se encuentran dentro del rango dado para reptiles con un tipo de estructura pulmonar multicameral, aunque los valores de compliancia relativa al peso corporal son mayores que los hallados para otras tortugas, denotando un pulmón más adaptable, a la vez que menos septado, indicado por su menor grado de histéresis. Esta mayor compliancia incluye de forma significativa en el trabajo ventilatorio de manera que esta especie puede mantener unos niveles de respiración aeróbica con un menor trabajo ventilatorio y en consecuencia con menos coste energético. En cuanto al volumen pulmonar, esta especie presenta unos valores aproximadamente dos veces mayores que otras tortugas mejorando de esta manera su capacidad de flotación. El volumen pulmonar en reposo (Vu) constituye el 25 % del peso corporal del animal.Para establecer la relación existente entre el patrón de intercambio de gas y temperatura, se han hecho estudios sobre la variación de los gases pulmonares (P(Lco2), P(Lco2) durante los periodos de apnea de la ventilación espontánea de "Mauremys caspica" a distintas temperaturas (5-40ºC), representándose gráficamente los resultado sobre un diagrama O(2)-CO(2).Los animales presentan un control respiratorio efectivo de la alcalinidad relativa con la temperatura dentro de un rango de 5 a 35°C. Este control se manifiesta por un progresivo aumento de los valores de la P(Lco2), y un decrecimiento de la P(Lo2), al incrementarse la temperatura corporal.Se ha dibujado también sobre este diagrama, modificado al punto de aire inspirado, las líneas correspondientes a la tasa de intercambio respiratorio (R) determinadas experimentalmente. La intersección de estas R con las curvas de gas, nos dan los valores estimados de ventilación alveolar por unidad de CO(2), eliminado a través de los pulmones (VA/Vco), presentando una relación inversa con respecto a la temperatura entre 5 y 35 °C, no así a 40°C en que sufre un incremento significativo. A esta temperatura, el patrón ventilatorio típico, dado para la mayoría de los reptiles, se modifica. El aumento de la V/Vco2, debido a una hiperventilación, va acompañado por una disminución de la Poo2 alveolar. Sin embargo, el impacto de la respuesta ventilatoria sobre los valores de la P(ACO)2, es menor del esperado, debido al marcado incremento hallado en el valor del espacio muerto fisiológico (V(D)). También la frecuencia ventilatoria y el volumen corriente contribuyen a esta respuesta ventilatoria a la hipertermia. Como conclusión se puede especular que un incremento del volumen corriente de alrededor del 60 %, tal como se ha encontrado entre 35 y 40 °C, puede incrementar posiblemente la ventilación de zonas pulmonares pobremente perfundidas, situadas en la zona terminal del pulmón. Esta desviación de la ventilación puede elevar la pérdida de agua por evaporación, reduciendo el impacto de la respuesta ventilatoria sobre el equilibrio ácido-base debido a un ajuste desigual de la ventilación-perfusión. Esto podría constituir una especie de jadeo, en el cual una ventilación profunda puede incrementar el V(D).En el estudio dinámico de la variación de los valores de la P(ACO)2 durante un calentamiento y enfriamiento continuo entre 25-47"C, se ha encontrado un ciclo de histéresis, siendo los valores de la P(ACO)2 mayores para la fase de calentamiento, con un valor máximo a los 37 ºC. Los valores inferiores de P(CO)2 alveolar hallados durante el enfriamiento, implican unos niveles de ventilación distintos con respecto al calentamiento, relacionándolo con la posible existencia de termorreceptores cutáneos.La tasa de intercambio de calor en aire, es mayor durante la fase de enfriamiento que durante el calentamiento En agua se invierten los resultados, lo que indica la existencia de mecanismos fisiológicos de control.Se han encontrado desviaciones con respecto a una relación logarítmica inversa entre peso corporal y tasa de intercambio de calor. La variación de la temperatura con respecto al tiempo, en animales sometidos a un escalón térmico ambiental, se ajusta mejor a un sistema de segundo orden, que considera la capacidad calorífica del compartimento periférico, que no a uno de primer orden. La constante de tiempo para ganancia o pérdida de calor presenta una relación lineal con el peso corporal.El gradiente entre temperatura ambiental y corporal se incrementa considerablemente cuando la temperatura ambiental sobrepasa los 40 ºC. El hecho de que el calentamiento en aire se produzca de una manera lenta y no se alcance el equilibrio térmico final, sugiere una pérdida de calor por evaporación, relacionada con una hiperventilación termorreguladora. / The respiratory mechanics on the total pulmonary system of the turtle "Mauremys caspica" has been studied. The observed values for the compliance and the hysteresis in this species agree with those from other reptiles with multicameral lung structure. Pulmonary volume is approximately twice than in other similar turtles, which can improve its neutral buoyancy ability.Also has been studied the variation in pulmonary gases composition (PLco2, PLo2,) during the periods of apnea through spontaneous ventilation for different ambient temperatures (5 to 40"C). In these species has been found that presents an effective respiratory control of the relative alkalinity into a temperature range between 5 and 35 ºC. This control becomes apparent by a progressive increase in P(Lco2), when ambient temperature rises, at the same time as a decrease of relative ventilation (VE/Vcob VA/Vco), what implies the typical ventilatory pattern of reptiles in order to maintain an efficient control of acid-base balance. This ventilatory pattern changes in response to high ambient temperatures (43ºC). At these levels of hypenhermia has been observed hyperventilation with an increase in VE/Vce, and a decrease in P(Lco2). However, the effect of these ventilatory responses on P(Lco2), is lower than can be expected due to a remarkable increase in death volume. Elevated tidal volume and ventilatory frequency accounts for hyperventilation.This species presents different mechanisms of thermal adjust in order to achieve the control of its body temperature. Has been detected an increase of the difference between body and ambient temperatures during body heating as well as a higher heat exchange rate during the cooling in air, while in water heat exchange rate is higher during heating. This implies the existence of very efficient physiological mechanisms for the control of body temperature.