För att diagnostisera malignt melanom och dess undergrupper används immunhistokemi för att färga in celler som uttrycker specifika protein. Särskilt desmoplastiska melanom kan initialt felbedömas baserat på utseendet som ärr, och det är därför viktigt att ha sensitiva antikroppar för att diagnostisera dem. Elva arkiverade patientprover (varav tre epiteloida melanom, fyra spolcelliga, tre desmoplastiska och ett akralt lentiginöst) färgades in med antikroppar mot CK18, HMB-45, Melan-A, S100, SOX10 och synaptophysin. Alla prover var negativa för CK18, nio var positiva för HMB-45 och Melan-A (de negativa var båda desmoplastiska melanom) och alla var positiva för S100 och SOX10. Synaptophysin var positiv i alla epiteloida melanom och det akralt lentiginösa melanomet, två av de fyra spolcelliga melanomen och negativ i alla desmoplastiska melanom. Fördelarna med SOX10, som tidigare studier i ämnet har påvisat, observerades inte i denna studie, troligen på grund av begränsningen i patientmaterial. Trots det verkar SOX10 vara ett användbart tillägg i melanompanelen, eller kanske till och med kan ersätta S100, baserat på tidigare studier.

Im Rahmen der Dissertation wurde ein Verfahren zur Quantifizierung monosomer Zellpopulationen innerhalb eines disomen Normalgewebes auf Basis der Pyrosequenzierung von Einzelbasenmutationen etabliert und hinsichtlich seiner Genauigkeit untersucht. Dabei liegt ein besonderer Schwerpunkt auf der Entwicklung eines Verfahrens zur Festlegung von Grenzwerten für die Detektion monosomer Population sowie für genetisch heterogene Subpopulationen. Zur Bestimmung der Genauigkeit wurden Mischreihen von DNA zweier Genotypen angefertigt und das Allelverhältnis durch Pyrosequenzierung gemessen. Diese Ergebnisse wurden genutzt, um Grenzwerte für die Detektion von LOH3-positiven Zellen im UMM estzulegen. In diesen Vorversuchen konnte die Anwendbarkeit der Analysemethode für Proben aus UMM sowohl aus Enukleations wie auch aus Feinnadelaspirationspräparaten demonstriert werden. Es wurde dann in einem weiteren Schritt analysiert, wie viele differente Loci für eine korrekte Diskriminierung zweier Genotypen analysiert werden müssen. Hier wurde gezeigt, dass zum einen die Anzahl der untersuchten SNP aber auch das gemessene Allelverhältnis maßgeblichen Einfluss auf die Genauigkeit der Analyse haben. Basierend auf diesen Daten wurde ein Verfahren entwickelt, das aus der gewünschten Genauigkeit eine Berechnung des Umfangs eines zu etablierenden SNP-Panels ermöglichte.

Ein Tumor stellt nicht nur eine Ansammlung entarteter Zellen dar, sondern ist vielmehr ein komplexes Pseudoorgan, das aus Tumorzellen und aus mit ihnen assoziierten „normalen“ Zelltypen, wie Fibroblasten, Endothelzellen und Makrophagen, den sogenannten Tumorstromazellen, besteht. Die Tumorstromazellen wurden von den Tumorzellen dahingehend konditioniert, dass sie das Tumorwachstum und -progression fördern. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung von zwei Oberflächenmolekülen, nämlich CD147 und CD28, für solche im Tumorstroma stattfindenden Interaktionen im syngenen murinen B16 Melanommodell untersucht. Rolle von CD147 für MMP Expression, Neoangiogenese und Metastasierung CD147, das von Tumorzellen exprimiert wird, wird als ein Faktor angesehen, der auf benachbarten Stromazellen die Expression von MMPs induziert. MMPs sind essentiell für den Umbau der extrazellulären Matrix und der Basalmembranen und somit für die Invasion und Metastasierung des Tumors essentiell. Daneben gibt es erste Hinweise, dass CD147 auch die Induktion von vascular endothelial growth factor (VEGF) vermittelt und damit die Tumorangiogenese fördert. In dem eingesetzten Melanommodell war überraschenderweise kein Unterschied hinsichtlich der Expression von MMP-2, MMP-9 und MT1-MMP in Abhängigkeit von der CD147 Expression nachweisbar. Die in vitro Kokultur der Melanomzellen mit unterschiedlichen murinen Fibroblasten zeigte zudem, dass weder CD147+ noch CD147- Melanomzellen die Expression von MMP-2 oder MMP-9 in den Fibroblasten veränderten. Als eindeutige Effekte des CD147 knock downs wurde aber eine reduzierte VEGF Expression in vivo einhergend mit einer gehemmten Tumorangiogenese, sowie einer reduzierten Metastasierung festgestellt. Es konnte somit die Funktion von CD147 in dem gewählten Modell als angiogenetischer, jedoch als MMP unabhängiger, Metastasierungsfaktor demonstriert werden. Einfluss von CD28 auf antitumorale Immunantworten CD28 ist ein kostimulatorisches Molekül, das zusammen mit dem TCR für eine effiziente Stimulation von T-Lymphozyten wesentlich ist. In CD28 k.o Mäusen fand sich im Vergleich zu Wildtyp Kontrolltieren eine verminderte Effektivität von prophylaktischen anti-Tumor Impfungen, die sich in einem beschleunigten Tumorwachstum sowie einer erhöhten Tumorlast auswirkten. Die Frequenz von Vakzine induzierten TRP-2180-188 /Kb reaktiven CD8+ T-Zellen in TIL von Tumoren war aber in beiden Genotypen gleich. Dagegen war die Anzahl IFN- produzierender TRP-2180-188 /Kb reaktiver T-Zellen sowie die Fähigkeit der TRP-2180-188 /Kb reaktiven T-Zellen zu lysieren, in den CD28-defizienten Mäusen deutlich geringer. Diese Beobachtungen legen nahe, dass CD28-vermittelte kostimulatorische Signale im gewählten Modell weniger für die initiale Expansion als für die Differenzierung funktioneller tumorspezifischer CD8+ T-Effektorzellen eine wesentliche Funktion einzunehmen scheinen. / Malignant tumors not only represent an accumulation of neoplastic cells but should be seen as a complex pseudoorgan, which consists on tumor cells and tumor-associated normal cell types, e.g. fibroblasts, endothelial cells and macrophages, the so-called tumorstroma cells. Tumorstroma cells were unprogrammed from tumor cells, facilitating both tumor growth and progression. In the present work, the significance of two cell surface molecules, CD147 and CD28, was investigated in a syngeneic melanoma model. Role of CD147 in MMP induction, neoangiogenesis and metastasis formation CD147, which is expressed by tumor cells, is regarded as a key factor, which induces the expression of MMPs in adjacent stroma cells. MMPs are essentiell for degradation of the extracellular matrix and basal membranes and consequently important for invasion and metastasis formation of tumors. Furthermore, there are some indices, that CD147 can mediate also the induction of vascular endothelial growth factor (VEGF) and therefore promote neoangiogenesis. In the B16 melanoma model, surprisingly no differences were detectable, regarding the expression of MMP-2, MMP-9 and MT1-MMP in dependence of CD147 expression. Co-culture of melanoma cells with different fibroblast cell lines demonstrated that neither CD147+ nor CD147- melanoma cells altered the expression of MMP-2 or MMP-9 in the fibroblasts. As distinct results of the CD147 knock down a reduced VEGF expression in vivo accompanied by inhibited angiogenesis as well as reduced metastasis was observed. Thus, in the used model, CD147 can be regarded as angiogenic, however, MMP independent metastasis formation factor. Influence of CD28 on anti-tumoral immune responses CD28 is a costimulatory molecule which is essential in conjunction with the TCR for efficient stimulation of T lymphocytes. In CD28 k.o. mice a reduced efficacy of prophylactic anti-tumor vaccinations, which resulted both in an accelerated tumor development and an increased tumor load compared with wildtyp mice was detected. The frequency of TRP-2180-188/Kb -reactive CD8+ T cells among TILs, however, was similar in both genotypes. In contrast, the number of IFN-γ -producing TRP-2180-188/Kb -reactive T cells and the efficiency of the TRP-2180-188/Kb -reactive T cells lysing target cells, was reduced in CD28-deficient mice. These results suggest that CD28-mediated costimulatory signals, at least in the used model of CD28 k.o. mice, seem to be less essential for the initial expansion than for the differentiation of functional tumor-specific CD8+ T-effector cells.

Metastasis is the cause of death in 90% of cancer-related deaths in men. Melanoma and Non-Small-Cell Lung Cancer (NSCLC) are both tumour types with poor prognosis, lacking appropriate therapeutic possibilities, not least because of their high rate of metastasis. Thus understanding the process of metastasis might unravel therapeutic targets for developing further therapeutic strategies. The generation of a transgenic mouse model expressing B-RafV600E in melanocytes, a mutation that is found in about 60% of all melanoma, would result in an ideal tool to study melanoma progression and metastasis. In this work, a doxycycline-inducible system was constructed for expression of B-RafV600E and transgenic animals were generated, but the expression system has to be improved, since this strategy didn’t give rise to any viable, transgene carrying mice. Furthermore, since it was shown in the work of others that the metastatic behavior of tumour cell lines could be reversed by an embryonic microenvironment and the influence of a tumourigenic microenvironment on melanocytes lead to the acquisition of tumour cell-like characteristics, the question arose, whether B-Raf is as important in melanocyte development as it is in melanoma progression. In this work, the embryonal melanocyte development in B-Raf-deficient and wildtype mouse embryos was examined and there were no differences observed in the localization and number of neural crest stem cells as well as in the localization of the dopachrome-tautomerase positive melanoblasts in the embryos and in cultured neural tube explants. The expression of oncogenic C-Raf in lung epithelial cells has yielded a model for NSCLC giving rise to adenomas lacking spontaneous progression or metastasis. The co-expression of c-Myc in the same cells accelerates the tumour development and gives rise to liver and lymphnode metastases. The expression of c-Myc alone in lung epithelial cells leads to late tumour development with incomplete penetrance. A mutation screen in this work resulted in the observation that a secondary mutation in KRas or LKB1 is necessary for tumour formation in the c-Myc single transgenic animals and suggested metastasis as an early event, since the corresponding metastases of the mutation-prone primary lung tumours were negative for the observed mutations. Furthermore, in this work it was shown that the expression of chicken c-Myc in a non-metastatic NSCLC cell line leads to metastatic clones, showing that c-Myc is sufficient to induce metastasis. Additionally a panel of metastasis markers was identified, that might serve as diagnostic markers in the future. / In 90% der Todesfälle aufgrund von Krebserkrankungen sind Metastasen für den Tod des Patienten verantwortlich. Sowohl Melanom, als auch nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom (Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC) sind beides Tumortypen, die eine schlechte Prognose haben und für die sich wenige Therapiemöglichkeiten bieten, nicht zuletzt aufgrund ihrer häufigen Metastasierung. Somit würde ein besseres Verständnis des Metastasierungsprozesses neue therapeutische Angriffspunkte aufdecken und damit die Möglichkeit zur Entwicklung neuer Therapieansätze bieten. Die Entwicklung eines transgenen Mausmodells, in dem B-RafV600E, eine Mutation die man in 60% der Melanompatienten findet, melanocyten-spezifisch exprimiert wird, würde ein geeignetes Werkzeug ergeben, um die Entstehung und die Metastasierung von Melanom zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Konstrukt zur Doxycyclin-abhängingen Expression von B-RafV600E erzeugt und mit diesem wurden transgene Tiere generiert. Da dieser Ansatz nicht zu lebensfähigen, das Transgen tragenden Linien führte, muss das Expressionssystem weiter verbessert werden. Da in der Arbeit von anderen gezeigt wurde, dass das metastasierende Verhalten von Tumor-Zelllinien durch eine embryonale Mikroumgebung aufgehoben werden konnte, und dass der Einfluss einer tumorähnlichen Mikroumgebung in Melanocyten zur Erlangung von Tumorzell-Charakteristika führte, kam die Frage auf, ob B-Raf eine ähnlich wichtige Rolle in der Entwicklung von Melanocyten wie in der Entstehung von Melanomen spielt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die embryonale Melanocytenentwicklung in B-Raf-defizienten sowie in wildtypischen Mausembryonen untersucht. Es konnten keine Unterschiede in der Lokalisation und Anzahl von Stammzellen des Neuralrohres und in der Lokalisation von Dopachrome-tautomerase positiven Melanoblasten in den Embryonen und in kultivierten Explantaten des Neuralrohres festgestellt werden. Die Expression von oncogenem C-Raf in Lungenepithelzellen von Mäusen ist ein Modell für NSCLC und führt zur Ausbildung von Adenomen ohne spontane Weiterentwicklung oder Metastasen. Die Koexpression von C-Raf mit c-Myc in denselben Zellen beschleunigt die Entwicklung von Tumoren und führt zu Metastasen in Leber und Lymphknoten. Die Expression von c-Myc alleine in Lungenepithelzellen führt zu einer verspäteten Entwicklung von Tumoren mit nicht vollständiger Penetranz. Ein Screening für Mutation im Rahmen dieser Arbeit führte zu der Beobachtung, dass Sekundärmutationen in KRas oder LKB1 für die Tumorentwicklung in den c-Myc transgenen Tieren notwendig sind und dass die Metastasierung ein frühes Ereignis zu seien scheint, da die zugehörigen Metastasen in Leber und Lymphknoten im Gegensatz zum Primärtumor in der Lunge keine Mutationen in diesen Genen trugen. Desweiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die Expression von avianem c-Myc in einer nicht-metastasierenden NSCLC Zelllinie zu metastasierenden Klonen führte, was zeigt, dass c-Myc ausreichend ist um Metastasierung auszulösen. Zusätzlich wurde eine Reihe von Markern für Metastasen identifiziert, die in Zukunft als diagnostische Marker Verwendung finden könnten.

Die vorliegende Arbeit zeigt eine Möglichkeit auf, die bisher meist erfolglose Chemotherapie des malignen Melanoms zu verbessern: Durch Inhibition des Transkriptionsfaktors NF-kB, der für die Regulation vieler tumorrelevanter Gene verantwortlich ist, konnten die Tumorzellen gegenüber der Wirkung von Zytostatika sensibilisiert werden. Zunächst wurden acht verschiedene Melanomzellen in Bezug auf ihre NF-kB-Aktivität und der Expression NF-kB-regulierter Proteine vergleichen. Es konnte gezeigt werden, dass die Mehrzahl der Melanomzellen über konstitutive Aktivität von NF-κB verfügt. Dabei bestand kein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Expression NF-kB-regulierter Proteine und der Aktivität dieses Transkriptionsfaktors im Kern, was komplexe Regulationsmechanismen bei der Transkription und Translation vermuten lässt. Anhand einer ausgewählten Melanomzelllinie konnte gezeigt werden, dass zwei verschiedene NF-kB-Inhibitoren, der Proteasom-Inhibitor Bortezomib und der neue IKK-Inhibitor KINK-1 die Aktivität von NF-kB deutlich hemmen. Beim Vergleich beider NF-kB-Inhibitoren ließen sich unerwartet verschiedene molekulare Wirkungsmechanismen nachweisen: Während Bortezomib konzentrationsabhängig eine sehr starke Induktion von NOXA, eine Induktion von p53 sowie eine Abnahme von Cyclin D1 bewirkte, zeigte KINK-1 seine Effekte vor allem in der Reduktion von Chemokinen wie IL-8 und MCP-1. Passend zur Veränderung der Expression zellzyklus-relevanter Proteine hatte Bortezomib einen stärkeren Effekt auf den Zellzyklus als KINK-1. Beide Inhibitoren wurden mit verschiedenen Zytostatika kombiniert und konnten einerseits die Apoptoseinduktion durch Zytostatika verstärken und andererseits die durch Zytostatika reduzierte Invasion weiter reduzieren. Allerdings zeigte sich bei der Untersuchung tumorrelevanter Chemokine, dass KINK-1 im Gegensatz zu Bortezomib synergistische Effekte mit Camptothecin und Doxorubicin aufweist. Trotz molekularer Unterschiede bewirkten beide NF-kB-Inhibitoren vergleichbare funktionelle Effekte auf zellulärer Ebene. Dies galt auch für ein präklinisches in-vivo-Modell, in dem die experimentelle Lungenmetastasierung von B16F10-Melanomzellen in Mäusen ermittelt wurde: Hier wurden die Mäuse mit Camptothecin, KINK-1 und Bortezomib allein im Vergleich zu den jeweiligen Kombinationen aus Zytostatikum und NF-kB-Inhibitor behandelt. Beide Kombinationen zeigten eine signifikante Reduktion des Lungengewichts im Vergleich zu Camptothecin allein. Diese Arbeit konnte also den Nutzen aus NF-kB-Inhibition in Kombination mit Zytostatika für die hier verwendeten Substanzen bekräftigen und dabei einige molekulare Unterschiede aufdecken. / Metastasized melanoma is almost resistant to chemotherapie. Constitutive or drug-induced upregulation of NF-kB is one reason for this chemoresistance. That's why inhibition of NF-kB may increase susceptibility to cytostatic drugs. Here, two different mechanisms of NF-kB-inhibition, proteasome inhibition by bortezomib and IkB kinase-beta (IKKbeta) inhibition by the kinase inhibitor of NF-kB-1 (KINK-1) are examined in their antitumoral efficacy and combined with camptothecin. When combined with camptothecin, either of the two NF-kB-inhibiting principles synergistically increased apoptosis and decreased invasion in vitro. In addition, when C57BL/6 mice were intravenously injected with B16F10 melanoma cells, the combination of camptothecin and either of the two compounds (bortezomib and KINK-1) significantly reduced pulmonary metastasis compared to either mono-treatment. However, molecular analysis revealed different mechanisms of the two NF-kB-inhibitors, resulting in the same functional effect. This study shows tow principles of NF-kB-inhibition that successfully augment susceptibility to cytostatic drugs in malignant melanoma.

Cancer cell invasion and metastasis are hallmarks of cancer. It is becoming apparent that the interaction between cancer cells and the surrounding microenvironment are involved in their ability to invade and metastasise. In general, cancer cells can either migrate individually, in an amoeboid or mesenchymal manner, or collectively. The first aim of this thesis was to analyse the role of NG2 in amoeboid to mesenchymal transition (AMT) and Rho/ROCK signalling. We found that NG2 promotes an amoeboid morphology, and increased invasiveness, in a Rho-dependent manner. Secondly, we analysed the role of the major tumour microenvironment (TME) component, cancer-associated fibroblasts (CAFs), on melanoma cell invasiveness. We found the CAF interaction with melanoma cells leads to increased levels of interleukin-6 (IL-6) and IL-8, and this leads to increased invasiveness. Simultaneous blocking of IL-6 and IL-8, using neutralising antibodies, inhibits CAF-dependent invasion. Further analysis of another major component in the melanoma TME, keratinocytes, has highlighted the importance of the tumour cell niche in invasion. Our results indicate that cancer cells have the ability to change morphology, and that the TME plays an important role in melanoma cell invasiveness. Metastatic melanoma treatment has proven...

Das maligne Melanom ist ein Hauttumor mit steigender Inzidenz und hohen Mortalitätsraten. Da die molekularbiologischen Ereignisse, die der Melanomentwicklung zugrundeliegen, nur unzureichend bekannt sind, gibt es kaum spezifische Therapieansätze. Zur Untersuchung der Melanomentwicklung eignet sich das Xiphophorus-Modell. In diesem System ist die Anwesenheit der RTK Xmrk ausreichend, um durch Aktivierung proliferativer und entdifferenzierender Signalwege und Apoptoseinhibition Melanome zu verursachen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Xmrk auch die Migration der Melanozytenzellinie Melan a-Hm induzieren kann. Die Migration der durch Xmrk transformierten Zellen ist amöboid und unabhängig von MAPK- und PI3K-Signalwegen. Eine Funktion bei der Migration haben jedoch die Kinasen FAK und Fyn. Sie bilden möglicherweise einen Proteinkomplex, der für FAK und Src aus zahlreichen anderen Systemen bekannt ist und als Signalplattform für die Zellmigration fungiert. Diese Erkenntnisse können dazu beitragen, das Xiphophorus-Modell weiterzuentwickeln und die Grundlagen der Melanomgenese besser zu verstehen. / Malignant melanoma is a tumor of the skin with increasing incidence and high mortality rates. As the biomolecular events underlying melanoma development are poorly understood, specific therapeutics for this disease are few. The Xiphophorus system is suitable for studying melanoma development. In this model, presence of the RTK Xmrk is sufficient to initiate melanoma formation by activating proliferative and anti-apoptotic pathways and interfering with differentiation. This work demonstrates that Xmrk is also able to induce migration of the melanocytic cell line Melan a-Hm. Cells transformed by Xmrk migrate in amoeboid fashion, independently of MAPK or PI3K pathways. However, kinases FAK and Fyn are involved in Melan a-Hm migration, possibly as a signal-integrating protein complex similar to the role that has been described for FAK and Src in various systems. The results from this work serve to extend the Xiphophorus model to other aspects of melanoma development and may help to better understand the molecular basis of melanoma.

The Xiphophorus melanoma system is a useful animal model for the study of the genetic basis of tumor formation. The development of hereditary melanomas in interspecific hybrids of Xiphophorus is connected to pigment cell specific overexpression of the mutationally activated receptor tyrosine kinase Xmrk. In purebred fish the oncogenic function of xmrk is suppressed by the molecularly still unidentified locus R. The xmrk oncogene was generated by a gene duplication event from the Xiphophorus egfrb gene and thereby has acquired a new 5’ regulatory sequence, which has probably altered the transcriptional control of the oncogene. So far, the xmrk promoter region was still poorly characterized and the molecular mechanism by which R controls xmrk-induced melanoma formation in Xiphophorus still remained to be elucidated. To test the hypothesis that R controls melanoma development in Xiphophorus on the transcriptional level, the first aim of the thesis was to gain a deeper insight into the transcriptional regulation of the xmrk oncogene. To this end, a quantitative analysis of xmrk transcript levels in different Xiphophorus genotypes carrying either the highly tumorigenic xmrkB or the non-tumorigenic xmrkA allele was performed. I was able to demonstrate that expression of the tumorigenic xmrkB allele is strongly increased in malignant melanomas of R-free backcross hybrids compared to benign lesions, macromelanophore spots, and healthy skin. The expression level of the non-tumorigenic xmrkA allele, in contrast, is not influenced by the presence or absence of R. These findings strongly indicate that differential transcriptional regulation of the xmrk promoter triggers the tumorigenic potential of these xmrk alleles. To functionally characterize the xmrk promoter region, I established a luciferase assay using BAC clones containing the genomic regions where xmrk and egfrb are located for generation of reporter constructs. This approach showed for the first time a melanoma cell specific transcriptional activation of xmrkB by its flanking regions, thereby providing the first functional evidence that the xmrk oncogene is controlled by a pigment cell specific promoter region. Subsequent analysis of different deletion constructs of the xmrkB BAC reporter construct strongly indicated that the regulatory elements responsible for the tumor-inducing overexpression of xmrkB in melanoma cells are located within 67 kb upstream of the xmrk oncogene. Taken together, these data indicate that melanoma formation in Xiphophorus is regulated by a tight transcriptional control of the xmrk oncogene and that the R locus acts through this mechanism. As the identification of the R-encoded gene(s) is necessary to fully understand how melanoma formation in Xiphophorus is regulated, I furthermore searched for alternative R candidate genes in this study. To this end, three genes, which are located in the genomic region where R has been mapped, were evaluated for their potential to be a crucial constituent of the regulator locus R. Among these genes, I identified pdcd4a, the ortholog of the human tumor suppressor gene PDCD4, as promising new candidate, because this gene showed the expression pattern expected from the crucial tumor suppressor gene encoded at the R locus. / Fische der Gattung Xiphophorus sind ein gut etabliertes Modellsystem zur Analyse der genetischen Grundlagen der Tumorentwicklung. Die Entwicklung hereditärer Melanome in bestimmten interspezifischen Xiphophorus-Hybriden wird durch die pigmentzellspezifische Überexpression des Onkogens xmrk ausgelöst. Dieses Gen codiert für eine durch Mutationen aktivierte Rezeptortyrosinkinase. In den reinerbigen Elterntieren wird die onkogene Funktion von xmrk durch den Regulator-Locus R unterdrückt, welcher jedoch auf molekularer Ebene noch nicht identifiziert wurde. Das Onkogen xmrk ist durch eine Genduplikation aus dem Protoonkogen egfrb entstanden und hat dabei eine neue regulatorische 5‘ Region erhalten, welche mit hoher Wahrscheinlichkeit die transkriptionelle Regulation des Onkogens verändert hat. Die Promotorregion von xmrk war allerdings bisher nur unzureichend charakterisiert und der molekulare Mechanismus, durch den der R-Locus die xmrk-induzierte Melanomentwicklung kontrolliert, war noch weitgehend unbekannt. Um zu analysieren, ob der R-Locus die Melanomentwicklung in Xiphophorus auf transkriptioneller Ebene kontrolliert, war das erste Ziel dieser Arbeit die transkriptionelle Regulation des xmrk Onkogens genauer zu untersuchen. Zu diesem Zweck habe ich eine quantitative Analyse der xmrk Expressionslevel in Geweben verschiedener Xiphophorus-Genotypen durchgeführt, welche entweder das stark tumorigene xmrkB oder das nicht tumorigene xmrkA Allel besitzen. Ich konnte zeigen, dass im Vergleich zu benignen Läsionen, Macromelanophoren und gesunder Haut, die Expression des tumorigenen xmrkB Allels in den malignen Melanomen der R-defizienten Rückkreuzungshybride stark erhöht ist. Das Expressionslevel des xmrkA Allels wird hingegen nicht durch den R-Locus beeinflusst. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass eine differenzielle transkriptionelle Regulierung des xmrk Promotors für die Unterschiede im onkogenen Potential dieser Allele verantwortlich ist. Um die xmrk Promotorregion funktional zu charakterisieren, habe ich in der hier vorliegenden Studie einen Luciferase-Assay etabliert, für den BAC-Klone, welche die xmrk- oder egfrb-Region enthalten, zur Herstellung von Reporterkonstrukten verwendet wurden. Mit Hilfe dieses Ansatzes konnte ich zum ersten Mal eine melanomzellspezifische Aktivierung des xmrkB Gens durch seine regulatorischen Regionen zeigen. Dies liefert den ersten funktionalen Beweis, dass das xmrk Onkogen tatsächlich durch einen pigmentzellspezifischen Promotor kontrolliert wird. Durch die nachfolgende Analyse einer Deletionsserie des xmrkB Reporterkonstrukts konnte gezeigt werden, dass die regulatorischen Elemente, welche die starke Überexpression von xmrk in Melanomzellen steuern, in den proximalen 67 kb der xmrk 5‘ Region lokalisiert sind. Zusammengefasst deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Melanomentwicklung in Xiphophorus durch eine strikte transkriptionelle Kontrolle des xmrk Onkogens reguliert wird und dass der Regulator-Locus R seine tumorsuppressive Funktion über diesen Mechanismus ausübt. Da die Identifizierung des R-Locus-Gens entscheidend ist, um die Melanomentwicklung in Xiphophorus vollständig zu verstehen, habe ich im zweiten Teil dieser Arbeit drei Gene, welche in derselben genomischen Region liegen in der R lokalisiert wurde, genauer untersucht, um zu testen, ob es sich bei einem dieser Gene um eine entscheidende tumorsuppressive Komponente des R-Locus handelt. Von diesen Genen wurde pdcd4a, welches das Ortholog zum humanen Tumorsuppressorgen PDCD4 ist, als vielversprechendes neues Kandidatengen identifiziert, da das Expressionsmuster von pdcd4a mit dem zu erwartenden Expressionsmuster des am R-Locus codierten Tumorsuppressorgens übereinstimmt.

Staging is critical in the management of cancer. Sentinel lymph node (SLN) biopsy is one method used in the assessment of cancer spread. SLN procedures are standard practice in the management of some cancers although; these procedures have only recently been developed and refined. SLN procedures are commonly used in the management of melanomas and breast cancers in patients with no evidence of metastatic disease on clinical exam. SLN procedures include detection, localization, and assessment of SLNs. The detection/localization components vary in technique and rates of success. The procedures with the least number of detection/localization techniques generally include the use of blue dye or the use of a radiotracer with intraoperative gamma counting. The most complex procedures involve the use of blue dye, the use of a radiotracer with preoperative gamma imaging and preoperative gamma counting, intraoperative gamma counting, or some combination of these techniques. The ideal procedure for SLN would include all the listed techniques however; all facilities do not incorporate the most complete procedure, for different reasons. An investigation using a small FOV (5 in x 5 in) gamma camera intraoperatively for SLN procedures in melanoma and breast cancer patients was performed. A smaller FOV camera is capable of obtaining some of the same information as a conventional gamma camera. It is possible that centers, which do not or are not able to take advantage of preoperative imaging, may find the use of a smaller FOV gamma camera in the operating room useful. The investigation consisted of a total of 41 patients; it was split into two studies, Study 1: melanoma and study 2: breast cancer. The melanoma study found the added use of a smaller FOV camera under the parameters of this study to be minimal. Study 2 was broken into two branches; branch 1: camera/probe/dye and branch 2: probe/dye, for a comparison study. Comparing the two branches did not show the smaller FOV camera to reduce the time spent in the operating room versus using the probe and blue dye.

Konstitutiv aktivierte Signalwege sind verantwortlich für die malignen Veränderungen in Melanozyten, die zur Entstehung des Melanoms beitragen. Im Mittelpunkt dieser Veränderungen stehen der PI3Kinase-AKT-Signalweg und der MAPK-ERK-Signalweg als wichtige Schlüsselwege in der Zellzykluskontrolle. Daher zielen viele neue Therapieversuche im Kampf gegen das Melanom auf die Kontrolle und Regulation dieser Wege. In dieser vorliegenden Arbeit wurden erstmals die Effekte eines neuen PI3K-Inhibitors, BAY-80-6946, und Wortmannin alleine und in Kombinationsbehandlungen mit den MEK1/2-Inhibitoren PD98059 und U0126 in vitro und in vivo untersucht. Zunächst wurden humane Melanomzellen auf konstitutiv aktivierte Signalwege in vitro per Western Blot untersucht und ihre Wachstumsraten im Mausmodell ermittelt. Die humane Melanomzelllinie LOX zeigte eine hohe konstitutive Expression von aktiviertem AKT und ERK, während A375 nur eine geringe Aktivität dieser beiden Signalwege aufwies. Dennoch besaßen diese beiden Zelllinien ein großes Wachstumspotential im Mausmodell im Vergleich zu anderen getesteten Zelllinien. A375 und LOX wurden in Zellkulturexperimenten mit den PI3Kinase-Inhibitoren Bay-80-6946 und Wortmannin sowie den MEK1/2-Inhibitoren PD98059 und U0126 behandelt und Tumor-relevante Zellfunktionen wie Proliferation und Apoptose gemessen. Die Zelllinien zeigten ein unterschiedliches Ansprechen auf die verschiedenen Inhibitoren und keine der Behandlungen wies eine zufriedenstellendes Ergebnis hinsichtlich der Anti-tumoralen Funktion auf. Bei dualer PI3Kinase- und MEK1/2-Hemmung zeigten sich jedoch deutliche synergistische Effekte, so dass diese Behandlungsform einen vielversprechenden Ansatz im Kampf gegen das Melanom darstellt.