Le travail de cette thèse a permis de comparer les adaptations mises en place par le système nerveux après différentes méthodes d’altération et de récupération. Nos deux premières études portaient sur l’altérations de la réponse des afférences musculaires suite à une injection de toxine botulique. La troisième étude analysait la relation entre le phénotype musculaire et la réponse des afférences métabosensibles. Les deux dernières études analysaient si le vieillissement et l’activité physique altéraient la boucle sensori-motrice et la réponse des afférences métabosensibles. Les résultats de ce travail de thèse indiquent que la réponse des afférences mécano- et métabosensibles ont des profils de récupération qui diffèrent et que la réponse des afférences métabosensibles est dépendante en partie du phénotype musculaire. Enfin, le vieillissement induit une altération la boucle sensori-motrice, et l’entrainement permet de récupérer selon les muscles. L’activité des afférences métabosensibles est aussi altéré par les vieillissement mais l’entrainement ne permet pas de récupération. / This thesis work compared nervous system adaptations after different methods of alteration and recovery. The two first studies were about muscle afferents response alterations following botulinum toxin injections. The third study analyzed the relation between muscle phenotype and metabosensitive response. The two last studies analyzed whether aging and physical activity could alter the metabosensitive response and the sensory-motor loop. Results indicate that mechano- and metabosensitive afferents response have different recovery pattern and that metabosensitive afferents response is in part dependent on the muscle phenotype. Aging results indicate an alteration of the sensory-motor loop and depending on the muscle, training allows a recovery. Metabosensitive afferents response is also altered but training does not induce a recovery.

No description available.

La production hétérologue des protéines membranaires reste difficile, peut-être parce que l’insertion dans la membrane de la cellule hôte constitue une étape limitante de la production. Afin de tourner cette difficulté, deux modes de synthèse ont été envisagés: la synthèse de protéines dans un système a-cellulaire, en l’absence de membrane mais en présence de détergent, ou l’adressage forcé de la protéine vers les corps d’inclusion dans le cas d’une expression plus classique en bactérie entière. La réalisation des deux stratégies repose sur l’utilisation de protéines de fusion possédant une séquence d’entraînement en amont du gène d’intérêt, soit qu’elles améliorent la traduction du transcrit en limitant le repliement spatial de ce dernier, soit qu’elles favorisent la production de la protéine d’intérêt en corps d’inclusion. La porine OmpX et le peptide T7 ont été choisis en cas d’expression dans les systèmes bactériens. La protéine SUMO est utilisée pour la production dans un lysat eucaryote. Les différentes approches ont été testées sur la production de la pannexine1 humaine (Px1).Si les séquences d’entraînement OmpX et le peptide T7 sont correctement produites in vitro, aucune des deux, en revanche, ne favorise la production de la Px1. Seul l’entraîneur SUMO est efficace. En effet, nous avons observé que cette protéine augmente la production de la Px1 dans un lysat eucaryote de germe de blé. Par ailleurs OmpX, connue pour être largement produite in vivo dans les corps d’inclusion, n’entraîne pas la localisation de la Px1 dans ces structures. Contre toute attente, l’étiquette T7 dirige la Px1 dans les corps d’inclusion. L’étude électrophysiologique de la Px1 a donc été effectuée à partir de la protéine produite in vivo (T7his-Px1) après renaturation, ou produite sous forme soluble in vitro (his6-Px1) dans le lysat eucaryote. Dans le cas de la protéine T7his-Px1 renaturée, une activité canal qui rappelle celle qui est observée après expression dans l’ovocyte de Xénope, a été détectée en patch-clamp, mais dans trois cas seulement. Dans le cas de la protéine his6-Px1, aucune activité canal n’est clairement détectée. Dans une deuxième partie de ce travail on examine le rôle de la boucle périplasmique dans la sensibilité à la pression du MscL, un canal mécanosensible bactérien devenu un système modèle dans l’étude de la mécanosensibilité. Presque toutes les études fonctionnelles sur ce canal ont été réalisées sur le canal de E.coli, alors que la structure a été obtenue à partir de l’homologue de M. tuberculosis. Une étude fonctionnelle a montré que le MscL de M. tuberculosis est difficile à ouvrir : son ouverture requiert l’application d’une pression double de celle qui est nécessaire chez E.coli. Les deux homologues diffèrent principalement par la longueur de leur unique boucle périplasmique. De manière à examiner le rôle de la boucle, on a comparé l’activité du canal MscL de E.coli, celle du canal de M. tuberculosis et celle d’une protéine chimère constituée de la protéine de M. tuberculosis dans laquelle la boucle a été changée pour celle de la protéine de E.coli. De manière inattendue, nous avons constaté que les canaux de E.coli et de M. tuberculosis ont la même sensibilité à la pression. La protéine chimère n’avait pas d’activité canal. Si ce travail ne permet pas de conclure quant au rôle de la boucle, il montre sans ambigüité que contrairement à ce qui a été rapporté les canaux MscL de E.coli et de M. tuberculosis ne diffèrent pas sensiblement sur le plan fonctionnel / The production of heterologous membrane protein is notoriously difficult; this might be due to the fact that insertion of the protein in the membrane host is a limiting step. To by-pass this difficulty, two modes of synthesis were tested: 1) production in a cell-free system devoid of biological membrane but supplemented with detergent or liposomes, 2) production in bacteria, with targeting of the membrane protein to inclusion bodies. Both strategies were tested for the production of the human pannexin 1 channel (Px1). The gene coding the protein was fused with an “enhancer” sequence resulting in the addition of a peptide or short protein at the N terminus of the protein of interest. This enhancer sequence which is well produced in vitro or in vivo is supposed to facilitate the translation of the protein of interest. Three enhancer sequences were chosen: 1) the small porin OmpX of E. coli, which, in addition, should target the protein to inclusion bodies when the protein is expressed in bacteria 2) a peptide of phage T7 for expression in E.coli lysate or E.coli cells 3) the small protein SUMO for production in a wheat germ cell-free system. In a bacterial cell-free system, neither OmpX nor T7 promoted Px1 production. Px1 is only produced when the SUMO enhancer sequence is used in the wheat germ system. In bacteria, OmpX, known to form inclusions bodies did not promote the targeting of the fusion protein to inclusion bodies. Unexpectedly, the peptide T7 was able to do it.Px1 obtained from inclusion bodies (T7his-Px1) was renatured and reconstituted in liposomes. Similarly his6-Px1 produced in wheat germ system was reconstituted in liposomes. Both preparations were used for electrophysiological studies (patch-clamp and planar bilayers). With the refolded T7his-Px1, channel activity reminiscent of that observed with Px1 expressed in Xenope oocyte (Bao et al., 2004) could be detected, but only in three cases. In the case of his6-Px1, no clear channel activity could be observed. The second part of this work deals with the involvement of the periplasmic loop of the bacterial mechanosensitive channel MscL in its sensitivity to pressure. Mscl has become a model system for the investigation of mechanosensisity. Nearly all functional studies have been performed on MscL from E.coli while the structure of the protein has been obtained from the Mycobacterium tuberculosis homologue. In one functional study it was shown that MscL from M. tuberculosis is extremely difficult to open, gating at twice the pressure needed for E.coli MscL The periplasmic loop is the most variable sequence between the two homologues, being longer in E.coli than in M. tuberculosis. In order to assess the role of the periplamic loop in the sensitivity to pressure, we compared the activity of the E.coli and M. tuberculosis MscL and of a chimeric protein made of the M. tuberculosis protein in which the periplasmic loop has been exchanged for that of the E. coli channel. Unexpectedly, M. tuberculosis and E .coli MscL were observed to gate at a similar applied pressure. The chimeric protein had no functional activity. In conclusion, this study does not allow any conclusion as to the role of the loop in the sensitivity to pressure, but it shows clearly that, in contrast to the results of a previous study, there is no functional difference between E. coli and M. tuberculosis MscL.

Cette thèse s’est articulée autour de l’élaboration de revêtements surfaciques à base de polymères et de composants naturels. Dans un premier projet, des surfaces mécano-sensibles pour des applications de libération de molécules bioactives ont été élaborées. Des films de multicouches polyélectrolytes constitués d'une strate « réservoir » permettant le chargement d’une molécule bioactive, le paclitaxel, et d'une strate « barrière » mécano-sensible recouvrant ce réservoir et confinant le paclitaxel ont été élaborés. Lors de la mise sous étirement du film, la barrière est rendue perméable vis-à-vis d'une enzyme présente dans le surnageant. Cette enzyme induit ensuite la dégradation enzymatique du « réservoir » et la libération du paclitaxel. Dans un second projet, des substrats cellulaires nourriciers ont été réalisés à partir de films minces de gélatine réticulés mimant la matrice extracellulaire. Ces films peuvent être chargés: 1) en facteurs de croissance, ce qui permet de s'affranchir ensuite de l'ajout de ces molécules dans le milieu de culture; 2) en nanoparticules afin de moduler les propriétés mécaniques des films; 3) en agents antimicrobiens pour assurer une stérilité de la culture cellulaire. Ainsi, ces substrats aux propriétés biochimiques et biophysiques modulables permettent un contrôle précis du microenvironnement cellulaire. / This PhD work is about designing surface coatings with polymers and natural compounds. In the first project, mechanosensitive surfaces have been developed for drug release applications. Polyelectrolyte multilayer films have been designed with i) one reservoir strata for the loading of a bioactive molecule, paclitaxel, and ii) one mechanosensitive barrier strata on top of the reservoir to confine the molecule. When a mechanical stretch is applied on the structure, the barrier becomes permeable and enables the diffusion of an enzyme within the film.This enzyme degrades the reservoir strata and triggers the release of paclitaxel. In a second project, ECM-mimicking feeder substrate has been developed with crosslinked gelatin thin films. These films can be loaded with: i) growth factors to prevent any further addition of these compounds in the culture medium; ii) nanoparticles to modulate mechanical properties of the substrate; iii) antimicrobial agents to ensure sterility during cell culture experiments. Finally, these substrates have some biochemical and biophysical tunable properties that enable the precise control of cell microenvironment.

Membrane protein mechanotransduction is the altered function of an integral membrane protein in response to mechanical force. Such mechanosensors are found in all kingdoms of life, and increasing numbers of membrane proteins have been found to exhibit mechanosensitivity. How they mechanotransduce is an active research area and the topic of this thesis. The methodology employed is classical molecular dynamics (MD) simulations. MD systems are complex, and two programs were developed to reduce this apparent complexity in terms of both visual abstraction and statistical analysis. Bendix detects and visualises helices as cylinders that follow the helix axis, and quantifies helix distortion. The functionality of Bendix is demonstrated on the symporter Mhp1, where a state is identified that had hitherto only been proposed. InterQuant tracks, categorises and orders proximity between parts of an MD system. Results from multiple systems are statistically interrogated for reproducibility and significant differences at the resolution of protein chains, residues or atoms. Using these tools, the interaction between membrane and the Escherichia coli mechanosensitive channel of small conductance, MscS, is investigated. Results are presented for crystal structures captured in different states, one of which features electron density proposed to be lipid. MD results supports this hypothesis, and identify differential lipid interaction between closed and open states. It is concluded that propensity for lipid to leave for membrane bulk drives MscS state stability. In a subsequent study, MscS is opened by membrane surface tension for the first time in an MD setup. The gating mechanism of MscS is explored in terms of both membrane and protein deformation in response to membrane stretch. Using novel tension methodology and the longest MD simulations of MscS performed to date, a molecular basis for the Dashpot gating mechanism is proposed. Lipid emerges as an active structural element with the capacity to augment protein structure in the protein structure-function paradigm.