Made available in DSpace on 2014-06-12T23:16:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8657_1.pdf: 1359998 bytes, checksum: 4930af050e72970d101a75c5ac9f55b2 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O Meduloblastoma é um Tumor Neuroectodermal Primitivo da Fossa Posterior (PNET-FP), sendo biologicamente agressivo com predominância entre as faixas etárias de 5 a 10 anos e de 24 a 34 anos. O tratamento é realizado de maneira conjunta pelo cirurgião, neurologista e o radioterapeuta. Quando possível, é iniciado com cirurgia para máxima remoção do tumor, seguido da quimioterapia e da radioterapia. A radioterapia é realizada através da irradiação crânio-espinhal, com doses que variam de 30 a 35 Gy, seguido de um reforço na fossa posterior. Para esta prática, diversas técnicas têm sido propostas com a combinação dos campos e distribuição das doses, mas problemas com a distribuição da dose podem ocorrer durante a irradiação, devido à aplicação não coplanar dos campos. Isso pode resultar em sub ou superdosagem na junção dos campos, acarretando recidivas da doença, reduzindo a sobrevida do paciente ou gerando complicações tardias nos órgãos que estão no campo de irradiação ou nas regiões de contorno. Estas complicações, cujos fatores principais são as doses e a área irradiada, podem ser minimizadas através de aplicação de técnicas mais otimizadas. Neste trabalho foram avaliadas as doses devido à irradiação crânio-espinhal em pacientes com meduloblastoma através de duas técnicas: Técnica de meio-feixe e Campo angulado, com quatro planejamentos diferentes. Tais planejamentos foram realizados aplicando a Técnica de meio-feixe, Campo angulado, Campo angulado com gap móvel e Campo angulado sem gap móvel, isto viabiliza uma Intercomparação Dosimétrica do nível III, o que torna possível verificar as diferenças entre técnicas e equipamentos, conforme recomendação da Agência Internacional de Energia Atômica (AIEA) no Safety Report Nº 17. Para este fim, foram utilizados um simulador antropomórfico, ALDERSONRANDON, e dosímetros termoluminescentes. Os resultados obtidos foram comparados entre si e observou-se que os valores das doses avaliadas variaram de 17 a 23% nos campos craniais e de 10 a 36% nos campos espinhais. Estes resultados sugerem a necessidade de realização de uma intercomparação dosimétrica do nível II para rastrear possíveis causas de tais diferenças entre dose planejada e dose medida para cada planejamento, visando à melhoria da qualidade da radioterapia

Meduloblastoma é o tumor maligno intracranial mais comum em crianças. Receptores de peptídeos similares à bombesina, como o receptor de neuromedina B (NMBR), podem possuir um papel no crescimento de tumores. Neste estudo, examinamos a expressão de neuromedina B (NMB) e de NMBR em linhagens de meduloblastoma humano Daoy e D283 e a influência desse receptor na viabilidade celular. Além disso, NMBR e GRPR compartilham vias de sinalização, então a influência dessa comunicação na viabilidade celular também foi investigada. Mostramos que, apesar de expressarem NMBR e NMB, a viabilidade de meduloblastoma não é afetada pelo tratamento por 48 h com NMB ou com antagonista de NMBR ou com a combinação de antagonistas de NMBR e de GRPR. Uma vez que há evidências de que a superexpressão de receptores da família ErbB esteja relacionada ao pior prognóstico em meduloblastoma, avaliamos a expressão e o efeito do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR/ErbB1) sobre a viabilidade celular desse tumor. As duas linhagens estudadas expressam mRNA de EGFR, mas apenas a viabilidade de Daoy foi afetada pela inibição desse receptor. Avaliamos o efeito da inibição combinada de NMBR e EGFR sobre a viabilidade celular, uma vez que a ativação de receptores da família da bombesina é capaz de transativar EGFR em tumores. A inibição de NMBR parece facilitar a diminuição da viabilidade celular causada pela inibição de EGFR, indicando uma possível comunicação entre esses receptores. Assim, os resultados desse estudo demonstram a coexpressão de NMB e de NMBR e indicam uma possível relação desse receptor com EGFR. / Medulloblastoma is the most common brain tumor of childhood. The mammalian bombesin receptors, as neuromedin B receptor (NMBR), can play a important role in the growth of tumors. In this study, we evaluated the expression of neuromedin B (NMB) and NMBR in human medulloblastoma cell lines Daoy and D283 and the influence of this peptide in cellular proliferation. Besides that, NMBR and GRPR share common signaling pathways, so the influence of this possible crosstalking in medulloblastoma cells proliferation was investigated. We show that, despite expressing NMBR and NMB, the viability of medulloblastoma is not affected by the treatment for 48 h with NMB or antagonist of NMBR or the combination of NMBR and GRPR antagonists. Since there is evidence that the overexpression of ErbB receptors family is linked to worse prognosis in medulloblastoma, we evaluate the expression and effect of epidermal growth factor receptor (EGFR/ErbB1) on cell viability of this tumor. The two cell lines studied expressed mRNA of EGFR, but only the viability of Daoy was affected by the inhibition of this receptor. We evaluated the combined effect of inhibition of EGFR and NMBR on cell viability, since the activation of the bombesin receptor family is able to transactivate EGFR in tumors. The inhibition of NMBR may facilitate the reduction of cell viability caused by inhibition of EGFR, indicating a possible communication between these receptors. Thus, the results of this study demonstrate the coexpression of NMB and NMBR and indicate a possible relationship of this receptor with EGFR.

Meduloblastoma é o tumor maligno intracranial mais comum em crianças. Receptores de peptídeos similares à bombesina, como o receptor de neuromedina B (NMBR), podem possuir um papel no crescimento de tumores. Neste estudo, examinamos a expressão de neuromedina B (NMB) e de NMBR em linhagens de meduloblastoma humano Daoy e D283 e a influência desse receptor na viabilidade celular. Além disso, NMBR e GRPR compartilham vias de sinalização, então a influência dessa comunicação na viabilidade celular também foi investigada. Mostramos que, apesar de expressarem NMBR e NMB, a viabilidade de meduloblastoma não é afetada pelo tratamento por 48 h com NMB ou com antagonista de NMBR ou com a combinação de antagonistas de NMBR e de GRPR. Uma vez que há evidências de que a superexpressão de receptores da família ErbB esteja relacionada ao pior prognóstico em meduloblastoma, avaliamos a expressão e o efeito do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR/ErbB1) sobre a viabilidade celular desse tumor. As duas linhagens estudadas expressam mRNA de EGFR, mas apenas a viabilidade de Daoy foi afetada pela inibição desse receptor. Avaliamos o efeito da inibição combinada de NMBR e EGFR sobre a viabilidade celular, uma vez que a ativação de receptores da família da bombesina é capaz de transativar EGFR em tumores. A inibição de NMBR parece facilitar a diminuição da viabilidade celular causada pela inibição de EGFR, indicando uma possível comunicação entre esses receptores. Assim, os resultados desse estudo demonstram a coexpressão de NMB e de NMBR e indicam uma possível relação desse receptor com EGFR. / Medulloblastoma is the most common brain tumor of childhood. The mammalian bombesin receptors, as neuromedin B receptor (NMBR), can play a important role in the growth of tumors. In this study, we evaluated the expression of neuromedin B (NMB) and NMBR in human medulloblastoma cell lines Daoy and D283 and the influence of this peptide in cellular proliferation. Besides that, NMBR and GRPR share common signaling pathways, so the influence of this possible crosstalking in medulloblastoma cells proliferation was investigated. We show that, despite expressing NMBR and NMB, the viability of medulloblastoma is not affected by the treatment for 48 h with NMB or antagonist of NMBR or the combination of NMBR and GRPR antagonists. Since there is evidence that the overexpression of ErbB receptors family is linked to worse prognosis in medulloblastoma, we evaluate the expression and effect of epidermal growth factor receptor (EGFR/ErbB1) on cell viability of this tumor. The two cell lines studied expressed mRNA of EGFR, but only the viability of Daoy was affected by the inhibition of this receptor. We evaluated the combined effect of inhibition of EGFR and NMBR on cell viability, since the activation of the bombesin receptor family is able to transactivate EGFR in tumors. The inhibition of NMBR may facilitate the reduction of cell viability caused by inhibition of EGFR, indicating a possible communication between these receptors. Thus, the results of this study demonstrate the coexpression of NMB and NMBR and indicate a possible relationship of this receptor with EGFR.

Meduloblastoma é o tumor maligno intracranial mais comum em crianças. Receptores de peptídeos similares à bombesina, como o receptor de neuromedina B (NMBR), podem possuir um papel no crescimento de tumores. Neste estudo, examinamos a expressão de neuromedina B (NMB) e de NMBR em linhagens de meduloblastoma humano Daoy e D283 e a influência desse receptor na viabilidade celular. Além disso, NMBR e GRPR compartilham vias de sinalização, então a influência dessa comunicação na viabilidade celular também foi investigada. Mostramos que, apesar de expressarem NMBR e NMB, a viabilidade de meduloblastoma não é afetada pelo tratamento por 48 h com NMB ou com antagonista de NMBR ou com a combinação de antagonistas de NMBR e de GRPR. Uma vez que há evidências de que a superexpressão de receptores da família ErbB esteja relacionada ao pior prognóstico em meduloblastoma, avaliamos a expressão e o efeito do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR/ErbB1) sobre a viabilidade celular desse tumor. As duas linhagens estudadas expressam mRNA de EGFR, mas apenas a viabilidade de Daoy foi afetada pela inibição desse receptor. Avaliamos o efeito da inibição combinada de NMBR e EGFR sobre a viabilidade celular, uma vez que a ativação de receptores da família da bombesina é capaz de transativar EGFR em tumores. A inibição de NMBR parece facilitar a diminuição da viabilidade celular causada pela inibição de EGFR, indicando uma possível comunicação entre esses receptores. Assim, os resultados desse estudo demonstram a coexpressão de NMB e de NMBR e indicam uma possível relação desse receptor com EGFR. / Medulloblastoma is the most common brain tumor of childhood. The mammalian bombesin receptors, as neuromedin B receptor (NMBR), can play a important role in the growth of tumors. In this study, we evaluated the expression of neuromedin B (NMB) and NMBR in human medulloblastoma cell lines Daoy and D283 and the influence of this peptide in cellular proliferation. Besides that, NMBR and GRPR share common signaling pathways, so the influence of this possible crosstalking in medulloblastoma cells proliferation was investigated. We show that, despite expressing NMBR and NMB, the viability of medulloblastoma is not affected by the treatment for 48 h with NMB or antagonist of NMBR or the combination of NMBR and GRPR antagonists. Since there is evidence that the overexpression of ErbB receptors family is linked to worse prognosis in medulloblastoma, we evaluate the expression and effect of epidermal growth factor receptor (EGFR/ErbB1) on cell viability of this tumor. The two cell lines studied expressed mRNA of EGFR, but only the viability of Daoy was affected by the inhibition of this receptor. We evaluated the combined effect of inhibition of EGFR and NMBR on cell viability, since the activation of the bombesin receptor family is able to transactivate EGFR in tumors. The inhibition of NMBR may facilitate the reduction of cell viability caused by inhibition of EGFR, indicating a possible communication between these receptors. Thus, the results of this study demonstrate the coexpression of NMB and NMBR and indicate a possible relationship of this receptor with EGFR.

Meduloblastoma é o câncer do Sistema Nervoso Central mais comum em crianças entre 0 e 4 anos. Ele é originado de células precursoras neuronais, que falharam em se diferenciar e continuaram a se proliferar. A proteína SAM68 está desregulada em várias linhagens de células de cânceres humanos e é uma proteína que pode estar envolvida em uma ampla gama de vias de sinalização importantes, incluindo metabolismo de RNA, regulação do ciclo celular, apoptose, regulação de splicing e transdução de sinal. Em células-tronco neurais (NSC), níveis elevados de SAM68 levam a uma redução importante na proliferação celular. Contudo, na maioria dos cânceres estudados até o momento, a SAM68 está envolvida com progressão tumoral. Com este trabalho, buscou-se entender o envolvimento de SAM68 na proliferação e morte de células de meduloblastoma. Por meio da análise de expressão transcricional e proteica, do silenciamento de SAM68, análise de apoptose por citometria de fluxo e análise de proliferação por índice mitótico e incorporação de EdU, observou-se que, em linhagens de meduloblastoma, a SAM68 está envolvida com proliferação, mas não com apoptose. Seu funcionamento em meduloblastoma é similar aos resultados obtidos com NCS do que com outros tipos de câncer, visto que o silenciamento dessa proteína favorece a proliferação das células de meduloblastoma. Em vista dos resultados aparentemente conflitantes, tendo um papel mais semelhante a um supressor tumoral, porém sendo altamente expressa em meduloblasoma, sugeriram-se algumas hipóteses, que foram apenas inicialmente testadas neste trabalho, mas precisam ser aprofundadas em trabalhos futuros / SAM68 is considered a prototype of STAR proteins (Signal Transducers and Activators of RNA protein), that are involved in the signal translation and RNA activation. In cancer, the intracellular levels of Sam68 are crucial to the progression of the disease. Recent observations indicate Sam68 with both pro-oncogenic and tumor suppressor activities, depending on the type of cell. Here, we analyzed SAM68 expression by real time PCR and western blot, proliferation of cell with and without SAM68 by mitotic index and incorporation of EdU and cell death by flux cytometry to define the relevance of the presence of SAM68 to cell proliferation and death. We found that proliferation of medulloblastoma cell lines are affected for absent SAM68, but not apoptosis. Because the contrast of an action similar to a tumor suppressor and a high expression level, we hypothesized that the increase of SAM68 levels is important during the neuronal development, regulating splicing variants. Our results allied to some literature data corroborate this hypothesis

Aim of the study was to evaluate the influence of clinical characteristics to the prognosis of disease and effectiveness of postoperative radiotherapy and adjuvant chemotherapy using lomustine, cisplatinum and vincristin in the treatment of children with medulloblastoma. This study was performed 2000 – 2005 in the Kaunas University of Medicine Hospital, department of children diseases. The data of patients, treated with medulloblastoma in 1994 - 2003, were used in this study. During ten-years period in Lithuania the medulloblastoma was diagnosed for 32 children. Twenty-seven of them were included in this study. The diagnostic tests made for the patients of the study: preoperative computer tomography or/and magnetic resonance imaging of brain; postoperative control computer tomography of brain; magnetic resonance imaging of spinal cord; bone scintigraphy with radioactive technetium; chest X-ray and ultrasound examination of the abdominal organs The spread of the disease and size of the residual postoperative tumor separates patients of this study into two: standard and high risk groups. Patients depending to the standard risk group were treated with radiotherapy alone. Patients included in the high risk group were treated by 2 different treatment methods: patients diagnosed with medulloblastoma between 1994 and 1998 were treated with craniospinal radiotherapy alone, other patients treated between 1999 and 2003 received radiotherapy with adjuvant chemotherapy with lomustine... [to full text]

Meduloblastoma é o câncer do Sistema Nervoso Central mais comum em crianças entre 0 e 4 anos. Ele é originado de células precursoras neuronais, que falharam em se diferenciar e continuaram a se proliferar. A proteína SAM68 está desregulada em várias linhagens de células de cânceres humanos e é uma proteína que pode estar envolvida em uma ampla gama de vias de sinalização importantes, incluindo metabolismo de RNA, regulação do ciclo celular, apoptose, regulação de splicing e transdução de sinal. Em células-tronco neurais (NSC), níveis elevados de SAM68 levam a uma redução importante na proliferação celular. Contudo, na maioria dos cânceres estudados até o momento, a SAM68 está envolvida com progressão tumoral. Com este trabalho, buscou-se entender o envolvimento de SAM68 na proliferação e morte de células de meduloblastoma. Por meio da análise de expressão transcricional e proteica, do silenciamento de SAM68, análise de apoptose por citometria de fluxo e análise de proliferação por índice mitótico e incorporação de EdU, observou-se que, em linhagens de meduloblastoma, a SAM68 está envolvida com proliferação, mas não com apoptose. Seu funcionamento em meduloblastoma é similar aos resultados obtidos com NCS do que com outros tipos de câncer, visto que o silenciamento dessa proteína favorece a proliferação das células de meduloblastoma. Em vista dos resultados aparentemente conflitantes, tendo um papel mais semelhante a um supressor tumoral, porém sendo altamente expressa em meduloblasoma, sugeriram-se algumas hipóteses, que foram apenas inicialmente testadas neste trabalho, mas precisam ser aprofundadas em trabalhos futuros / SAM68 is considered a prototype of STAR proteins (Signal Transducers and Activators of RNA protein), that are involved in the signal translation and RNA activation. In cancer, the intracellular levels of Sam68 are crucial to the progression of the disease. Recent observations indicate Sam68 with both pro-oncogenic and tumor suppressor activities, depending on the type of cell. Here, we analyzed SAM68 expression by real time PCR and western blot, proliferation of cell with and without SAM68 by mitotic index and incorporation of EdU and cell death by flux cytometry to define the relevance of the presence of SAM68 to cell proliferation and death. We found that proliferation of medulloblastoma cell lines are affected for absent SAM68, but not apoptosis. Because the contrast of an action similar to a tumor suppressor and a high expression level, we hypothesized that the increase of SAM68 levels is important during the neuronal development, regulating splicing variants. Our results allied to some literature data corroborate this hypothesis

Orientadores: Jose Andres Yunes, Claudia Vianna Maurer Morell, Denise Pontes Cavalcanti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médica / Made available in DSpace on 2018-08-23T14:33:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lucon_DanielleRibeiro_D.pdf: 6878652 bytes, checksum: 72be4de1339573c4cea11e28716998c7 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Crianças com anomalias congênitas possuem um risco significativamente aumentado para desenvolver algum tipo de câncer. Anomalias do sistema nervoso central (SNC) estão associadas à maior incidência de tumores também do SNC. A comparação entre tecido 'anômalo', tecido tumoral e tecido normal pode ajudar na identificação dos genes mais importantes na carcinogênese. microRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas que atuam negativamente na expressão gênica e têm papel importante no controle do desenvolvimento, diferenciação, apoptose e proliferação celular. Vários miRNAs são expressos no SNC e são conhecidos por serem dinamicamente regulados durante o neurodesenvolvimento. Recentemente, miRNAs foram associados com tumores e malformações do SNC, como o meduloblastoma (MB) e a anencefalia (AN), respectivamente. Ambos tecidos são de origem neuroectodérmica e embrionária. Neste projeto foram estudados os miRNAs diferencialmente expressos no tecido tumoral de MB desmoplástico de pacientes jovens (1-2 anos) versus cerebelo e no tecido cérebro-vascular de fetos com AN versus córtex frontal. Os controles foram obtidos de tecidos normais provenientes de autópsias de fetos e recém-nascidos. As vias gênica-metabólicas importantes na carcinogênese e morfogênese do perfil de miRNAs de MB e AN foram analisados in silico. No primeiro trabalho, apresentado no segundo capítulo, investigamos o perfil de miRNAs de MB que foi predominantemente baixo expresso (64/84 miRNAs) e regulam genes envolvidos com desenvolvimento e/ou câncer. Muitos dos miRNAs baixo expressos (32/64) foram localizados no lócus cromossômico 14q32 (miRNA 14q32). Possíveis mecanismos da baixa expressão de miRNA 14q32 foram investigados por bancos de dados públicos disponíveis. A expressão do gene receptor de estrógeno gama (ESRRG), um regulador transcricional positivo de alguns miRNAs 14q32, foi encontrada baixo expresso em MB desmoplástico. miR-129-5p (11p11.2/7q32.1), miR-206 (6p12.2) e miR-323-3p (14q32.2) foram escolhidos para estudos funcionais em células DAOY. A super expressão do miR-129-5p usando miRNA mimics diminuiu a proliferação das células DAOY. No segundo trabalho, apresentado no terceiro capítulo, analisamos o perfil de expressão de miRNAs em AN que foi predominantemente super expressos (34/52 miRNAs) e regulam genes envolvidos com defeito do tubo neural e/ou câncer. Dentre estes miRNAs estão os miR-21, 34a/c, 182, 500 cluster. miRNAs importantes no desenvolvimento do cérebro (miR-124, 128, 137, 139) foram encontrados baixo expressos nas amostras de AN. A prospecção dos genes alvos destes miRNAs mostrou que eles desempenham um papel importante durante o desenvolvimento e a diferenciação neural. Por fim, nós comparamos os miRNAs diferencialmente expressos entre MB e AN e identificamos 19 miRNAs em comum (baixo expressos: miR-124, 128, 129*, 129-5p, 138, 138-1*, 138-2*, 139-3p, 490-5p, 650, 770-5p; super expressos: miR-199a-3p, 199b-3p, 199a-5p, 21, 214, 214*, 34a, 574-3p). A maioria destes miRNAs em comum encontrados nas duas patologias fazem parte dos miRNAs mais descritos em câncer e/ou são importantes no desenvolvimento do cérebro. O fato destes miRNAs estarem desregulados em duas condições diferentes (MB e AN) faz pensar que sejam funcionalmente relevantes nestas patologias. Nossos resultados indicam a correlação de assinatura de miRNAs com cada amostra destacando a heterogeneidade molecular e complexidade na sinalização celular regulada por miRNAs, e também revela que o câncer foi a via de sinalização predominante em MB e AN / Abstract: Children with birth defects have a significantly increased risk for developing some type of cancer. Anomalies of central nervous system (CNS) are associated with increased incidence of tumours also from CNS. The comparison between tissue 'anomalous', tumor tissue and normal tissue can help identify genes important in carcinogenesis. microRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA molecules that act negatively on gene expression and play an important role in controlling development, differentiation, apoptosis and cell proliferation. Many miRNAs are expressed in CNS and are known to be dynamically regulated in neurodevelopment. Recently, miRNAs have been associated with CNS tumors and malformations, as meduloblastoma (MB) and anencephaly (AN), respectively. Both tissues are from neuroectodermal and embryonic origins. In this project, we studied the miRNAs differential expressed in tumor tissue of desmoplastic MB of young patients (1-2 years) versus cerebellum and cerebrovascular tissue of fetal with AN versus frontal cortex. The normal tissues were obtained from fetal and newborn autopsy. The gene-metabolic pathways important in carcinogenesis and morphogenesis of miRNAs profile of MB and AN were analyzed in silico. In second chapter, we investigated the MB miRNAs profile that were predominantly downregulated (64/84 miRNAs) and regulates genes involved in development and/or cancer. Most downregulated miRNAs (32/64) were found to belong at the 14q32 locus (14q32 miRNA). Possible mechanisms of 14q32 miRNAs downregulation were investigated by the analysis of publicly available gene expression data sets. The expression of estrogen-related receptor-g (ESRRG), a reported positive transcriptional regulator of some 14q32 miRNAs, was found downregulated in desmoplastic MB. miR-129-5p (11p11.2/7q32.1), miR-206 (6p12.2), and miR-323-3p (14q32.2), were chosen for functional studies in DAOY cells. Overexpression of miR-129-5p using mimics decreased DAOY proliferation. In third chapter we investigated the AN miRNAs profile that were predominantly upregulated (34/52 miRNAs) and regulates genes involved with tube neural defects (DTN) and/or cancer. Between these miRNAs are the miR-21, 34a/c, 182, 500 cluster. miRNAs important in brain development (miR-124, 128, 137, 139) were found downregulated in AN samples. Prospecting for target genes of these miRNAs showed that they play an important role during development and neuronal differentiation. Finally, we compare the miRNAs differential expressed between MB and AN and identified 19 miRNAs in common (underexpression: miR-124, 128, 129 *, 129-5p, 138, 138-1 *, 138-2 *, 139 - 3p, 490-5p, 650, 770-5p; overexpression: miR-199a-3p, 3p-199b, 199a-5p, 21, 214, 214 *, 34a, 574-3p). Most common miRNAs found in MB and AN are known to be involved in cancer and/or are important in brain development. The fact that these miRNAs are deregulated in two different conditions (MB and AN) makes one think that they are functionally relevant in these pathologies. Our results indicate the correlation of miRNAs signature with each sample highlighting the molecular heterogeneity and cellular signaling complexity regulated by miRNAs, and also reveals that the cancer was the predominant signaling pathway in MB and AN / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutora em Ciências Médicas

O meduloblastoma (MB) é um tumor embrionário que se origina de alterações genéticas em vias importantes para neurôgenese do cerebelo como Sonic hedgehog (Shh) e Wingless (Wnt). Alterações específicas nessas vias permitem a classificação do MB pelo perfil de expressão e mutacional em quatro subgrupos: SHH, WNT, grupo 3 e grupo 4. A ativação dessas vias pode estar relacionada à hipermetilação de reguladores negativos. A dinâmica da hidroximetilação foi descrita durante o desenvolvimento cerebelar, mas não há relatos na literatura sobre os níveis da hidroximetilação em amostras de MB. Os principais objetivos desse trabalho foram: avaliar os níveis de expressão dos genes TETs e IDHs em MB por qPCR; investigar os níveis de hidroximetilação por meio de imuno-histoquímica e dot-blot; avaliar mutações no éxon 4 de IDH1 e IDH2 por sequenciamento; analisar a metilação e hidroximetilação em genes reguladores negativos das vias SHH, WNT, NOTCH, BMP; modular a atividade dos genes TETs por meio do ácido ascórbico e verificar sua influência funcional e epigenética. Foi observada diminuição na expressão dos genes TETs e IDHs em amostras de MB apenas em comparação com cerebelos fetais, mas não em relação aos cerebelos não-fetais. As linhagens celulares de MB apresentaram expressão diminuída em comparação aos dois grupos controles. A classificação das amostras de MB permitiu verificar uma expressão gênica subgrupo específica. A expressão de TET3 apresentou associação com status da doença; e maiores níveis de IDH2 foram associados à metástase. Não foram encontradas mutações no éxon 4 de IDH1, ou no éxon 4 de IDH2 em MB. Os níveis de hidroximetilação global estão diminuídos em amostras de MB e linhagens celulares em comparação aos cerebelos não-neoplásicos; porém não estão associados com características clínicas dos pacientes. Não foram encontrados níveis detectáveis de hidroximetilação nos genes estudados. Os efeitos do ácido ascórbico foram linhagem-específicos, não ocorreu aumento nos níveis de hidroximetilação, mas alterações na expressão do gene TET3. Em conclusão, níveis de hidroximetilação e expressão dos genes TETs e IDHs são importantes para o MB. No entanto, estudos funcionais direcionados à manipulação desses genes são necessários para elucidar suas funções nesse tumor. / Medulloblastoma (MB) is an embryonic tumor that originates from genetic alterations in pathways that are important to the neurogenesis of cerebellum, such as Sonic hedgehog (Shh) e Wingless (Wnt). These alterations allow us to classify MB based in expression and mutational profile in four subgroups: SHH, WNT, group 3 and group 4. The activation of these pathways could be related to hypermethylation of negative regulators. Hydroxymethylation dynamics was described during cerebellum development, but there are not reports in the literature about hydroxymethylation levels in MB samples. The main aims of this study were: to evaluate TET and IDH genes expression in MB using qPCR; to investigate hydroxymethylation levels using immunohistochemistry and dot-blot; to evaluate mutations in exon 4 of IDH1 and IDH2 genes through sequencing analysis; to analyze methylation and hydroxymethylation levels in genes that regulate SHH, WNT, NOTCH and BMP pathways; to modulate TET genes activity through ascorbic acid and verify its functional and epigenetic influence in MB cell lines. We observed a decrease in TET and IDH genes expression in MB samples compared to fetal cerebellum, but not according to non-fetal cerebellum. MB cell lines presented a decrease when compared to both control groups. The classification of MB samples allowed us to verify a subgroup-specific gene expression. TET3 expression was associated with disease status; and higher levels of IDH2 gene expression were associated with metastasis. We did not find mutations in exon 4 of IDH1 and exon 4 of IDH2 genes in MB samples. Hydroxymethylation levels were decreased in MB samples and cell lines when compared to non-neoplastic cerebellum; however, they were not associated with clinical characteristics of the patients. We did not detect hydroxymethylation levels in the studied genes. Ascorbic acid effects are cell linespecific: we did not observe increase in hydroxymethylation levels, but alterations in TET3 gene expression. In conclusion, hydroxymethylation and expression levels of TET and IDH genes are important for MB. Though, functional assays that target these genes are required to elucidate their function in MB.

O meduloblastoma é o tumor maligno do sistema nervoso central mais frequente na infância e adolescência. A expressão de genes tipicamente expressos em células-tronco está correlacionada com pior prognóstico em pacientes com meduloblastoma e a expressão de POU5F1 se mostrou capaz de distinguir pacientes com desfecho clínico desfavorável e pior sobrevida. Apesar do seu valor prognóstico, não há evidências diretas da contribuição de OCT4 para a aquisição de fenótipos mais agressivos em meduloblastoma. Nesse contexto, o presente trabalho investigou o papel da isoforma OCT4A em características pró-tumorigênicas de meduloblastoma in vitro e in vivo, e também avaliou as alterações moleculares que podem ser responsáveis pela aquisição de fenótipo mais agressivo em células de meduloblastoma humano. Para tanto, foi realizada a superexpressão de OCT4A mediada por retrovírus em três linhagens celulares de meduloblastoma (Daoy, D283Med e USP-13-Med). As células de meduloblastoma com superexpressão de OCT4A exibiram maior proliferação e alterações no ciclo celular. Foram observados também aumentos na atividade clonogênica, geração de esferas tumorais e desenvolvimento tumoral em modelo subcutâneo, sendo esses efeitos dependentes dos níveis de OCT4A. A avaliação da mobilidade celular in vitro demonstrou diminuição na adesão celular e aumento da invasão celular de esferoide 3D. Em modelo ortotópico de meduloblastoma, as células com superexpressão de OCT4A geraram tumores mais desenvolvidos, com fenótipos mais agressivos, infiltrativos e metastáticos. A superexpressão de OCT4A foi associada a maior instabilidade genômica, entretanto, as aberrações em números de cópias variaram em frequência e tipo de alteração dependendo da linhagem celular, e sendo pouco associada com os genes diferencialmente expressos. De forma interessante, uma relevante expressão diferencial de RNAs não-codificadores de proteínas foi observada em células de meduloblastoma com superexpressão de OCT4A, incluindo os recém descobertos e pouco caracterizados RNAs não codificadores longos, além de múltiplos RNAs pequenos nucleolares. Assim, os resultados aqui apresentados fundamentam a relevância de fatores envolvidos em pluripotência para o agravamento de traços associados com desfecho clínico desfavorável em meduloblastoma e destacam o valor prognóstico e terapêutico de OCT4A neste tumor pediátrico do sistema nervoso central / Medulloblastoma is the most common malignant brain tumor in infants. The expression of typical pluripotency genes is correlated with poor prognosis in medulloblastoma and POU5F1 expression was shown capable of discriminating patients with poor survival outcome. Despite this prognostic value, direct evidences of OCT4 contribution to more aggressive traits in medulloblastoma are missing. In this context, we investigated the role of OCT4A isoform on pro-tumorigenic features of medulloblastoma in vitro and in vivo and evaluated molecular alterations that could be responsible for acquisition of a more aggressive phenotype in medulloblastoma cells. Retroviral-mediated overexpression of OCT4A were performed in three medulloblastoma cell lines (Daoy, D283Med and USP-13-Med). Medulloblastoma cells overexpressing OCT4A displayed enhanced cell proliferation and cell cycle alterations. Increased clonogenic activity, tumorsphere generation capability and subcutaneous tumor development were also observed, and these effects were OCT4A expression level-dependent. Evaluation of cell mobility in vitro showed loss of cell adhesion and greater 3D-spheroid invasion. In an orthotopic model of medulloblastoma, OCT4A overexpressing cells generated more developed, aggressive, infiltrative and metastatic tumors. OCT4A overexpression was associated with chromosomal instability but copy number aberrations varied in frequency and type according to the cell line, with little association with differently expressed genes. Interestingly, marked differential expression of non-coding RNAs, including newly discovered, still poorly characterized, long non-coding RNAs and multiple small nucleolar RNAs were observed in medulloblastoma cells with OCT4A overexpression. Altogether, our findings support the relevance of pluripotency-related factors in the aggravation of medulloblastoma traits classically associated with poor clinical outcome, and underscore the prognostic and therapeutic value of OCT4A in this challenging type of pediatric brain cancer