Dans l’épiderme, les mélanocytes participent à la protection de la peau contre les rayons ionisants du soleil en synthétisant un pigment, la mélanine, dans des compartiments apparentés aux lysosomes appelés melanosomes. La mélanogenèse est un processus séquentiel initié par la production de fibres amyloïdes dont la composante principale est la protéine PMEL. Ces fibres séquestrent la mélanine et permettent l’élimination d’intermédiaires toxiques produits lors de sa synthèse. La mélanogenèse et le phénotype pigmenté sont affectés lorsque le processus de formation des fibres est altéré. Les fibres résultent du clivage de PMEL dans les endosomes précurseurs des mélanosomes mais les protéases impliquées dans ce processus restent peu ou pas caractérisées. Afin de mieux comprendre les mécanismes de formation des fibres amyloïdes dérivées de PMEL, j’ai étudié le rôle de deux protéases : les Bêta-sécrétases BACE1 et BACE2. En combinant des techniques de biochimie, d’immunocytochimie et d’imagerie photonique et électronique, j’ai montré que la perte de l’expression de Bace2 in vivo (souris KO BACE2) ou sa déplétion (siRNA) dans une lignée de mélanocytes inhibent le clivage amyloïdogénique de PMEL et affectent à la fois la formation de fibres de PMEL dans les mélanosomes et la pigmentation. J’ai pu notamment reproduire in vitro le clivage spécifique de PMEL en utilisant une forme recombinante de BACE2. En parallèle, j’ai également étudié le rôle de BACE1 dans la mélanogenèse. Mes résultats indiquent que BACE1, bien que n’étant pas impliquée dans le clivage de PMEL, régulerait la maturation des mélanosomes précoces in vivo et in cellulo, en modulant les contacts entre mélanosomes et réticulum endoplasmique (RE). Dans les mélanocytes, BACE1 est présente dans le RE et interagit avec des protéines impliquées dans les contacts RE-endosomes. Ces contacts seraient cruciaux pour le transfert de molécules nécessaires à la maturation des mélanosomes. L’ensemble de ces résultats démontre un rôle pour chacune des Bêta-sécrétases dans le processus de mélanogenèse, levant le voile sur des processus clés liés à la biogenèse des mélanosomes. Par ailleurs, les fibres de PMEL constituant le modèle le plus abouti de l’amyloïdogenèse physiologique chez les mammifères, ces études pourraient à plus long terme aider à la compréhension de la formation des fibres amyloïdes pathologiques ; notamment dans la maladie d’Alzheimer où l’amyloïdogenèse d’APP est très similaire à celle de PMEL. / In the epidermis, melanocytes synthetize a pigment called melanin, in lysosome-related-organelles called melanosomes, in order to protect the skin against the ionizing radiations of the sun. Melanogenesis is a sequential process initiated by the formation of amyloid fibrils whose principal component is the protein PMEL. Those fibrils sequester the melanin pigment and allow the removal of toxic intermediates formed during its synthesis. Melanogenesis and the pigmented phenotype are affected when the process of fibrils formation is altered. Fibrils come from the processing of PMEL in endosome precursors of melanosomes but the proteases implicated in this process are not well characterized. In order to better understand the mechanisms implicated in the formation of the PMEL amyloid fibrils, I studied the role of two proteases: the Beta-secretases BACE1 and BACE2. Using a combination of biochemical, immunocytochemical methods and photonic and electronic imaging, I have shown that the loss of Bace2 expression in vivo (BACE2 KO mice) or its depletion (siRNA), in a melanocyte cell line, inhibit the amyloidogenic processing of PMEL and affect both the formation of the PMEL fibrils in melanosomes and pigmentation. I could reproduce in vitro the specific cleavage of PMEL by using a recombinant form of BACE2. In parallel, I have also studied the role of BACE1 in melanogenesis. My results indicate that BACE1, even though it is not implicated in PMEL processing, could regulate the maturation of early melanosomes in vivo and in cellulo, by modulating the contacts between melanosomes and endoplasmic reticulum (ER). In melanocytes, BACE1 is present in the ER and interacts with proteins implicated in ER-endosomes contacts. Those contacts would be crucial for the transfer of molecules that are necessary for melanosome maturation. All together those results demonstrate the role of both Beta-secretases in melanogenesis, and reveal key processes involved in melanosome biogenesis. Moreover, because PMEL fibrils are the most completed model of physiological amyloidogenesis in mammals, theses studies could help in the future the understanding of the formation of pathological amyloid fibrils; in particular in the Alzheimer’s disease where the amyloidogenesis of APP is very similar to the one of PMEL.

Doctor of Philosophy / Department of Plant Pathology / Barbara S. Valent / Rice (Oryza sativa L.) production worldwide is constrained by rice blast disease caused by the ascomycetous fungus Magnaporthe oryzae. Rice blast has become a model system for the study of fungal plant diseases based on its global relevance to agriculture and on our ability to apply molecular genetic and genomic analyses to both the pathogen and the plant. We have applied molecular and cellular analyses to understand critical processes in the M. oryzae disease cycle. The dark melanin pigment produced by the fungus is critical for the function of its specialized appressorial cell, which punches the leaf surface by generating the highest pressure known in any biological system, estimated at 80 times the atmospheric pressure. Without melanin, the fungus can neither generate this pressure nor puncture the plant surface and disease does not occur. M. oryzae genome sequencing identified a cluster of melanin biosynthesis genes that included an attractive candidate for the transcription factor that regulates melanin biosynthesis in appressoria. We report the structural and functional characterization of this putative transcription factor, although its role remains elusive. Host cellular responses after appressorial penetration are equally important in determining if disease will occur. We have characterized the cellular response of one rice variety to a compatible fungal strain (causes disease), an incompatible strain (fails to cause disease due to specific triggering of rice defenses) and a non-host strain (causes disease in barley but not in rice). Distinctive fungal and rice cellular responses correlated with the outcome of each particular pathogen-strain rice interaction. We report contrasting responses in two rice leaf sheath assays that are amenable to live cell microscopy, as well as a novel cellular response of crystalline aggregations deposited inside the host cell under appressoria on the leaf surface. Our studies have important implications for future analyses of pathogenicity and host specificity in rice blast disease.

Bacterial volatile organic compounds (VOCs) are signal molecules that may have beneficial roles in the soil-plant-microbiome ecosystem. In this Ph.D. thesis, I aimed to assess and characterize the role of bacterial VOCs in plant tolerance to drought and in the biocontrol of fungal pathogens. I started by studying two root endophytic bacteria isolated from pepper plants cultivated under desert farming conditions. They showed an enhancement of pepper tolerance to drought stress and an amelioration of its physiological status. Moreover, they induced the expression of a vacuolar pyrophosphatase proton pump (V-PPase), implicated in the regulation of the vacuolar osmotic pressure, facilitating water uptake. Besides, the exposure of Arabidopsis thaliana plants, grown under salinity stress, to the volatile 2,3-butanediol, described for its plant growth promotion (PGP) potential, enhanced the plants tolerance to salinity, proving the potential involvement of this volatile in the osmotic stress resistance mechanism. Then, I studied VOCs released by three bacteria associated to healthy rice plants. Their released VOCs mixtures modified the color pattern of Magnaporthe oryzae, the agent of the rice blast disease, and protected rice from the pathogen infection. A significant reduction of melanin production, sporulation and appressoria formation was measured in presence of the bacterial VOCs, without major effects on mycelial proliferation. 1-butanol-3-methyl, one of the nine VOCs co-produced by the studied bacteria, proved its potential of reducing M. oryzae melanin in vitro. In vivo tests confirmed the infection inhibition effects mediated by the rice-bacterial VOCs, with a reduction of 94% of the disease incidence. Lastly, I compared the genomes of the five bacteria considered in the previous experimental studies. The PGP traits and the VOCs pathways identified from the genome analyses confirmed the effects observed with the in vitro and in vivo assays, revealing a complex mode of promotion and protection offered by the studied plant-associated bacteria. In conclusion, plant-associated bacterial VOCs can play potentially important roles in modulating plant drought tolerance and reducing fungal virulence. Such biological resources represent novel tools to counteract the deleterious effects of abiotic and biotic stresses and have the potential to be exploited for sustainable approaches in agriculture.

Sexual selection theory tries to explain evolution of apparently useless traits which mainly developed in males of numerous species. One such trait is also rich and vibrant coloration, typical for many of the bird species. These traits are difficult to be falsified, and therefore they honestly signal quality of the individual. Carotenoid coloration reflects the health condition and melanin coloration the social status, even though this traditional division might not be as strict according to the latest studies. Apart from these ways of maintaining honesty, recent studies are focusing more also on the effect of hormones, mainly two steroids: male sexual hormone - testosterone -, and the "stress" hormone - corticosterone. Both hormones could positively influence male's sexual traits such as ornamental coloration. On the other hand, elevated levels of these hormones possess risk to the organism (higher energetic expenditure, chronic stress), therefore also might potentially become costly. Using photographs of birds in standardized conditions as well as spectrophotometry I analyzed the plumage coloration of males of the Yellowhammer (Emberiza citrinella). Concentrations of testosterone and corticosterone deposited in feathers were analyzed using the LC-MS/MS. Also, for males in breeding season 2015,...

Depressionen gehören mit einer Prävalenz von 5-25% weltweit zu einer der am häufigsten vorkommenden psychischen Erkrankungen (Bromet et al., 2011) und zählen weiterhin zu einer der Hauptursachen von Erwerbsunfähigkeit (Bundespsychotherapeutenkammer, 2013). Zu den Hauptsymptomen der Depression gehören eine gedrückte Stimmung, Interessenlosigkeit und Antriebsstörung. Depressionen äußern sich häufig in körperlichen Symptomen wie Schlafstörungen, Gewichtsveränderungen und Kopfschmerzen (Fava & Kendler, 2000; American-Psychiatric-Association, 2013). Die bei depressiven Erkrankungen typischerweise vorkommenden Schlafstörungen beinhalten vermehrte Tagesmüdigkeit, Durchschlaf- und Einschlafstörungen sowie frühmorgendliches Erwachen. Diese Symptome könnten Ausdruck einer gestörten Wachheitsregulation (Arousalregulation) sein. Die Arousalregulation kann mittels einer Ruhe-EEG-Aufzeichnung klassifiziert werden (Loomis et al., 1937; Bente et al., 1964). Störungen der Arousalregulation bei unipolar depressiven Patienten gegenüber gesunden Kontrollen konnten in einer Anzahl von Studien gezeigt werden (Hegerl et al., 2012, Schmidt et al., 2016). Daher ist die Untersuchung der Arousalregulation in Verbindung mit Untersuchungen des schlafförderndes Neuropeptides Melanin-konzentrierendes Hormon (MCH) und Parametern der Schlaf-Wach-Regulation vielversprechend. In präklinischen Studien wurde vielfach ein Zusammenhang zwischen dem hypothalamischen MCH und depressionsähnlichen Verhaltensweisen gefunden und es wurden Behandlungsmöglichkeiten durch Veränderungen der MCH-Regulation angeregt (Chung, Parks, Lee & Civelli, 2011; Luppi et al., 2013). Diesbezüglich wurden MCH-Rezeptor-Antagonisten als potentielle Angriffspunkte neuer antidepressiver Medikamente untersucht und es konnte gezeigt werden, dass die Injektion von MCH einen depressiogenen Effekt hat, während die Antagonisierung von MCH durch Rezeptormodulation zu reduziertem depressivem Verhalten führte (Georgescu et al., 2005; Lagos et al., 2011; Borowsky et al., 2002; Roy et al., 2007). Die Rolle des MCH-Systems bezüglich der Regulation von affektiven Störungen im Menschen wurde bisher noch nicht untersucht. Das primäre Ziel dieser Arbeit ist, die Zusammenhänge zwischen depressiven Störungen, dem MCH und der Schlaf-Wach-Regulation zu untersuchen. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die MCH Serumkonzentrationen bei 30 Patienten mit depressiver Symptomatik im Verlauf zu drei Messzeitpunkten: vor Beginn der Medikation (T1) und 2 (T2) und 4 Wochen (T3) nach Beginn der medikamentösen Therapie. Die MCH-Konzentrationen der 30 depressiven Patienten verglichen wir mit 30 für Alter (+/- 1 Jahr) und Geschlecht gematchten gesunden Kontrollprobanden, welche wir nur zu einem Zeitpunkt (T1) untersuchten. Der erste Messzeitpunkt für die Patienten umfasste jeweils die Abnahme einer Blutprobe, eine 15-minütige Ruhe-EEG Ableitung sowie die Erhebung verschiedener testpsychologischer Interviews und Fragebögen zur Beurteilung der Schwere der Depression und Schlafparameter. Die MCH-Serumkonzentrationen wurden mittels eines Fluoreszenzimmunoassays (FIA) bestimmt. Die Folgemessungen (T2 und T3) der depressiven Patienten bestanden aus Interviews und Fragebögen zur Erfassung der Depressionssymptomatik und Schlafparameter und einer Blutentnahme. Die MCH-Konzentrationen unterschieden sich zum Zeitpunkt der baseline Messung nicht signifikant zwischen unmedizierten Patienten und gesunden Kontrollen. In der Gruppe der Depressionspatienten, nahmen die Konzentrationen von T1 zu T3 signifikant ab. Post-hoc-Analysen zeigten, dass die Parameter Medikation und Geschlecht der depressiven Patienten bei den gefundenen Veränderungen der MCH-Konzentrationen eine wichtige Rolle spielen. Die MCH-Konzentrationen unterschieden sich signifikant in den Patienten, die mit Mirtazapin behandelt wurden, jedoch nicht in Patienten, die mit Escitalopram behandelt wurden und in weiblichen, aber nicht in männlichen Patienten. Die MCH-Konzentrationen zeigten hohe Korrelationen von T1 bis T3 innerhalb der Depressionspatienten und korrelierten signifikant mit den Schlafparametern in gesunden Kontrollen. Die Untersuchung der EEG-basierten Arousalregulation im Zusammenhang mit den MCH-Konzentrationen zeigte, dass die Patienten mit hohen MCH-Konzentrationen einen geringeren Anteil (%) des Vigilanzstadiums A1 aufweisen als Patienten mit niedrigen MCH-Konzentrationen. In der Gruppe der gesunden Kontrollen (hohes vs. niedriges MCH) zeigten die Probanden mit hohen MCH-Konzentrationen einen gerineren Anteil (%) der Substadium A2 und A3. Die Korrelationen der einzelnen Vigilanzstadien mit den MCH-Konzentrationen der untersuchten Gruppen fand eine signifikant negative Korrelation des Substadiums A1 in der Gruppe der depressiven Patienten, der Häufigkeit des Stadien- und Substadien-Wechsels mit den MCH-Konzentrationen in der Gruppe der depressiven Patienten. In der Gruppe der gesunden Kontrollen korrelierte das Substadium A2 negativ mit den MCH-Konzentrationen. Erstmalig konnte gezeigt werden, dass die MCH-Serumkonzentrationen in Depressionspatienten im Behandlungsverlauf mit antidepressiver Medikation signifikant abnehmen, während sich die MCH-Konzentrationen zwischen gesunden Kontrollen und unmedizierten depressiven Patienten nicht unterscheiden. Die Resultate deuten nicht auf Veränderung der peripheren MCH-Konzentrationen in Depressionspatienten hin, könnten jedoch depressionsbedingte Zustände (state properties) reflektieren, welche durch Schlaf, Medikation und Geschlecht reguliert werden können. Als Ursache für die Konzentrationsveränderungen des MCH ist eher der Effekt antidepressiver Medikation anzunehmen als Veränderungen in der Depressionsschwere, da die Gesamt-scores der Depressionsschwere nicht mit MCH-Konzentrationen der Patienten korrelierte. Des Weiteren unterschieden sich die MCH-Konzentrationen an keinem der drei Messzeitpunkte zwischen den Patienten, die auf die Behandlung ansprachen (respondern) und den Patienten, die nicht auf die Behandlung ansprachen (non-respondern). Die MCH-Konzentrationen der gesunden Kontrollen und depressiven Patienten (in denen die Depressionsschwere über die Zeit abnahm) dissoziierten eher, als dass sie sich annäherten (von T1 zu T3). Daher lässt sich vermuten, dass ein Zusammenhang zwischen der MCH-Expression und der antidepressiven Medikation besteht und eine Modulation der adrenergen und serotonergen Transmission existiert. Diese Annahme wird gestützt durch die Veränderungen der MCH-Konzentrationen innerhalb der Patienten, die mit Mirtazapin behandelt wurden. Die MCH-Konzentrationen nahmen in der Mirtazapin-Gruppe im Verlauf signifikant ab, während die Veränderungen in der Escitalopram-Gruppe nicht signifikant waren, obwohl diese aus mehr Patenten bestand. Dieser mutmaßliche Effekt des noradrenergen und serotonergen Antidepressivums Mirtazapin ist möglicherweise seinen schlaffördernden Eigenschaften zuzuschreiben (Winokur et al., 2003). Unterstützt durch die Feststellung, dass Noradrenalin MCH-Neurone hyperpolarisiert (Bayer et al., 2005), deuten unsere Resultate auf eine potentiell durch Mirtazapin vermittelte Blockade von Noradrenalinrezeptoren hin, die wiederum die Feuerungsrate von MCH-Neuronen und damit die Freisetzung von MCH vermindert. Nach Aufteilung der Depressionspatienten nach Geschlecht, zeigten sich signifikante MCH-Veränderungen im Behandlungsverlauf in weiblichen, aber nicht in männlichen Patienten. Eine präklinische Studie, die Geschlechterunterschiede untersuchte, konnte zeigen, dass die Inaktivierung des MCH1R zu antidepressivem Verhalten in weiblichen, aber nicht in männlichen Mäusen führte, während sowohl männliche als auch weibliche knockout Mäuse ähnliches angstlösendes Verhalten zeigen (Roy et al., 2007). Depressive Erkrankungen stellen einen ernsten Risikofaktor der Gesundheit für Frauen dar, mit einer zweifach höheren Lebenszeitprävalenz, als bei Männern (Sloan und Kornstein, 2003, Simonds und Whiffen, 2003). Der MCH-Rezeptor als Zielstruktur könnte neue Therapieoption depressiver Störungen bieten mit einer potentiell höheren Wirksamkeit bei Frauen. Die Ergebnisse deuten auf einen Zusammenhang zwischen der EEG-basierten Arousalregulation und den MCH-Konzentrationen hin. Da das MCH mit schlaffördernden Eigenschaften assoziiert ist (Übersichtsartikel: Torterolo et al., 2011; Monti et al., 2013; Konadhode et al., 2015) und maximale MCH-Konzentrationen im Menschen während der Einschlafphase gemessen wurden (Blouin et al., 2013), kann man die gefundenen Zusammenhänge unserer Messergebnisse als übereinstimmend mit den Ergebnissen aus der Literatur betrachten. Auch Ergebnisse aus präklinischen Studien lassen vermuten, dass das MCH an der Modulation von Vigilanzsstadien (Wachheit, REM- und NREM-Schlaf) beteiligt ist (Kilduff & De Lecea 2001; Modirrousta, Mainville, & Jones, 2005; Van Den Pol, Acuna-Goycolea, Clark, & Ghosh, 2004; Verret et al., 2003). Unsere Ergebnisse sprechen gegen eine im Serum messbare Abweichung der MCH-Regulation in Depressionspatienten, deuten jedoch auf depressionsbedingte Zustände hin, welche durch Schlaf, Medikation und Geschlecht reguliert werden. Weitere Forschung mit größeren Stichproben und einer Untersuchung der MCH-Konzentration im CSF depressiver Patienten ist notwendig, um den Zusammenhang zwischen dem MCH und der unipolaren Depression genauer zu charakterisieren.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 2 1 Einführung 4 1.1 Depressionen und Symptomatik 4 1.2 Melanin-konzentrierendes Hormon (MCH) und Depression 5 1.3 Die Rolle von MCH in der Schlaf-Wach-Regulation und Depression 7 2 Ziel der Arbeit 9 3 Methoden 10 3.1 EEG-basierte Arousalregulation 11 4 Ergebnisse 17 4.1 MCH-Konzentrationen bei MDD Patienten und gesunden Kontrollen 17 4.1.1 MCH Konzentrationen im Verlauf 17 4.1.2 MCH-Konzentrationen und subjektive Schlafparameter 17 4.2 EEG-basierte Vigilanzregulation 17 5 Originalarbeit 21 6 Diskussion 29 Zusammenfassung der Arbeit 35 Literaturverzeichnis 40 Anlagen 50 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 68 Lebenslauf 69 Danksagung 71

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The effects of low doses of ionizing radiation on living things is a continually evolving area of research. Importantly, low dose effects were historically overlooked and not properly accounted for the assessment of risk to human health, as is the case with the contentious linear no-threshold model. These low dose effects are now known to be relevant to human health in both accidental and intentional exposures, including doses relevant to medical diagnostics and therapeutics. Furthermore, there is a relative dearth of information on low dose effects in non-human species, which necessitates further investigation and evaluation of radiosensitivity. Radiation-induced bystander effects occur in organisms due to the receipt of signals from directly irradiated cells, which act to communicate radiation damage to surrounding cells. Recent research has identified one type of bystander signal which is carried by photons of biological origin, however the effects produced in bystander cells receiving these photons has not been extensively investigated. It was suspected, based on previous research, that reactive oxygen species participate in the manifestation of this bystander effect. Three mammalian cell lines were assessed for their ability to produce bystander photons upon direct irradiation; subsequently, radiologically unexposed cells were exposed to the resulting photons and assayed for biological effects. The human cell lines used exhibited significant photon emissions and oxidative stress, clonogenic cell death, reduced cellular metabolism, and compromised mitochondrial oxidative phosphorylation following exposure to these photons. The use of a melanocyte cell line indicated that these effects are attenuated by melanin, and this is suspected to occur through photoabsorption or antioxidant mechanisms. Additionally, the same assays were conducted following cell exposure to hydrogen peroxide at low concentrations to assess responses to oxidative stress relevant to bystander responses, indicating less overall sensitivity in the examined melanocytes. These findings are significant because they contribute to our understanding of the mechanisms behind low dose biological effects, because they further challenge the linear no-threshold model and other models based on target theory, because they provide evidence for differential responses to the physical bystander signal in non-human species, and because secondary photon emissions are likely relevant to the medical radiation sciences. / Thesis / Master of Science (MSc) / Low doses of ionizing radiation interact with living things differently than high doses. Low dose effects are now known to be relevant to human health and protection of the environment. Radiation-induced bystander effects occur in cells due to the receipt of signals from irradiated cells which act to communicate radiation damage to surrounding cells. One type of bystander signal is carried by photons emitted from directly irradiated cells, however the effects produced in bystander cells receiving these photons has not been extensively investigated. This thesis investigates the cellular effects of these “biophotons”, including cell survival, oxidative stress, and metabolism.

An analysis of the presence or absence of black melanin in broiler chickens as affected by the presence of different traits is studied in the following project. The purpose of this analysis is to show that the simple partitioning of chi-square method is as good as any method. This project also shows the equivalence of different statistical methods. / Thesis / Master of Science (MSc)

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