[pt] A administração de antimoniais no tratamento da leishmaniose é uma rara oportunidade para estudar o metabolismo de antimônio e das suas espécies químicas no corpo humano. No presente trabalho, a técnica de espectrometria de massa (ICPMS), acoplada ou não à cromatografia iônica (IC) e à geração de hidretos (HG), foi utilizada para determinação das concentrações de antimônio total e de suas espécies químicas, Sb(III), Sb(V) e trimetilantimônio (TMSbV) em amostras clínicas de pacientes com leishmaniose e/ou de macacos Rhesus (Mucaca mulatta) tratados com antimoniato de meglumina (AM). Diferentes regimes terapêuticos foram avaliados, incluindo a administração de doses baixa e alta (5 mg ou 20 mg de Sb(V) por kg de massa corpórea). A concentração total de Sb foi determinada após a decomposição de amostras por HNO3/H2O2. Análises de especiação foram realizadas em amostra de plasma e urina, através do acoplamento em linha da CI ao instrumento de ICPMS. Duas colunas de troca aniônica PRP-X100 foram utilizadas para a separação de espécies empregando o EDTA (eluição isocrática: 4,7 mmol L-1, 2,5% v/v metanol, pH 4,7) ou tampão de EDTA/fosfato (eluição com variação abrupta de eluente: 1o. eluente - 20 mmol L-1 EDTA + 2 mmol L-1, pH 4,5; 2o. eluente - 50 mmol L-1 (NH4)2PO4, pH 8,3) como fase móvel. As características de desempenho de todos os métodos foram avaliadas e serão apresentadas. Testes de estabilidades mostraram que as espécies de antimônio estudadas são suficientemente estáveis permitindo análises de especiação dentro de 24 horas após a coleta. Em humanos, assim como em macacos Rhesus, as concentrações de antimônio em amostras de urina e/ou plasma coletadas após o período de administração de AM, mostraram uma rápida cinética inicial de excreção (t1/2 ~ 3 dias) da droga, seguida de duas fases mais lentas. Determinou-se concentrações de Sb significativamente maiores em frações de hemácias do que nas amostras de plasma correspondentes, com exceção da fase inicial de administração da droga (primeiras 12 horas). A bioredução de Sb(V) a Sb(III) foi observada e confirmada como um importante processo metabólico durante a fase de eliminação. Nenhuma evidência de formação de TMSb (V) foi obtida em nossos estudos. As concentrações de antimônio em amostras de tecidos de macacos Rhesus coletadas aproximadamente 60 dias após a última administração de AM foram maiores na tireóide, seguida por fígado e baço. As concentrações no fígado foram pelo menos 1000 vezes maiores que a concentração basal. Amostras de cabelos/pelos e unhas de pacientes e símios tratados com AM também apresentaram altas concentrações, as quais corresponderam ao histórico de administração da droga e também mostraram que a incorporação de Sb nestes tecidos é acumulativa, mesmo após o fim da administração de AM. Em cabelos, mesmo após mais de 300 dias do fim do tratamento as concentrações de Sb não retornaram ao nível basal. / [en] Clinical applications of antimonials in the treatment of leishmaniasis are a unique opportunity to investigate the metabolism of antimony and its species in the human body. In this work, inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS), without or in combination with ion chromatography (IC) and flow injection hydride generation (FI-HG), has been used for the determination of total antimony concentrations [Sb] and three of its expected species, Sb (III), Sb (V) and trimethyl antimony (TMSbV), in clinical samples of leishmaniasis patients and/or of rhesus monkeys (Mucaca mulatta) treated with meglumine antimoniate (AM). Different drug administration schemes were evaluated, including low and high dose administration (5 mg or 20 mg of Sb5+ per kg of body mass). Total [Sb] was assayed after wet decomposition of the samples by HNO3/H2O2. Speciation analysis was performed on plasma and urine samples using IC on-line coupled to the ICPMS instrument. Two PRP-X100 anion exchange columns were used for species separation employing EDTA (isocratic elution: 4.7 mmol L-1, 2.5% v/v methanol, pH 4.7) or EDTA/phosphate buffer (step elution: 1st eluent - 20 mmol L-1 EDTA + 2 mmol L-1 KHP, at pH 4.5; 2nd eluent - 50 mmol L-1 (NH4)2HPO4 at pH 8.3) as the mobile phases. Performance characteristics of all methods were evaluated and are presented. Stability tests showed that all studied antimony species are sufficiently stable to allow speciation analysis within 24 hours after collection. In humans, as well as in rhesus monkeys, the concentrations of antimony in urine and/or plasma samples measured after the administration period of MA, showed rapid excretion kinetics (t1/2 ~ 3 days) of the drug followed by two slower ones. Significantly higher concentrations of [Sb] were measured in erythrocyte fractions than in corresponding plasma samples, excepting the very initial phase of drug administration (first 12 hours). Bio-reduction of Sb5+ to Sb3+ was observed and confirmed as an important metabolic process during the slow elimination phase. No evidence for the formation of TMSbV was so far obtained in our studies. Antimony concentrations in tissue samples of rhesus monkeys 60 d after the last AM administration were highest in thyroid, followed by liver and spleen. Liver concentrations were at least 1000 times the basal concentrations. Hair and nail samples from treated patients and monkeys had also very high Sb concentrations, which matched drug administration history and showed also that incorporation of Sb into these tissues is continuing, even after ceasing AM application. In human hair, more than 300 days are required for the return of antimony concentrations to basal levels.

Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-09-21T18:53:49Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) GABRIELA TAGLIANI LOPEZ.pdf: 1929634 bytes, checksum: 65b59bcc7ee2dd96fa3d6a96b37b9882 (MD5) / Approved for entry into archive by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-09-21T18:54:04Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) GABRIELA TAGLIANI LOPEZ.pdf: 1929634 bytes, checksum: 65b59bcc7ee2dd96fa3d6a96b37b9882 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-21T18:54:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) GABRIELA TAGLIANI LOPEZ.pdf: 1929634 bytes, checksum: 65b59bcc7ee2dd96fa3d6a96b37b9882 (MD5) Previous issue date: 2015-08-14 / A leishmaniose é uma doença infecciosa que pode acometer a pele, as mucosas e os órgãos internos. Apesar desta doença atingir, anualmente, cerca de 1,5 milhão de pessoas em todo o mundo, ainda possui poucas alternativas terapêuticas. O fármaco recomendado pela Organização Mundial de Saúde (OMS) para o tratamento das leishmanioses é o antimoniato de N-metilglucamina (Sb-AMG). O tratamento com esse fármaco pode induzir o indivíduo a um quadro de toxicidade, já que é derivado do antimônio (Sb), um metal encontrado livremente na crosta terrestre, principalmente sob a forma trivalente e pentavalente de oxidação. A forma trivalente mostrou-se clastogênica e com potencial cancerígeno tanto in vitro quanto in vivo. Dentro dessa problemática, estudos envolvendo o Sb-AMG são escassos, levando-se em consideração parâmetros genotóxicos. Este trabalho, portanto, teve como objetivo, avaliar comparativamente os efeitos de cinco diferentes concentrações (5-50 μg/mL) de Sb-AMG e de SbV sobre parâmetros citotóxicos, genotóxicos e mutagênicos em leucócitos humanos. Para os testes de citotoxicidade e genotoxicidade aplicamos a análise estatística de variância (ANOVA) de uma via e para os testes de mutagenicidade a ANOVA de duas vias. Entre as múltiplas comparações utilizamos o teste de Tukey e consideramos um resultado estatisticamente significativo quando p<0,05. Testes de proliferação celular, instabilidade cromossômica, teste do cometa alcalino e ensaio de quebra de fita dupla de DNA, demonstraram que ambas as formas de Sb testadas foram capazes de induzir alterações genotóxicas significativas, quando comparado ao controle negativo em, pelo menos, uma das concentrações ensaiadas. Os testes de viabilidade celular e micronúcleo foram utilizados para avaliar, respectivamente, a citotoxicidade e a mutagenicidade. Adicionalmente, foi avaliado o número de células apoptóticas e necróticas, bem como o índice de divisão nuclear citotóxico. Todos esses parâmetros demonstraram significantes alterações. De uma forma sem precedentes, o nível de Sb intracelular foi quantificado e relacionado com as diferentes concentrações de exposição e, a partir disso, nós sugerimos que o influxo de Sb ocorre de forma concentração dependente, mas com cinética de ordem zero. Tomando conjuntamente os dados obtidos, os resultados evidenciam claramente que o Sb-AMG possui efeitos citotóxicos, genotóxicos e mutagênicos em leucócitos humanos nas concentrações testadas. / Leishmaniasis is an infectious disease that can affect the skin, mucosa and internal organs. Although affecting about 1.5 million people each year, leishmaniasis has few therapeutic alternatives. N-methylglucamine antimoniate (Sb-GAM) is the drug of choice to treat leishmaniasis according to the World Health Organization. The treatment with this drug can induce the individual to a frame of toxicity, since it is derived from the antimony (Sb), a metal free found in the earth's crust, principally in the form trivalent and pentavalent oxidation. The trivalent form has clastogenic and carcinogenic potential both in vitro and in vivo. However, there are few genotoxic studies involving Sb-GAM. The main contribution of this study was to evaluate in vitro the cytotoxic, genotoxic and mutagenic parameters of five different concentrations (5, 10, 20, 40 and 50 μg/mL) of Sb-GAM and SbV in human leukocyte. For the cytotoxicity and genotoxicity tests we apply statistical one-way analysis of variance (ANOVA) and for mutagenicity tests the two-way ANOVA. Among the multiple comparisons we used the Tukey test and consider a statistically significant result when p <0.05. Cell proliferation, chromosomal instability, the alkaline comet assay and double- stranded DNA breaks assays, showed that both forms of Sb were genotoxic when compared to the negative control, at least, in one of the concentrations tested. Cell viability and micronucleus tests were used to evaluate, respectively, cytotoxicity and the mutagenicity. Additionally, there was assessed the number of apoptotic and necrotic cells, as well as nuclear division cytotoxicity index. All these parameters showed significant changes. In an unprecedented strategy, the intracellular Sb level was quantified and correlated with the different exposure concentrations and, from this, we could induce that the Sb inflow occurs in a concentration-dependent, but with a zero-order kinetics. Altogether, our results show clearly that Sb-GAM has cytotoxic, genotoxic and mutagenic effects on human leukocytes at the concentrations tested.

According to WHO, leishmaniasis is endemic in 98 countries, and has been placed ninth in a global analysis of infectious diseases. Treatment of leishmaniasis is based on pentavalent antimonials but toxicity and developing resistance have been reported. Traditional medicine and scientific studies have shown that the extract of Galipea longiflora Krause (Evanta) exhibits antileishmanial activity. We hypothesized that the healing observed when using this plant might not only be due to the direct action on the parasite, but possibly to a parallel effect on the host immune response. We found that an alkaloid extract of Evanta (AEE) inhibited the growth of Leishmania braziliensis promastigotes while viability of eukaryotic cells was practically not affected. We also found that AEE interfered with polyclonal activation or Leishmania-specific re-stimulation of lymphocytes, as revealed by a reduction of in vitro cellular proliferation and IFN-g production. More important, AEE treatment of mice hosting L. braziliensis showed that AEE is able to control both inflammation and parasite load. Additionally, the healing process was improved when AEE and meglumine antimoniate were administered simultaneously. Dendritic cells (DCs) play a pivotal role in T-cell stimulation and polarization of naïve T cells. Therefore, we investigated if AEE could alter the activation of DCs and if allostimulatory DCs properties were altered if activated in the presence of AEE. DCs activated in the presence of AEE reduced the production of IL-12p40 and IL-23. When we analyzed the allostimulatory capacity of AEE-treated DCs, we found that allogeneic CD4+ T-cells secreted lower levels of IFN-γ. In conclusion, this thesis provides valuable insight into the effects of Evanta derived extract. The dual effect found for AEE, on Leishmania parasite and on the immune response, suggests that AEE may be useful in controlling the parasite burden and preventing over-production of inflammatory mediators and subsequently avoiding tissue damage. / <p>At the time of the doctoral defense, the following papers were unpublished and had a status as follows: Paper 2: Accepted. Paper 3: Submitted.</p>

Submitted by Éder Freyre (ederfreyre@icict.fiocruz.br) on 2013-12-09T16:58:26Z No. of bitstreams: 1 Doutorado_Joao_Sores_Moreira.pdf: 1252428 bytes, checksum: d2d5a3f0a0354c9fe3d2c250c315377d (MD5) / Submitted by Éder Freyre (ederfreyre@icict.fiocruz.br) on 2013-12-09T17:10:36Z No. of bitstreams: 1 Doutorado_Joao_Sores_Moreira.pdf: 1252428 bytes, checksum: d2d5a3f0a0354c9fe3d2c250c315377d (MD5) / Approved for entry into archive by Paulo Marques(pmarques@fiocruz.br) on 2013-12-09T17:11:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Doutorado_Joao_Sores_Moreira.pdf: 1252428 bytes, checksum: d2d5a3f0a0354c9fe3d2c250c315377d (MD5) / Made available in DSpace on 2013-12-09T17:12:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Doutorado_Joao_Sores_Moreira.pdf: 1252428 bytes, checksum: d2d5a3f0a0354c9fe3d2c250c315377d (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Os antimoniais pentavalentesem doses de 10 a 20mg Sb 5+ /kg/dia continuam sendo o tratamento de escolha para a leishmaniose tegumentar americana (LTA), apesar dos relatos de baixa efetividade e de elevado número de efeitos adversos, inclusive óbito. Este estudo teve como objetivo descrever a efetividade e a segurança do antimoniato de meglumina 5mg Sb 5+ /Kg/dia no tratamento de pacientes com a forma mucosa ou mucocutânea (LM/LMC) da LTA, ao longo de dezesseis anos, no Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC), Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil. Foi realizado um estudo descritivo e retrospectivo, tipo série de casos acompanhados longitudinalmente. Os dadosforam obtidos dos prontuários dos pacientes com LM/LMC atendidos no Serviço de Otorrinolaringologia do IPEC entre 1º de janeiro de 1989 e 31 de dezembro de 2004 e tratados com baixa dose de antimoniato de meglumina, de forma contínua ou intermitente (em séries com intervalos de descanso). Dos 1667 pacientes com LTA tratados nesse período, 148 (8,9%) apresentavam LM/LMC. Destes, 98 (66,2%) tratados com antimoniato de meglumina 5mg Sb 5+ /Kg/dia foram incluídos neste estudo. A maioria dos pacientes eram homens que desempenhavam atividades de risco para LTA na região Sudeste do Brasil. A apresentação clínica mais frequente foi a forma mucosa tardia com acometimento nasal. Os pacientes submetidos ao tratamento em séries eram na maioria mais velhos e, possivelmente, com mais co-morbidades. Ambos os esquemas terapêuticos apresentaram boa efetividade com reduzido número de efeitos adversos. Mesmo nos pacientes com necessidade de retratamento, estes esquemas se mantiveram bem tolerados e eficazes. Os pacientes que foram tratados com anfotericina B ou alta dose de antimoniato de meglumina após o tratamento com baixa dose, responderam adequadamente. O tratamento com antimoniato de meglumina 5mg Sb 5+ /Kg/dia se mostrou efetivo e bem tolerado no tratamento da LM/LMC, com 91,7% de cura, mesmo que tendo sido necessário mais de um tratamento. / Pentavalent antimonials in 10 to 20mg Sb 5+ /kg/day doses are still the first drug of choice for American tegumentary leishmanisis (ATL) treatment despite reports of low efficiency and high number of adverse effects,including death. This study aims at describing the efficiency and safety of 5mg Sb 5+ /Kg/day of meglumine antimoniate in treating patients with mucous or mucocutaneous (ML/MCL) ATL over sixteen years at the Evandro Chagas Clinical Research Institute (IPEC), Oswaldo Cruz Foundation, Rio de Janeiro, Brasil. A retrospective and descriptive studywas conducted with a longitudinal surveillance of a series of cases. Datawere obtained from medical records of patients with ML/ MCL treated at IPEC Otorhinolaringology Department between January 1 st, 1989 and December 31, 2004 with low doses of meglumine antimoniate applied continuously or intermittently (in series with rest intervals). From a total of 1667 patients with ATL treated over that period, 148 (8.9%) presented ML/MCL. From those, 98 (66.2%) treated with 5mg Sb 5+ /Kg/day of meglumine antimoniate were included in the present study. Most patients were men who performed activitieswith risk for ATL in Southeastern Brazil. The most frequent clinical presentation was late mucousal impairment with nasal involvement. Patients undergoing serial treatment were mostly older and possibly with more co-morbidities.Both therapeutic plans presented good efficiency with few adverse effects. Even in patients needing retreatment, these therapeutic plans were well tolerated and efficient. Patients treated with anphotericin B or high dose of meglumine antimoniate,after treatment with low dose, presented an adequate response. Treatment of ML/MCL with 5mg Sb 5+ /Kg/day meglumine antimoniate was effective and well tolerated, with 91.7% healing, even when more than one treatment was needed.