S'han dissenyat i sintetitzat conjugats acridina-oligonucleòtid que puguin actuar com a inhibidors de la telomerasa a través de l'estabilització d'estructures quàdruplex de guanines (G) formades en els extrems telomèrics de les cèl·lules humanes. Els intermedis clau en la ruta sintètica que ha permès obtenir els conjugats desitjats han estat derivats acridínics assimètricament disubstituïts que contenen un grup carboxílic en un dels extrems, els quals s'han fet reaccionar amb 5'-amino-oligonucleòtids. El mètode sintètic desenvolupat ha permès l'obtenció d'una petita biblioteca de conjugats acridina-oligonucleòtid amb introducció de diversitat a diferents nivells (derivat acridínic, seqüència oligonucleotídica i espaiador d'unió entre ambdós components).Els conjugats obtinguts s'han avaluat, en primer lloc, com a estabilitzadors d'estructures quàdruplex de G formades per la seqüència telomèrica humana, mitjançant la tècnica FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Posteriorment, s'ha avaluat també la seva capacitat d'inhibició de la telomerasa mitjançant assaigs TRAP (Telomeric Repat Amplification Protocol). Així, s'ha posat de manifest que els conjugats obtinguts estabilitzen els quàdruplex de G formats per la seqüència telomèrica humana i que inhibeixen la telomerasa, encara que en ambdós casos, en menor intensitat que les acridines que contenen. Finalment, s'ha observat una correlació força acceptable entre els resultats obtinguts en ambdós experiments (d'estabilització i d'inhibició).Per altra banda, s'han sintetitzat diversos oligonucleòtids cíclics rics en guanines potencialment formadors de quàdruplex de G, i s'ha dut a terme un estudi estructural d'aquests utilitzant les tècniques d'espectroscopia ultravioleta (UV), Dicroïsmse Circular (DC) i Ressonància Magnètica Nuclear (RMN). En particular, s'ha observat que el dodecàmer cíclic d<pTTAGGGTTAGGG> forma una estructura ben definida de quàdruplex bimolecular tipus cistella en presència de sodi. Finalment, s'ha estudiat la interacció d'aquests oligonucleòtids cíclics amb algunes de les acridines obtingudes anteriorment. En aquest sentit, s'ha observat que aquestes últimes estabilitzen les estructures de quàdruplex de G formades pels oligonucleòtids cíclics, i que, en el cas de l'octàmer d<pTTGGTTGG> fins i tot indueixen la seva estructuració. / Several acridine-oligonucleotide conjugates have been designed as potential telomerase inhibitors via G quadruplex stabilization in the human telomeres. A general synthetic methodology has been set up in order to obtain such conjugates. The key intermediates for the obtaining of the desired molecules appeared to be asymmetrically disubstituted acridine derivatives containing a carboxylic group in one end. Such intermediates were reacted with 5' amino-oligonucleotides to afford the conjugates. A small conjugate library has been synthesized with structural diversity being introduced at different levels (acridine derivative, oligonucleotide sequence and linker).The obtained conjugates have been evaluated in a first step as G quadruplex stabilizers through FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) studies. Also telomerase inhibition has been tested for the compounds. Typical TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) assays have been performed. It has been shown that most of the conjugates not only stabilize G quadruplex formed by the human telomeric sequence but also inhibit telomerase activity, although with less potency than the sole acridines. Furthermore some correlation between both properties (G quadruplex stabilization and telomerase inhibition) can be observed. On the other hand, some G-rich cyclic oligonucleotides, which can be considered as potentially G-quadruplex forming oligonucleotides, have been obtained. A structural study has been carried out using different techniques such as UV spectroscopy, Circular Dicroism (CD) and Nuclear Magnetic Resonance (NMR). It has been observed that the cyclic dodecamer d<pTTAGGGTTAGGG> forms a well defined bimolecular basket-like G-quadruplex structure in the presence of sodium. Finally, some studies directed to study the interaction between such oligonucleotides and some of the acridines previously obtained have shown that the later ones generally stabilize G-quadruplex structures formed by the cyclic oligonucleotides. In particular, most of the acridines tested induce the cyclic octamer d<pTTGGTTGG>, to form a bimolecular G-quadruplex.

L'estructura cristal•logràfica del receptor opioide ha estat una gran incògnita fins al seu recent descobriment. En aquesta tesi s'han realitzat aportacions al disseny racional de fàrmacs opioides, mitjançant la posada a punt de tècniques d'anàlisi proteòmica del receptor opioide i amb estudis de la seva interacció amb lligands peptídics endògens (encefalines i endorfines) i els seus anàlegs, per interpretar millor les conformacions dels lligands i el seu mode d'unió al centre actiu. D'altra banda, s'han realitzat estudis de nous inhibidors dels enzims que degraden les encefalines (Endopeptidasa neutra i Aminopeptidasa-N). L’opiorfina (H-Gln-Arg-Phe-Ser-Arg-OH) mostra una potent activitat analgèsica en models animals de dolor després estimulació química i mecànica equipotent a la morfina per activació dels mecanismes endògens de regulació del sistema opioide. Aquesta se segrega en la saliva humana i actua com a inhibidor dual de NEP i AP-N, prolongant l’efecte de les encefalines. En aquesta part, s'han realitzat estudis de relació estructura-activitat (SAR) i conformacionals per millorar el disseny d'inhibidors d'aquests enzims. / The crystallographic structure of opioid receptors has been a great unknown until its recent discovery. This thesis has made contributions to the rational design of opioid drugs, by tuning proteomic analysis techniques on opioid receptors and studying their interactions with endogenous peptide ligands (enkephalins and endorphins) and its analogues to a better understanding of conformations of the ligands and their binding mode to the active center. Furthermore, studies have been made about new inhibitors of enzymes which degrade enkephalins (NEP and aminopeptidase-N). Opiorphin (H-Gln-Arg-Phe-Ser-Arg-OH) exhibits potent analgesic activity in animal models of pain after chemical and mechanical stimulation equipotent to morphine, by activation of the endogenous opioid system. It is secreted in human saliva and acts as a dual inhibitor of NEP and AP-N. In this part, structure-activity relationship (SAR) and conformational studies have been made to improve the design of inhibitors of these enzymes.

Las pinturas al disolvente están siendo sustituidas por pinturas en base acuosa por razones medioambientales y de seguridad e higiene. Las propiedades de una pintura están influidas por su comportamiento reológico. En concreto, el conocimiento y control de la variación de la viscosidad de equilibrio con el gradiente de velocidad y la cinética de esta variación (tixotropía) de una pintura son relevantes para prevenir la sedimentación dentro del envase, facilitar su aplicación y asegurar una buena calidad del recubrimiento final. Para que una pintura al agua tenga la reología adecuada se necesita, en general, la adición de espesantes. Con este fin se utilizan principalmente dos tipos de polímeros: los hidrofílicos, entre los que destacan los derivados de la celulosa, que espesan por entrecruzamientos de cadenas, y los polímeros asociativos, consistentes en un esqueleto hidrofílico modificado mediante la adición de grupos hidrófobos, cuyo espesamiento es producido principalmente por la asociación de estos grupos en micelas, interconectadas entre sí por la cadena hidrófila. Entre ellos cabe destacar los uretanos etoxilados e hidrofóbicamente modificados (HEURs) y las celulosas asociativas, como la hidroxietil celulosa hidrofóbicamente modificada (HMHEC). El estudio del mecanismo de espesamiento de las soluciones acuosas de estos polímeros es importante para comprender su comportamiento en una pintura totalmente formulada. La viscoelasticidad lineal de estas disoluciones está relacionada con el mecanismo de espesamiento, por lo que resulta interesante su análisis. En este trabajo se ha estudiado y modelizado la viscoelasticidad lineal de soluciones acuosas de una HMHEC, así como la evolución de la viscosidad estacionaria con el gradiente de velocidad y la tixotropía. También se ha analizado cómo se modifican estos resultados al añadir un tercer componente que suele estar presente en las pinturas en base acuosa, como es un tensioactivo, en concreto, el dodecilsulfato de sodio, SDS. Estos resultados se comparan con los obtenidos en este mismo trabajo con polímeros celulósicos no asociativos y con los hallados por otros autores con HEURs. Las diferencias se relacionan con los distintos mecanismos de espesamiento. A diferencia de los HEURs, cuya viscoelasticidad lineal puede ser descrita por un modelo de Maxwell simple, el comportamiento viscoelástico de la HMHEC es más complejo y requiere la introducción de un espectro de tiempos de relajación, que es el resultante de la suma de dos relajaciones claramente diferenciadas: una relajación a tiempos relativamente largos, relacionada con el tiempo de salida de los hidrófobos de las micelas, que en este caso sigue una distribución logarítmica de tiempos de relajación, más una relajación a tiempos muy cortos, relacionada con movimientos de tipo Rouse de las cadenas individuales. De este modo, se necesitan cuatro parámetros para describir la viscoelasticidad lineal de las soluciones acuosas de HMHEC. Tres de ellos corresponden a la relajación más lenta, y son el módulo de Plateau, GN0, el tiempo medio de relajación, &#61548;M, y la desviación estándar de la distribución en torno a ese tiempo, &#61555;. El cuarto parámetro incluye todos los parámetros de Rouse, que no pueden ser conocidos independientemente por limitaciones experimentales, y tiene unidades de viscosidad, por lo que es llamado viscosidad a frecuencia infinita, &#61544;&#61605;. La necesidad de introducir una distribución logarítmica de tiempos de relajación se atribuye a que en la HMHEC los hidrófobos están aleatoriamente distribuidos a lo largo de la cadena de celulosa, que tiene una cierta rigidez, a diferencia de los HEURs telequélicos, cuyo esqueleto es flexible y tiene situados los grupos hidrófobos en posiciones terminales. Las distintas posiciones de los grupos hidrófobos y las tensiones ejercidas sobre ellos afectan a su velocidad de salida de la micela y, por tanto, al tiempo de relajación, que, según la teoría de la red micelar, se corresponde con el inverso de esta velocidad. / Environmental and safety considerations make water-borne coatings interesting substitutes for solvent-borne ones. These paints require the addition of thickeners in order to achieve the characteristic rheological behavior desired in their use. Complete rheological characterization of thickener-water solutions would facilitate formulation of new paints, and must include characterization of viscoelasticity, flow behavior and thixotropy. The traditionally used thickeners are long-chain water-soluble polymers, as hydroxyethyl celluloses (HEC), which thicken the medium because of chain entanglements between the long polymer molecules. In the last few years these thickeners have been substituted in some applications by associative polymers, which consist of a hydrophilic backbone, where hydrophobic groups have been added so that each molecule has two or more hydrophobes. Since those hydrophobic groups have mutual affinity, they form aggregates that are similar to micelles present in surfactant solutions, interconnected by the hydrophilic backbone. A three-dimensional transient network that thickens the medium is therefore formed.The rheological behavior of hydrophobically modified hydroxyethyl cellulose HMHEC, an associative thickener, was studied and compared with that of hydrophobically modified ethoxylated urethanes HEURs and non-associative celluloses. In contrast to HEURs, a simple Maxwell model does not fit the linear viscoelastic behavior of HMHEC. Differences are attributed to the stiffness and comb structure of HMHEC. A generalized Maxwell model with a logarithmic distribution of relaxation times is proposed, and another parameter that includes Rouse-like relaxation is added to fit behavior at high frequencies. Four parameters are needed to describe HMHEC viscoelasticity: a mean relaxation time, &#61548;M; its corresponding standard deviation, &#61555;; a plateau modulus, GN; and a viscosity at infinite frequency, &#61544;&#61605;. Satisfactory fitting is obtained for all concentrations and temperatures in the range of frequencies studied. The sharp increase of GN with concentration indicates loop-to-bridge transitions. Temperature does not influence GN, since the reduction in the number density of elastically effective chains caused by Brownian motion masks the direct effect of temperature. The dependence of &#61548;M on temperature follows the Arrhenius equation, as does the relaxation time of HEURs, but it does not change with concentration, presumably because the comb structure of HMHEC prevents the formation of long superchains.

Cell membranes are 2-D heterogeneous fluid systems that show nanoscale structures of great interest because of its importance in membrane functions. Due to the inherent complexity of natural membranes, the study of model membranes is essential to obtain important information about membranes. The small lateral size and tiny variation of the height of the lipid structures require the use of nanoscale characterization techniques. However, the requirement of liquid environment to preserve the integrity of the membrane limits the number of techniques that can be applied in the study of the physical and chemical properties of biomembranes. The objective of the present thesis was to develop a procedure to prepare model lipid bilayers stable in air environment and showing physicochemical properties as close as possible to their equivalent in liquid media. For the first experiments DOPC was selected as model to adapt the existing protocols for hydrated spin-coated samples to the new protocol for dried samples. In the structural study it was demonstrated that the dewetting pattern described by previous authors not only depends on the proximity of the layer to the substrate because also depends on the lipid concentration on the coating solution. Apart from that the presence of a continuous monolayer in contact with the mica substrate was demonstrated contrary to previous results with other lipids. The force spectroscopy measurements represented the first study on single bilayers in air and surprisingly demonstrated that the lipid layers in air presented similar mechanical properties than hydrated samples. Secondly the preparation protocol was adapted for phospholipids with different characteristics, the saturated phosphocholines. Contrary to unsaturated lipids, which present in general a high fluidity at ambient temperature, this is not always true for saturated lipids. For phosphocholines with short hidrocarbonated chains the melting temperature is low and then they are fluid, but for long hidrocarbonated chains the melting temperature is high and they can present a non-fluid behavior. For this reason different saturated lipids with different chain lengths were studied (DLPC, DMPC, DPPC and DSPC). The results with these lipids demonstrate that the conventional protocol of spin-coating induces the interdigitation of certain areas of the samples for the cases of DPPC and DSPC. The effect of the presence of alcohols and lateral tension were studied, being the rotation speed determined as causative of this phenomenon. Finally, we studied the more important case of multicomponent samples. In this study, ternary samples made of DOPC, Sphingomyelin and Cholesterol, relevant for lipid raft models, were selected. The corresponding binary samples with Cholesterol were also studied to determine separately the effect of Cholesterol in each of the components (DOPC and SM). Results unambiguously showed that air stable multicomponent lipid bilayers can be prepared by the spin coating technique with structural and mechanical properties remarkably resembling those of the equivalent systems in liquid media, specially on what concerns phase segregation phenomena. In particular, and more importantly, we showed that the ternary mixtures of DOPC/Chol/SM under dry conditions showed also the presence of lipid rafts. In summary, the present thesis has showed that it is possible to prepare lipid bilayer model systems morphologically stable in dry air conditions that present similar topography and mechanical properties than hydrated samples. Therefore it opens the possibility to characterize these systems with nanoscale techniques that until now have not been applied to them, thus offering the possibility to clarify physicochemical properties of lipid bilayer model systems that still today remain unexplored in spite of the vast literature of lipid bilayer model systems. / Les membranes cel•lulars són fluids en 2D heterogenis que presenten estructures a la nanoescala (dominis) de gran interès degut a la seva importància en les funcions de membrana. Com a conseqüència de la inherent complexitat de les membranes naturals, els estudis amb membranes naturals són essencials per tal d’obtenir informació sobre les propietats fisicoquímiques de les membranes. No obstant això, el requeriment de medi líquid, per preservar la integritat de la bicapa lipídica, limita el nombre de tècniques que es poden aplicar en l'estudi de les propietats físiques i químiques de les biomembranes. L'objectiu d'aquesta tesi és desenvolupar un procediment per preparar bicapes lipídiques model estables en aire i que mostrin propietats fisicoquímiques similars a la dels seus equivalents en medi líquid. Per aquest fi es va utilitzar la tècnica d’spin-coating per preparar les mostres, tant monocomponent (fosfolípids insaturats i saturats) com multicomponent (barreges binàries i models de lipid raft). Les mostres varen ser caracteritzades amb microscòpia de forces atòmiques (AFM) i es va demostrar la seva similitud amb les mostres hidratades tant mecànicament com estructuralment. En resum, enquesta tesi ha demostra que és possible preparar sistemes l model de bicapa lipídica morfològicament estables en aire sec que presenten topografia similar i les propietats mecàniques que les mostres hidratades. Per tant, s'obre la possibilitat de caracteritzar aquests sistemes a nanoescala amb tècniques que fins ara no s'han aplicat a ells, oferint així la possibilitat d'aclarir les propietats fisicoquímiques de sistemes lipídics model bicapa que encara avui romanen inexplorades tot i la vasta literatura del model de bicapa lipídica sistemes.

Phylum Porifera (Grant, 1836) are sessile metazoans with a differentiated inhalant and exhalant aquiferous system with external pores. Lacking a tissue grade of construction, sponges can reach two well-differentiated regions, the ectosome (external layer free of choanocytes) and the choanosome (internal region with choanocytes). As the most likely primitive metazoans, their challenging structural organization, physiology for biocalcification and trophic requirements allowed sponges to rapidly colonize distinct environments and built important sponge reefs during the Paleozoic and Mesozoic eras, making them an ecologically relevant group principally in marine benthic communities. To date, sponges are still ecologically important among benthic fauna although the role as reef builders in modern coral reefs has changed in favor of scleractinian corals. Nonetheless, sponges have demonstrated a huge capacity to adapt and spread in many habitats contributing to organization and functioning at both community and ecosystem levels. One of the keys of the evolutionary success of this group lies in the close association between sponges and microbes that dates back to the Precambrian era. The need to be defended may have arisen from the lack of motility of sponges and several mechanisms emerged to fulfill their demand including a chemical protection. Many sponges would have taken advantage of associated microbes to use their metabolites as a defense barrier against predators, competitors or foulers. This particular symbiosis has consequently become a key factor in biotic interactions within the sponge research. To date, chemical ecology and microbial ecology are two independent areas of the sponge research with ecological implications that occasionally converge at the same point. We want to analyze the evolution of the sponge chemical and microbial ecology from the very beginning, to quantify their impact on the scientific community, and to compare both research areas. This PhD dissertation has been conceived to study the chemical and microbial ecology of sponges using the demosponge Aplysina aerophoba (Nardo, 1833) as a model species because its secondary chemistry and its associated microbial community are well studied and it is quite abundant in our study area (Northwestern Mediterranean and Canary Islands). Beyond the knowledge achieved about the major chemistry and bacterial assemblages in A. aerophoba, we have been able to explore the variation sources of the natural products and the sponge microbial consortium. Additionally, we have assessed the putative relationships between the host bacterial community and the production of secondary metabolites in this species. We explored changes in the abundance of secondary metabolites and the relative composition of bacterial assemblages in A. aerophoba at multiple spatial (from few centimeters to thousand kilometers) and temporal (months and years) scales. The approach used allowed us to investigate which is the magnitude of the variance attributable to the distinct spatial and temporal scales and the most relevant scale at which the abundance of secondary metabolites and bacterial symbionts varied. We also investigated the relationship between natural products and microbial community structure by assessing whether both parameters covary at multiple scales. Finally, we experimentally addressed whether different light exposures can modify chemical and microbial profiles in the external and internal regions of A. aerophoba. In summary, the production of natural products in sponges and the abundance and phylogenetic composition of the host-associated microbial community mainly depend to a large extent on the sponge-species and the ecological factors with spatial and temporal variations (e.g., light, predation, competition, fouling). The host state (i.e., stress) is also a key factor that may be the main driver of symbiotic shifts causing a breakdown in the sponge health and making the symbiont communities unstable and likely the sponge chemical defense. The combination between abiotic and biotic factors may finally determine the concentration of bioactive compounds and associated microbial diversity as the abiotic environmental context can control the outcomes of biotic interactions, and biotic interactions often moderate the effect of abiotic factors. For that reason, it is not an easy task to actually figure out the factors that limit or enhance chemical and microbial variability. Further experiments and time-series observations are needed to reveal the underlying processes hidden. / El filo Porifera (Grant, 1836) está compuesto por metazoos sésiles con un sistema acuífero diferenciado del que forman parte los coanocitos que generan un flujo de agua unidireccional. A pesar de no presentar auténticos tejidos, las esponjas pueden llegar a desarrollar dos regiones bien definidas, el ectosoma (capa externa) y el coanosoma (región interna). Estos organismos representan un grupo ecológicamente importante del bentos marino con gran capacidad de adaptación y dispersión en muchos hábitats, contribuyendo así en la organización y funcionamiento a nivel de comunidad y ecosistema. Una de las claves del éxito evolutivo de las esponjas yace en la relación estrecha que presentan desde el Precámbrico con microorganismos a través de la cual desarrollaron una protección química. Muchas esponjas habrían utilizado los metabolitos secundarios de origen microbiano como defensa química. A día de hoy se han desarrollado dos áreas de investigación, la ecología química y la microbiana de esponjas, de las que realmente desconocemos su origen o su impacto. Dado el vacío existente de estudios que evalúen la comunidad bacteriana de esponjas como fuente de compuestos bioactivos, teníamos la oportunidad de integrar estos dos campos de la ecología de esponjas investigando la relación entre productos naturales y microorganismos simbiontes, con el fin de entender la funcionalidad de la comunidad bacteriana en el huésped. Esta tesis fue concebida para estudiar la ecología química y microbiana de la esponja Aplysina aerophoba (Nardo, 1833), cuya química y comunidad bacteriana asociada han sido objeto de muchos estudios previos. El principal objetivo fue explorar las fuentes de variación tanto de los productos naturales adscritos a Aplysina como de su estructura microbiana e inferir una posible relación entre comunidad de microorganismos y la producción de metabolitos secundarios. La aproximación que utilizamos consistía en explorar la variabilidad natural de los compuestos bioactivos y de la estructura microbiana de la esponja Aplysina aerophoba a distintas escalas espaciales (desde pocos centímetros hasta miles de kilómetros) y temporales (meses, años), y evaluar el efecto de factores ambientales, como la luz, en los perfiles químicos y microbianos. Posteriormente, correlacionar ambos patrones de variación e inferir alguna asociación potencial entre productos naturales y simbiontes microbianos. Resumiendo, la producción de metabolitos secundarios en esponjas y la composición filogenética de la microbiota asociada depende esencialmente de la especie de esponja, de los factores ecológicos con variación espacial y temporal, como también del estado del huésped (si presenta o no estrés). La combinación entre factores abióticos y bióticos determinará en última instancia la abundancia de defensas químicas y la diversidad microbiana debido a una autorregulación entre ambos tipos de factores.

En esta tesis se ha estudiado la reproducción y el cultivo larvario de la corvina. En el primer capítulo se abordan los estudios realizados sobre reproducción y optimización de protocolos de inducción a la puesta mediante tratamientos hormonales para que la corvina (tanto de origen salvaje como de cultivo) se reproduzca en cautividad a fin de obtener huevos y larvas de buena calidad estudiándose además los parámetros que determinan la calidad de las puestas obtenidas. Por último se han comparado los resultados en cuanto a inducción y calidad de puesta de los reproductores salvajes y de cultivo. En la segunda parte se abordan aspectos relacionados con el cultivo larvario. Se han determinado diferentes parámetros que influyen en el crecimiento y la supervivencia larvaria, como la intensidad de luz y el fotoperiodo óptimos y la desinfección de las presas vivas y larvas con Ox-Aquaculture® (50% de peróxido de hidrógeno). Por otro lado también se ha estudiado el desarrollo del esqueleto de las larvas de corvina con el fin de determinar posibles deformaciones esqueléticas, la selección de presas por parte de las larvas mediante el marcaje de nauplios de Artemia con microesferas fluorescentes y los requerimientos nutricionales y el nivel adecuado de ácido docosahexanoico (DHA) en las presas vivas para obtener un mayor crecimiento y supervivencia de las larvas de corvina. / In this thesis, a study about several aspects of the reproduction and larval rearing of meagre is presented. In the first chapter about reproduction the adequate hormonal treatments for meagre (wild and cultured fish) to obtain enough quantity and quality of spawnings were optimized, and the quality parameters of the eggs established. A comparison of the results obtained from wild and cultured broodstocks is also presented. In the second chapter on larval rearing different parameters that have a high influence on larval growth and survival, such as light intensity and photoperiod, and disinfection of the live prey and larvae with Ox-Aquaculture® (50% of hydrogen peroxide) were studied. The development of the skeleton of meagre larvae in order to determine possible skeletal deformities prey selection by the larvae using labeled Artemia with fluorescent microspheres and the nutritional requirements and appropriate level of docosahexaenoic acid (DHA) in live prey for a proper growth and survival of meagre larvae are also presented.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques de Barcelona (IIBB)- CSIC / 1) Estudio teórico de nucleobases modificadas. Las modificaciones químicas de ácidos nucleicos tienen una amplia variedad de aplicaciones tanto en clínica, utilizadas como agentes antisentido, así como en el estudio de las estructuras de los propios ácidos nucleicos, las interacciones proteína DNA o en la catálisis de ácidos nucleicos por poner algunos ejemplos. Actualmente se sintetizan cientos de análogos de nucleósidos estándar en laboratorios farmacéuticos, algunos de ellos como, por ejemplo, los análogos de la arabinosa de adenosina y citosina, son útiles como fármacos antivirales o anticancerígenos. La mayoría de los fármacos anticancerígenos actúan inhibiendo la síntesis de DNA de alguna manera si bien es cierto que tienen bastantes efectos secundarios. Sin embargo, la combinación de varios de estos fármacos reduce la resistencia y minimizan la toxicidad. Ejemplos de este tipo de análogos son los antimetabolitos que al ser estructuralmente muy similares a los nucleósidos estándar son capaces de interferir en la producción de los ácidos nucleicos inhibiendo las rutas de síntesis de ácidos nucleicos o incorporándose dentro de la estructura del DNA y el RNA. Una vez que se incorporan al DNA, estos compuestos provocan la terminación de la cadena durante la replicación del DNA y en consecuencia la muerte celular. Existen modificaciones del esqueleto azúcar-fosfato de los oligonucleótidos que mejoran la eficacia en la síntesis de siRNAs controlando la expresión génica en unos casos al bloquear estéricamente la actividad enzimática de las nucleasas, en otros inhibiendo la hibridación del mRNA con la hebra antisentido o incluso favoreciendo la formación de triplexes con secuencias específicas de DNA. Un ejemplo de ello son los fosforotioatos que poseen un átomo de oxígeno no enlazante sustituido por azufre en el enlace fosfodiéster. Éste tipo de modificaciones han demostrado ser resistentes tanto para exo- como endonucleasas aumentando la resistencia en cultivos celulares y en suero. Estudio de las propiedades tautoméricas y reconocimiento de las tiocetotiminas. Las bases sintéticas, una vez introducidas en el DNA, son capaces de inducir cambios conformaciones y alterar la estabilidad induciendo incluso mutaciones o modificando los patrones de reconocimiento. La forma tautomérica que suele suponerse para an álogos de nucleobases estándar es la forma ceto/amino. Sin embargo, la influencia del entorno puede en algunos casos favorecer la existencia de formas teóricamente minoritarias. En este estudio se describen las propiedades tautoméricas de la timina, y la 2- y 4-tiocetotiminas mediante métodos ab initio y la combinación de simulaciones de dinámica molecular y cálculos de energía libre. Los patrones de reconocimiento así como las estabilidades relativas de los tautómeros mayoritarios en diversos entornos fueron identificados. Los resultados teóricos fueron apoyados por los resultados experimentales aportados por el laboratorio del Prof. Dr. Ramón Eritja, y permiten describir las características tautoméricas y de reconocimiento de las tiocetotiminas. 2) Estudio de la influencia de la 6-selenoguanina en diferentes estructuras de DNA. Los análogos de purinas 6-mercaptopurina y 6-tioguanina se utilizan como agentes inhibidores del metabolismo de los ácidos nucleicos en diversos tipos de leucemias. En este trabajo presentamos una caracterización exhaustiva de la estructura y propiedades de interacción de la 6-selenoguanina, un isóstero de la guanina que introducido en el DNA puede afectar diferencialmente en estructuras de mayor orden del DNA. Mediante cálculos exactos de mecánica cuántica y la combinación de simulaciones de dinámica molecular con métodos de energía libre, hemos evaluado la influencia de la sustitución de la guanina estándar por la 6-selenoguanina en sistemas de doble, triple hebra de DNA así como en la estabilidad de estructuras G-cuádruplex. Finalmente, se aborda el estudio de las propiedades electrónicas de la 6-selenoguanina ya que se ha observado que ciertas modificaciones introducidas en el DNA podrían aumentar la capacidad conductimétrica de estos sistemas. 3) Funcionalización de los extremos 3' de oligos de DNA y RNA con derivados modificados con puentes N-etil-N y uso como inhibidor de 3'-exonucleasas. Existen ciertas limitaciones en el desarrollo de ácidos nucleicos modificados con aplicaciones clínicas y es que, la vulnerabilidad a la acción de nucleasas, tanto exo- como endonucleasas, limita la vida media de estos oligos en suero. En la actualidad, los fosforotioatos son las modificaciones que generan mayor resistencia aunque presentan la limitación de que un elevado número de los fosfatos del oligo han de ser modificados. En este trabajo presentamos una nueva modificación en el extremo 3’ de los oligos, en la que dos nucleósidos se unen por el lado de la base en lugar de por enlace fosfodiéster que es eliminado en el diseño. Simulaciones de dinámica molecular del complejo molecular con el fragmento Klenow de la polimerasa I de DNA de E. coli y el oligo modificado permiten demostrar la base del diseño racional del dímero modificado. Los estudios estructurales se complementaron con los experimentos realizados por la Dr. Montserrat Terrazas y Adele Alagia del grupo del Prof. Dr. Ramón Eritja. Éstos incluían estudios de digestión por 3’-exonucleasas (fragmento Klenow de la polimerasa I de DNA de E. coli y la fosfodiesterasa de veneno de serpiente) así como experimentos celulares de RNA de interferencia. 4) Estudio de la flexibilidad de ácidos nucleicos de doble cadena. El estudio de la flexibilidad de los ácidos nucleicos ha sido y sigue siendo un campo actual en efervescencia gracias a la desarrollo de las técnicas de moléculas individuales y a los métodos computacionales como la dinámica molecular. En este estudio se aborda la influencia de la secuencia en la estructura, estabilidad y flexibilidad de moléculas de RNA de doble cadena mediante simulaciones de dinámica molecular. Otro de los objetivos del estudio era comparar los dos campos de fuerza que son mayoritariamente utilizados en el campo de los ácidos nucleicos, AMBER (parm99bsc0) y CHARMM (CHARMM27). Los resultados obtenidos demuestran que la flexibilidad es dependiente de la secuencia pudiendo agrupar los diferentes dinucleótidos en su mayor o menor capacidad para ser deformados. Medidas experimentales como la longitud de la persistencia o la torsión de las dobles hélices de RNA son parámetros moleculares globales que definen la flexibilidad en una escala mayor. Mediante métodos de dinámica esencial, se calcularon los promedios de las entropías intramoleculares de las cuatro secuencias consideradas así como las estimaciones teóricas de la longitud de la persistencia, de la torsión helicoidal y del estiramiento molecular. Además, los resultados del estudio aportan más datos acerca de la diferente flexibilidad que existe entre el DNA y el RNA de doble cadena. / In this thesis quantum mechanics and classical mechanics techniques have been used to study the tautomeric properties of modified nucleobases with potential application to antisense and biotechnology fields. On the other hand, the study of the mechanical properties of double stranded DNA and RNA (dsDNA versus dsRNA) and their sequence dependency have been addressed. In practice, the work has been divided into the following sections: 1.- Theoretical study of sulfur modified thymines. The tautomeric properties of thymine and two thioketoderivatives, 2- and 4-thioketothymines, have been studied by means of accurate ab initio calculations and molecular dynamics simulations coupled with free energy calculations. Previous results suggested that these modifications could stabilize DNA structure at least as good as the natural thymine leading to the fidelity consequences during the replication. Indeed, those results suggested that some minor tautomeric forms could be present in the DNA double stranded environment which would explain the higher stability of certain mismatches. In the light of these results, we explored the impact of thioketothymines by means of both theoretical and experimental studies. 2.- Theoretical study of seleno modified guanine. We explore the chemical properties of 6-selenoguanine (6SeG) and the influence in duplex, triplex and G-quadruplex structures by means of high-level quantum mechanics calculations and free energy calculations combined with molecular dynamics simulations. 6-Selenoguanine, like other related antimetabolites like thiopurines, has been longtime used against several cancers like lymphomas or hepatomas. Moreover, their applications have been extended to solving X-ray nucleic acids structures (6SeG can be incorporated to these molecules and display anomalous dispersion) and, from the present work we suggest that 6SeG can also exhibit remarkable conductor properties in DNA structures. 3.- Inhibition of 3’-exonucleases with dimeric N-ethyl-N modified nucleosides. Development of synthetic oligonucleotides (ONs) has received much attention in the past years due to their ability to silence the expression of undesired overexpressed genes. Among established therapies, siRNAs have been widely studied due to their high potency and sequence-specificity. However, the application of oligonucleotides in vivo faces important limitations. For example, their high vulnerability to degradation by serum nucleases. Much effort has been made to overcome these limitations but, in many cases, modifications that increase nuclease stability, cause negative effects on RNAi activity. We are interested in creating chemical modifications able to increase nuclease stability without disrupting RNAi activity. In particular, in this work, we explored 3’-terminal modifications by replacing standard nucleobases by N-ethyl-N-coupled nucleosides. We focused special attention on 3’-exonucleases because they are the predominant nuclease activity present in serum. By means of molecular dynamics simulations and in vitro experiments, modified siRNAs resistant to nuclease digestion were evaluated against Bcl-2 in vitro, an antiapoptotic gene which is overexpressed in several cancer processes. 4.- Flexibility study of dsRNA molecules. Despite their chemical similarity, DNA and RNA duplex structures play very different biological roles. While double stranded DNA can display a large variety of structures close to the B-form with very dynamic sugar-phosphate conformations, RNA double stranded has been traditionally considered rigid. However, presented results from CHARMM27 MD simulations that pointed in the opposing direction, stating that RNA2 is more flexible than DNA2. To shed some light on this topic, we study the flexibility of double stranded RNA molecules by means of molecular dynamics simulations on four different 18-mer sequences. AMBER and CHARMM nucleic acid force fields were used to analyze the sequence dependent elastic properties and the results were ultimately compared with the obtained for DNA duplex, were both force fields produced comparable results.

La contaminación del medio ambiente, principalmente de ríos, lagos, playas y agua subterránea, que habitualmente se utilizan para actividades recreacionales, cultivos de moluscos, sistemas riego en la agricultura o como fuentes de agua para el consumo humano, es un tema de gran preocupación en términos de salud pública y de gran importancia económica y de legislación. Si se considera la distribución de la población humana, especialmente en zonas cercanas a estos tipos de agua, es indiscutible que estos ecosistemas tienen un considerable riesgo de contaminación que proviene de agua residual de origen humano e incluso de mataderos de animales y de fertilizantes de origen animal empleados en la agricultura. La mayoría de los estudios y datos disponibles sobre contaminación y calidad microbiológica del agua, hacen especial referencia a la contaminación de origen fecal, es bien conocido que una gran cantidad de microorganismos son excretados en la orina y la heces, entre éstos, los virus. Definitivamente la ruta fecal-oral es la vía responsable de la mayoría de las infecciones víricas asociadas al agua. Existen importantes patógenos transmitidos por el agua contaminada, sin embargo, en la actualidad la calidad microbiológica del agua es controlada mediante estándares bacterianos. Actualmente no existe un protocolo estandarizado en las legislaciones para el estudio de virus en muestras ambientales, ni protocolos estándar para el estudio de la infectividad de estos virus. El presente trabajo de Tesis Doctoral describe el desarrollo de nuevas metodologías para la concentración y detección de virus en agua, la utilización de indicadores víricos para evaluar la contaminación fecal, así como también datos sobre la presencia de virus emergentes y virus potencialmente nuevos. El trabajo consta de tres Capítulos que engloban cinco Estudios diferentes. / Fecal contamination in the environment is a public health concern and a serious economical problem. This situation is mainly in rivers, lakes and seawater that frequently are used in recreational activities, shellfish industry, and irrigation in the agriculture and as sources for drinking water. If we consider the high distribution of human population, especially in coastal areas, certainly these ecosystems have a risk of fecal contamination by waste water from humans, agriculture and animals. Most of the studies and available data about contamination and microbiological quality of water have a special interest in the fecal contamination, it is well know that a numerous microorganisms are shed by humans in feaces and urine, among these the viruses. The fecal-oral transmission route is definitely the responsible of most of viral infections related to water. There are important pathogens transmitted by fecal contaminated water, however, currently the microbiological quality of water is monitored using bacterial standards. At the moment there are not standard protocols to study viruses in the legislations for the environment. The present Doctoral Thesis describes the development of new methodologies for the concentration and detection of viruses in water, the use of viral indicators to monitor the fecal contamination of water, as well as data about the emerging viruses and potential new viruses in the environment.

Animals have to eat a certain amount of food every day to survive. Since trophic resources are usually found in exposed locations, animals are in risk of predation while feeding, and face the well known trade-off between predation and starvation risks. Animals may reduce predation risk by scanning for predators. However, an increase in vigilance entails an increase in exposure time to predators. Therefore, animals may increase food intake to reduce foraging bouts at the cost of vigilance or may do the opposite. Animals may also reduce predation risk without increasing vigilance by joining groups. However, when food items are concentrated in some defendable patches, individuals will fight to access them, leading to interference competition. Birds have developed different vigilance and foraging strategies to cope with all these trade-offs. These strategies can be adapted to the environmental conditions and type of predators, and will highly differ according to the genetic, phenotypic and ecological characters of the individuals. In this thesis I investigated how wintering Eurasian siskins (Carduelis spinus) adjusted their vigilance and foraging behaviour to predation risk and competition, and how this adjustment varied according to conspicuousness, residence status and personality of focal birds. I also studied how resident and transient siskins regulated their body mass to predation risk. In order to determine the differential effects of predation risk and competition on the behaviour of siskins, I designed an experiment with three feeders differing in predation risk and interference competition. I captured the siskins every week and marked them with aluminium rings (at first capture) and colour rings (if residents). From each bird, I measured body mass, wing length and plumage coloration cues. I filmed the siskins foraging at feeders from a hide. Then I analyzed the video recordings and selected a sample of birds at each feeder to study the effect of environmental factors, and selected pairs of birds belonging to different cohorts of sex, residence and personality to compare their vigilance and foraging behaviour. I also compared body mass of a large sample of residents and transients in two periods with and without avian predators. I found that siskins adjusted their vigilance behaviour specifically to the environmental conditions. Vigilance to predators, achieved by reducing inter-scan durations, was less costly in terms of food intake rate than vigilance to flockmates, achieved by increasing scan durations. Siskin males were more brightly coloured and detectable than females, and showed a vigilance system more oriented to predator detection, supporting (together with the correlation between coloration and vigilance in males) the view of a predation cost to conspicuousness. Resident and transient siskins showed a different vigilance and foraging strategy. Residents were more confident in vigilance to reduce predation risk while transients preferred to reduce foraging bout lengths. Transient siskins were in higher predation risk because of their vigilance and foraging behaviour, and this was related both to their unfamiliarity with the area and their subordination to residents. Proactive male siskins showed a vigilance system that improved their ability to detect predators as compared with reactive males, supporting the view of a behavioural compensation for their personality trait (and not the existence of behavioural carryovers). Resident siskin males adjusted their body mass to the presence of predators at the foraging area, something that transients could not do because of their site unfamiliarity. In general, dominant individuals (whether males, residents or proactive birds) showed a foraging behaviour that prioritized the reduction in predation risk and not the increase in food intake rate, as compared to subordinates. Dominance alone cannot account for our results, although it probably had some effect in all the comparisons. / En aquesta tesi vaig estudiar el comportament de vigilància i d'alimentació de lluers hivernants a tres menjadores que diferien en risc de depredació i competència. Vaig determinar com els ocells ajustaven la vigilància a aquestes variables, i vaig comparar el comportament dels ocells pertanyents a diferents classes de sexe, estatus de residència i personalitat, per veure si adoptaven diferents estratègies. Els lluers van ajustar de manera diferent el seu comportament al risc de depredació i la competència. La vigilància dirigida als depredadors, assolida tot reduint la durada dels intervals entre vigilàncies, va resultar ser menys costosa en termes d'ingesta d'aliment que la vigilància a companys d'estol, assolida mitjançant l'increment de la durada de les vigilàncies. Els mascles de lluer van ser més brillants i fàcils de detectar que les femelles, i van mostrar un comportament més orientat a la detecció de depredadors, cosa que dóna suport (junt amb la correlació entre coloració i vigilància en mascles) a l'existència d'un cost de depredació associat a la conspicuïtat del plomatge. Els lluers residents van adoptar un sistema de vigilància que els exposava a menor risc de depredació que els transeünts. A més, a diferència d'aquests, van confiar sobretot en la vigilància a l'hora de reduir el risc de depredació. Aquestes diferències estarien relacionades tant amb el grau de coneixement de la zona com amb la dominància. Els mascles proactius van mostrar un sistema de vigilància que millorava la seva capacitat per detectar aviat els depredadors en comparació amb els mascles reactius, cosa que dóna suport a la idea d'una compensació comportamental del tret de personalitat. Els mascles residents van ajustar la seva massa corporal a la presència d'un depredador aeri a la zona, cosa que no van fer els transeünts segurament pel seu desconeixement del risc de depredació. En general, els individus dominants (mascles, residents o individus proactius) van mostrar un comportament d'alimentació que prioritzava la reducció del risc de depredació i no l'increment en la ingesta d'aliment. La dominància per sí sola no pot explicar els resultats de les comparacions, malgrat que pot tenir un cert efecte en totes elles.

La Ribonucleotidil Reductasa (RNR) és un enzim essencial encarregat de reduir els ribonucleòtids (NTP) als seus corresponents deoxiribonucleòtids (dNTP) per a la síntesi i reparació de l’ADN, és per això que requereix de ser finament regulat per mantenir els correctes nivells de dNTP cel•lulars. A diferència dels organismes eucariotes, els quals només codifiquen per una classe d’aquest enzim en el seu genoma (la classe Ia), els organismes procariotes poden codificar tres classes diferents de l’enzim (classe I, II i III) i diferents combinacions d’elles en el cromosoma. Les diferents classes de RNR s’expressen a diferents condicions ambientals, incrementant així la seva adaptació ambiental. El microorganisme Escherichia coli codifica en el seu genoma per la RNR de classe I (subdividida en classe Ia i Ib), la qual és activa en condicions aeròbiques, i classe III, només activa en condicions d’anaerobiosi. El principal objectiu d’aquesta tesi titulada “Estudi de l’expressió i funció de les Ribonucleotidil Reductases d’Escherichia coli” ha estat estudiar l’expressió diferencial i la funció de les RNR d’aquest bacteri en diferents condicions ambientals així com, intentar saber més sobre la seva regulació transcripcional. S’ha estudiat l’efecte del regulador global de transcripció gènica H-NS en la transcripció de les tres classes de RNR presents en E. coli i s’ha delimitat la regió d’unió del transcripcional en la regió promotora de la RNR de classe Ia. A més a més, s’ha volgut estudiar diferents efectes ambientals com l’osmolaritat, la temperatura i la disponibilitat d’oxigen en la regulació d’H-NS sobre les diferents classes de RNR. També s’ha pretés analitzar l’expressió diferencial de les diferents classes de RNR durant un procés de formació de biofilm i els mecanismes que fan canviar l’expressió de les RNR durant la maduració d’aquest complex bacterià. L’estudi s’ha dut a terme en una soca no patògena d’E. coli (la soca MG1655) però també en una soca enteropatogènica (la soca E2348/69) per intentar observar diferències o semblances en el patró d’expressió de les diferents classes de RNR durant la formació de biofilm. Seguidament, el fet que els organismes procariòtics expressin més d’una classe de RNR va fer que es volgués investigar una possible funció en la virulència bacteriana d’alguna de les diferents classes de RNR. En aquesta línia d’investigació s’ha estudiat l’expressió diferencial de les RNR durant un procés infectiu utilitzant la soca adhesiva i invasiva d’E. coli (AIEC) LF82, principal soca colonitzadora de malalts de Crohn i que te la capacitat de replicar dins del macròfag. Finalment, en aquesta tesi també s’ha inclós un estudi transcriptòmic global del factor transcripcional NrdR, inicialment descrit com a repressor de les diferents classes de RNR, amb l’objectiu de trobar més gens pertanyents al seu reguló i intentar trobar similituds en el seu mecanisme de regulació transcripcional gènica. / Ribonucleotide Reductase (RNR) is an essential enzyme responsible to provide the required dNTP for the DNA synthesis and repair. Surprisingly, eukaryotic organisms only encode for one class of the enzyme in their genome whereas in the prokaryotic world we can find three different classes of the enzyme (class I, II and III) and also different combinations of them encoded in the genome. The different classes of RNR are expressed in different environmental conditions and require to be tightly regulated to maintain the cellular dNTP pools. Escherichia coli encodes in its genome for the class I (subdivided in class Ia and Ib) and class III RNR. The global aim of this thesis has been to study the transcriptional regulation and the differential expression and function in different environmental conditions of the E. coli RNR classes. It has been provided the effect of the histone-like protein H-NS on the E. coli class Ia and III RNR transcription, the differential expression of the RNR classes during the biofilm formation of a non-pathogenic E. coli (MG1655 strain) and of an enteropathogenic E. coli (E2348/69 strain), the differential expression different RNR classes of the adherent and invasive E. coli (AIEC) LF82 during the infection and a global transcriptomic analysis of the NrdR transcriptional factor, only known for its repressive role on the transcription of RNR.