Els individus infèrtils poden presentar anomalies d'aparellament, sinapsi o recombinació dels cromosomes meiòtics i/o alteracions en la dotació cromosòmica dels espermatozoides resultants. Per aquesta raó, els protocols d'anàlisi de la infertilitat masculina sovint inclouen estudis citogenètics de la meiosi en mostres de teixit testicular i/o estudis d'hibridació in situ fluorescent (FISH) en espermatozoides en mostres de semen. Tot i així, les sèries d'individus publicades mostren una elevada variabilitat probablement deguda: al nombre d'individus analitzats, als criteris d'inclusió d'aquests, a les característiques de la població control, als criteris de valoració de les mostres o a les comparacions estadístiques realitzades. A més a més, les característiques pròpies de les mostres de teixit testicular afegeixen algunes limitacions a aquest estudi; ja sigui perquè la quantitat de mostra sovint és escassa, perquè els individus infèrtils poden presentar aturades en l'espermatogènesi que impliquen una reducció en el nombre de fases avaluables o perquè no es poden identificar els cromosomes implicats en les anomalies. Per tot això, sovint es fa difícil establir les indicacions sota les quals realitzar estudis citogènetics sobre mostres de teixit testicular i/o estudis de FISH en espermatozoides, definir un protocol estandarditzat d'anàlisi i interpretar els resultats obtinguts d'aquests estudis en el context del consell genètic reproductiu del pacient infèrtil. Així doncs, en aquest treball es va plantejar optimitzar un protocol seqüencial d'identificació i anàlisi dels cromosomes meiòtics, combinant tècniques de tinció uniforme i d'hibridació in situ fluorescent Múltiplex (M-FISH), per tal de determinar la incidència d'anomalies cromosòmiques en els espermatòcits a metafase I i a metafase II d'una sèrie d'individus infèrtils. A més a més, també analitzar la proximitat dels bivalents autosòmics al bivalent sexual a metafase I. D'altra banda, es van emprar estudis de FISH en espermatozoides per determinar la incidència d'anomalies cromosòmiques dels cromosomes X, Y, 13, 18 i 21 en els espermatozoides d'una sèrie d'individus infèrtils. En aquest treball també es va analitzar la relació entre les anomalies cromosòmiques observades en els espermatòcits i en els espermatozoides amb el seminograma, el cariotip i l'edat dels individus. Finalment, es va plantejar establir directrius per a la utilització dels estudis meiòtics i dels estudis de FISH en espermatozoides en el context de l'estudi clínic del pacient infèrtil. Per assolir aquests objectius es van analitzar les metafases I i metafases II de 37 mostres de teixit testicular i els espermatozoides de 319 mostres de semen d'individus infèrtils. L'historial clínic del pacient va proporcionar informació del seminograma, del cariotip somàtic, del cariotip meiòtic i de l'edat d'alguns d'aquests pacients. En relació a les mostres de teixit testicular, i a partir de l'estudi dels espermatòcits primaris a l'estadi de metafase I, es va avaluar el nombre de quiasmes dels 23 bivalents per cada pacient, la variabilitat entre individus i la relació entre el recompte de quiasmes i el cariotip i/o el seminograma; a més a més d'analitzar la proximitat dels bivalents al bivalent sexual en aquesta fase. També es va avaluar la morfologia dels cromosomes a l'estadi de metafase II i els resultats obtinguts es van relacionar amb els descrits a metafase I. Pel que fa a les mostres de semen, i a partir de l'anàlisi dels cromosomes X, Y, 13, 18 i 21 mitjançant FISH, es van establir les freqüències de disomies i diploïdies dels espermatozoides d'aquests individus, i es van comparar amb la població control. Les comparacions també es van realitzar en relació al seminograma, al cariotip somàtic i al cariotip meiòtic dels individus. A més a més, es va analitzar la possible correlació entre els increments d'anomalies cromosòmiques dels espermatozoides i els paràmetres de recompte espermàtic, motilitat, morfologia i l'edat del pacient. Els resultats detallats d'ambdós estudis es recullen en la memòria escrita del treball. Analitzant conjuntament els resultats obtinguts en el present estudi i els publicats a la bibliografia, es va concloure que: El 48% dels individus infèrtils presenten un percentatge d'anomalies meiòtiques a l'estadi de metafase I compatible amb el diagnòstic de "meiosi alterada". La reducció del nombre de quiasmes, la presència d'univalents i l'observació de metafases tetraploides són les anomalies més freqüents. El nombre i el tipus d'anomalies són diferents entre les cèl·lules d'un mateix individu suggerint la coexistència de línies cel·lulars de comportament meiòtic normal i línies cel·lulars amb anomalies. La presència de cromàtides separades, la pèrdua de cromàtide i l'observació de metafases aneuploides i diploides, són les anomalies més freqüents a metafase II en individus infèrtils. El 15% dels individus infèrtils presenten increments significatius d'anomalies cromosòmiques en els espermatozoides. L'increment en el nombre d'espermatozoides disòmics pels cromosomes sexuals i/o en el nombre d'espermatozoides diploides són les anomalies més freqüents. La reducció del nombre de quiasmes a metafase I i la separació de les cromàtides germanes a metafase II afecta majoritàriament els bivalents/cromosomes autosòmics de mida mitjana i gran. Ambdues observacions es podrien relacionar amb una recombinació aberrant a primera divisió meiòtica, entesa com una reducció significativa del número de quiasmes i/o la presència de quiasmes pericentromèrics. El cromosomes sexuals i els cromosomes del grup F i G, principalment el cromosoma 21, són els que s'observen amb més freqüència en forma d'univalent, els més implicats en aneuploïdies a metafase II i en anomalies cromosòmiques en espermatozoides. La presència de percentatges significatius d'espermatòcits primaris tetraploides espermatòcits secundaris diploides posa de manifest la competència meiòtica de les línies tetraploides. L'increment significatiu d'espermatozoides diploides observat en pacients infèrtils suggereix la implicació d'anomalies cromosòmiques mitòtiques en la formació de gàmetes diploides. La posició dels bivalents a la placa metafàsica no és aleatòria: els bivalents formats per cromosomes dels grups D i G, i els bivalents 15 i 22 de forma particular, s'observen preferentment propers al bivalent sexual a metafase I. Les anomalies cromosòmiques en espermatòcits primaris i espermatozoides s'associen de forma significativa amb individus oligozoospèrmics i/o pacients amb alteracions del cariotip somàtic, ja sigui amb variants polimòrfiques o anomalies cromosòmiques estructurals. L'increment significatiu d'anomalies cromosòmiques en cèl·lules germinals en individus amb alteracions del cariotip recolza l'existència d'efectes intercromosòmics entre els cromosomes implicats i altres cromosomes del complement. La freqüència d'anomalies cromosòmiques numèriques analitzada en els espermatozoides dels individus infèrtils no mostra correlació amb l'edat. L'estudi meiòtic en biòpsia testicular està indicat en individus amb baix recompte espermàtic i/o alteracions del cariotip. Tenint en compte la informació obtinguda i el cost del procediment, no es recomana la incorporació rutinària de la tècnica de M-FISH en l'àmbit clínic. Es proposa la utilització de protocols citogenètics clàssics adreçats a analitzar la mitjana individual de quiasmes. Diferències significatives entre aquest valor i la freqüència basal s'interpretaran com "meiosi alterada". Un resultat de "meiosi alterada", tot i indicar anomalies en els processos d'aparellament, sinapsi i/o recombinació dels cromosomes, en la majoria de casos no es tradueix amb un increment d'anomalies cromosòmiques en espermatozoides. L'estudi de FISH en espermatozoides està indicat en individus amb un cariotip somàtic normal i baix recompte espermàtic, en individus amb un cariotip somàtic alterat i en individus amb un cariotip meiòtic anormal. L'estudi dels cromosomes 21, X i Y permet identificar la majoria dels pacients amb probabilitat de produir espermatozoides amb anomalies cromosòmiques. Un resultat de FISH en espermatozoides alterat, independentment del valor numèric, s'interpretarà com l'evidència d'anomalies en el procés de l'espermatogènesi i per tant, proporciona informació qualitativa del procés. / Infertile males can be affected by pairing, synaptic or recombination abnormalities in the meiotic chromosomes and/or chromosomal abnormalities in the resulting spermatozoa. For this reason, screening protocols of male infertility often include meiotic cytogenetic studies in testicular biopsies and/or fluorescent in situ hybridization (FISH) studies in spermatozoa from semen samples. However, the series published up to date show high variability in the results reported. This fact could be due to the number of individuals of the series, the inclusion criteria, the characteristics of the control population, the criteria used for sample assessment or even the statistical handling of data. In addition, the intrinsic characteristics of the testicular biopsies add limitations to meiotic studies: the scarce amount of the sample, the reduce number of evaluable phases (meiotic arrest) or the unfeasibility to clearly identify the chromosomes involved in the meiotic anomalies observed. Therefore, it is difficult to establish the indications for meiotic studies in testicular samples and/or FISH studies in spermatozoa. Furthermore, it is difficult to offer standardized protocols of analysis and to interpret the results obtained from these studies in the context of the reproductive genetic counsel to be given to the infertile patients. The first aim of this work was the optimization and the application of a sequential protocol from meiotic chromosome analysis, combining uniform staining techniques and multiplex fluorescent in situ hybridization protocols (M-FISH), addressed to assess the incidence of chromosomal abnormalities in metaphase I and in metaphase II spermatocytes from an infertile male series. The vicinity of the sex chromosomes (XY) to autosomic chromosomes in metaphase I was also analyzed. Furthermore, FISH studies in spermatozoa were used to estimate the incidence of chromosomal abnormalities in chromosomes X, Y, 13, 18 and 21 in a series of infertile individuals. The relationship of the chromosomal abnormalities observed in spermatocytes and spermatozoa with the seminal parameters, the karyotype and the age of the individuals was also studied. Finally, to establish guidelines for an appropriate application of meiotic studies and sperm FISH analyses in the clinical cytogenetic evaluation of the infertile patient was also attempted. To attain these objectives, metaphases I and metaphases II of 37 testicular tissue samples and spermatozoa from 319 semen samples from infertile individuals were analyzed. Clinical records provided us with information of seminal parameters, somatic karyotype, meiotic karyotype and age of some of these patients. Analyses of primary spermatocytes in the metaphase I stage allowed establishing the chiasmata number for every bivalents and patient, the variability among individuals and the relation between chiasmata count and the karyotype and/or the seminal parameters. Moreover, the proximity of the XY bivalent to other chromosome pairs in this phase was evaluated. The morphology of the chromosomes was also analyzed in the metaphase II stage and the results obtained were compared with the ones obtained from metaphase I. Regarding the semen samples, from the FISH analysis of chromosomes X, Y, 13, 18 and 21, the frequencies of disomic and diploid spermatozoa were established, and compared to a control population. The comparisons were also carried out to the seminal parameters, the somatic karyotype and the meiotic karyotype of the individuals. Moreover, the possible correlation between increases of chromosomal abnormalities in spermatozoa and variations in sperm parameters (count, motility and morphology) and the age of the patients were evaluated. Detailed results of the studies undertaken were included in the report of this work. In view of the results obtained in the study it was concluded that: Forty-eight percent of infertile males show a percentage of meiotic abnormalities in metaphase I compatible with the diagnosis of "abnormal meiosis". The reduction in the number of chiasmata, the presence of univalents and the observation of tetraploid metaphases are the most frequent anomalies. The number and the type of anomalies are different among cells in the same individuals, suggesting the coexistence of cell lines with a normal meiotic behavior and cell lines with meiotic abnormalities. The presence of separated chromatids, chromatid loss and the observation of aneuploid and diploid metaphases, are the most frequent anomalies in metaphase II in infertile individuals. Fifteen percent of infertile males show significant increases of chromosomal abnormalities in spermatozoa. The most frequent anomalies are the increase of spermatozoa disomic for the sex chromosomes and/or the number of diploid spermatozoa. The reduction in the number of chiasmata in metaphase I and the separation of the sister chromatids in metaphase II affects mostly autosomal chromosomes of medium and large size. Both observations could correlate with aberrant recombination in the first meiotic division, knowledgeable as a significant reduction in the number of chiasmata and/or the presence of pericentromeric chiasmata. The sex chromosomes and the chromosomes of group F and G, mainly chromosome 21, are those observed with more frequency in univalent form, the ones more involved in aneuploidies in metaphase II and in chromosomal abnormalities in spermatozoa. The presence of significant percentages of tetraploid primary spermatocytes and diploid secondary spermatocytes evidences the meiotic competence of tetraploid lines. The significant increase of diploid spermatozoa observed in infertile patients suggests the implication of mitotic chromosomal anomalies in the formation of diploid gametes. The position of the bivalents in the metaphase I plate is not random: bivalents corresponding to chromosomes of groups D and G, and bivalents 15 and 22 in particular, are preferably observed in the vicinity of the XY bivalent. Chromosomal abnormalities in primary spermatocytes and in spermatozoa are significantly associated with oligozoospermic individuals and/or patients with alterations of the somatic karyotype (polymorphic variants or structural chromosomal anomalies). The significant increase of chromosomal abnormalities in individuals with alterations of the karyotype supports the existence of interchromosomal effects between the implied chromosomes and other chromosomes of the complement. The frequency of numeric chromosomal anomalies analyzed in spermatozoa of infertile males does not show any correlation with the age of the patients. Meiotic studies in testicular biopsy are indicated in individuals with low sperm counts and/or alterations of the karyotype. Taking into consideration the information obtained and the cost of the procedure, the routinely use of the M-FISH technique in the meiotic clinical analysis is not recommended. The use of classical cytogenetic protocols addressed to analyze the individual average of chiasmata is proposed. Significant differences between this value and the basal frequency will be interpreted as "abnormal meiosis". A result of "abnormal meiosis", although being indicative of pairing, synapsis and/or recombination anomalies, in the majority of cases does not lead to increases in sperm chromosome abnormalities. FISH studies in spermatozoa are indicated in individuals with a normal somatic karyotype and low sperm counts, in individuals with an abnormal somatic karyotype and in individuals with an abnormal meiotic karyotype. The study of chromosomes 21, X and Y allows the identification of the majority of the patients with probability of producing spermatozoa with chromosomal abnormalities. An abnormal result of the sperm FISH study, independently of the numerical value, will be interpreted as evidence of anomalies in the spermatogenesis and therefore, provides qualitative information of the process.

Els oòcits de vertebrats es troben aturats a la profase I de la primera meiosi (PI). Durant el procés anomenat oogènesi, els oòctits sintetitzen i emmagatzemen grans quantitats d'ARN missatgers(ARNm)que els seran necessaris per la compleció de la meiosi.I,per posteriorment, aturar-se de nou a la metafase de la segona divisió meiòtica (MII) per l'activitat del factor citostàtic(CSF).D'aquestes divisions en destaca el fet que transcorren en absència de transcripció, i per tant depenen totalment en l'activació traduccional dels ARNm anteriorment esmentats que han estat acumulats durant l'oogènesi. L'activació traduccional d'aquests missatgers és principalment induïda per l'elongació de les cues d'adenines(cues de poli(A)), aquest procés és mediat per les seqüències de poliadenilació citoplasmàtiques (CPE)presents a la regió 3' no tradudïda (3'UTR)dels ARNm. El moment i la longitud de la poliadenilació dels ARNm que contenen CPEs estan finament regulats, de manera que en combinació amb la degradació de proteïnes, s'estableixen els patrons específics d'expresió de les proteïnes que condueixen la meiosi (Shmitt et al., 2002; de Moor and Richter, 1997; Ballantyne et al., 1997; Mendez et al., 2002; Charlesworth et al., 2002). Fins a la data, no s'havia descrit que la deadenilació (escurçament de la cua de poli(A)) fos necessària per la progressió meiòtica. En aquesta tesi s'ha descrit, a partir d'un cribatge d'abast genòmic, una ruta de retroalimentació negativa requerida per a la sortida de la primera metafase meiòtica. La nova ruta identificada, a més té la particularitat d'actuar a nivell traduccional regulant l'expressió de proteïnes que participen directament en la progressió meiòtica. L'element central d'aquesta nova ruta és la proteïna C3H-4, que a la vegada és regulada per poliadenilació citoplasmàtica. C3H-4 crea la retroalimentació negativa interaccionant amb elements ARE de les regions 3'UTR, promovent la deadenilació del ARNm al qual s'uneix. D'entre les seves dianes hem identificat Emi1 i Emi2, ambdós reguladors de l'activitat de l'APC/C, crítica per la divisió cel·lular.