Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology and toxicology Student: Lucie Rozkydalová Supervisor of Diploma thesis: Prof. PharmDr. František Štaud, PhD. Specialized supervisor: Pr. Pierre Cuq PharmD. PhD., Laure-Anaïs Vincent Title of diploma thesis: Differential resistance of melanoma to vinca-alkaloids Malignant melanoma (MM) represents the most dangerous and very aggressive skin tumor with fast development of drug resistance which is the main obstacle in successful treatment of MM. According to previous studies (microarray data analysis), KIT gene, which plays key role in melanoma pathophysiology, was chosen as one of the potential causes of failure of treatment by vinca alkaloids (VAs) because of its complete underexpression in melanoma CAL1 resistant cells (CAL1R-VAs) in comparison with parental cells (CAL1-wt). Moreover, KIT also interacted with NF-κB and cyclin D1-2 proteins involved in chemoresistance of melanoma - inside molecular network built using IPA software. Although KIT underexpression in resistant CAL1 R-VAs cell lines were confirmed (qRTPCR), KIT repression using specific siRNA transfection did not show any effect on in vitro sensibility of CAL1-wt cells to VAs. It signifies that KIT is not directly involved in melanoma resistance...

Melanome stellen die gefährlichste Form von Hautkrebs mit der höchsten Mortalitätsrate dar. Der Transformation normaler Melanozyten zu malignen Melanomen liegen komplexe molekulare und biochemische Veränderungen zu Grunde. Im Xiphophorus-Melanom-Modell ist die onkogene Rezeptortyrosinkinase "Xiphophorus melanoma receptor kinase" (Xmrk) der alleinige Auslöser der Melanominitiation und -progression. Die Aufklärung der Xmrk-vermittelten Signaltransduktion kann zum besseren Verständnis von Ereignissen, die auch bei der humanen Melanomentwicklung eine Rolle spielen, beitragen. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe der Microarray-Technologie die Regulation der Genexpression durch Xmrk analysiert. Zu den nach Rezeptoraktivierung am stärksten herabregulierten Genen gehörten "son of sevenless homolog 1" (Sos1) und "ubiquitin-conjugating enzyme E2I" (Ube2i); stark hochreguliert waren "early growth response 1" (Egr1), "cysteine-rich protein 61" (Cyr61), "dual-specificity phosphatase 4" (Dusp4), "fos-like antigen 1" (Fosl1), "epithelial membrane protein" (Emp1), Osteopontin (Opn), "insulin-like growth factor binding protein 3" (Igfbp3) und "tumor-associated antigen L6" (Taal6). Die für die Regulation dieser Gene verantwortlichen Signalwege wurden durch die Anwendung von niedermolekularen Inhibitoren und siRNA identifiziert, wobei für die SRC-Kinase FYN eine zentrale Bedeutung bei der Xmrk-abhängigen Regulation der Genexpression festgestellt wurde. Darüber hinaus wurde die Expression der Gene in humanen Melanomzelllinien im Vergleich zu normalen humanen Melanozyten untersucht. Als besonders vielversprechende Kandidaten stellten sich dabei DUSP4 und TAAL6 heraus, deren Rolle in der humanen Melanominduktion und -progression Gegenstand zukünftiger Studien sein wird. In einem anderen Ansatz zur Aufklärung des Signalnetzwerkes sollten Zielproteine von Xmrk durch Protein-Protein-Interaktionsstudien mit Hilfe des Split-Ubiquitin-Systems ermittelt werden. Aufgrund ungünstiger Expressions- oder Faltungseigenschaften von Xmrk in diesem System war es aber nicht möglich, den Rezeptor als Köderprotein einzusetzen. Das für die Xmrk-vermittelte Melanomentstehung zentrale Protein FYN konnte jedoch als Köder etabliert und seine Wechselwirkung mit der Tyrosinkinase FAK analysiert werden. Es wurde gezeigt, dass der phosphorylierte Tyrosinrest an Position 397 von FAK für die Interaktion einer N-terminal trunkierten FAK-Variante mit FYN notwendig ist und dass diese Phosphorylierung in Hefe gewährleistet zu sein scheint. Die Suche nach neuen Interaktionspartnern von FYN mittels der Split-Ubiquitin-Technologie könnte Einblicke in weitere FYN-abhängige Ereignisse bieten, die zur Aufklärung seiner zentralen Rolle bei der Tumorentstehung dienen könnte. / Melanoma is the most aggressive type of skin cancer with the highest mortality rate. The transformation of melanocytes to malignant melanoma is based on complex molecular and biochemical alterations. In the Xiphophorus melanoma model, the oncogenic receptor tyrosine kinase Xiphophorus melanoma receptor kinase (Xmrk) is the sole trigger of melanoma initiation and progression. Elucidating Xmrk-dependent signaling pathways may contribute to a better understanding of processes that play a role in human melanomagenesis, too. Here, the regulation of gene expression by Xmrk was analyzed using a microarray approach. The genes with the strongest down-regulation in response to receptor activation included son of sevenless homolog 1 (Sos1) and ubiquitin-conjugating enzyme E2I (Ube2i), whereas early growth response 1 (Egr1), cysteine-rich protein 61 (Cyr61), dual-specificity phosphatase 4 (Dusp4), fos-like antigen 1 (Fosl1), epithelial membrane protein (Emp1), Osteopontin (Opn), insulin-like growth factor binding protein 3 (Igfbp3), and tumor-associated antigen L6 (Taal6) were strongly up-regulated. The pathways regulating expression of these genes were identified by applying small molecule inhibitors and siRNA. Interestingly, the SRC-family kinase FYN was found to be a key-player in Xmrk-dependent gene regulation. Furthermore, expression of the genes in human melanoma cell lines compared to normal human melanocytes was investigated. The most promising candidates, which might be important for melanoma induction and progression, were DUSP4 and TAAL6. Their potential suitability as diagnostic and prognostic melanoma markers will be addressed in future studies. In addition to gene expression analysis, protein-protein interactions were to be assayed by the split-ubiquitin-system in order to identify novel Xmrk targets. Unfortunately, inappropriate expression or folding of the receptor in this system precluded it from working as bait. However, the FYN protein, which has a central role in Xmrk-mediated signaling, was established as bait and its association with FAK was analyzed in more detail. A phosphorylated tyrosine residue at position 397 of FAK was demonstrated to be necessary for the interaction of an N-terminally truncated FAK variant with FYN, and this phosphorylation event seems to be feasible in yeast. In future, a split-ubiquitin based screen for novel interaction partners of FYN might provide insights into FYN-dependent processes and help to understand its central role in tumor development.

Das translationell kontrollierte Tumorprotein (TCTP) ist ein hochkonserviertes, ubiquitär in Eukaryonten vorkommendes Protein. Seine Bezeichnung geht auf die erstmalige Beschreibung in Tumorzellen zurück und weist zugleich auf seine besondere translationelle Regulation hin. Das zugehörige Gen wird als TPT1 bezeichnet und befindet sich beim Menschen auf dem langen Arm des Chromosom 13. Eine pathophysiologische Bedeutung für TCTP wurde bei Tumorerkrankungen, Erkrankungen des allergischen Formenkreises sowie bei Infektionen durch Parasiten beschrieben. Für diese Arbeit wurde zur Untersuchung grundlegender Regulationsphänomene die TCTP-mRNA des Kaninchens als geeignetes Modell ausgewählt. Es wurden die volllangen TCTP-mRNA1 und 2, die sich in der Länge ihrer 3'UTR unterscheiden, sowie Deletionsvarianten, denen die UTR-Abschnitte fehlen, kloniert. In Proteinbindungsstudien (Electromobility Shift Assays, UV-Crosslinking-Experimente, RNA-Affinitätschromatographie) wurden potentielle Bindungsfaktoren der TCTP-UTRs analysiert. Die an der mRNA des Kaninchens erarbeiteten Ergebnisse wurden durch Untersuchungen an humanen Melanomzellen ergänzt. In in vitro Translationsexperimenten wurde gezeigt, dass die Regulation der TCTP-mRNA durch ihre 5'UTR und 3'UTR2 vermittelt wird. In RNA-Bindungsstudien konnte eine Reihe potentieller Bindungsfaktoren der UTRs charakterisiert werden. Bei Verwendung von Extrakten aus verschiedenen Kaninchengeweben zeigten sich deutliche gewebsspezifische Unterschiede. Frühere Untersuchungen hatten gezeigt, dass es in der Melanomzelllinie MeWo bei der Ausbildung einer Chemoresistenz zu einer Expressionssteigerung des TCTP kommt. In einem ersten Schritt wurde der Beitrag von Transkription und Translation in vergleichenden Northern und Western Blot Analysen untersucht. Auf mRNA-Niveau findet man in den resistenten Zellen eine deutliche Steigerung der Expression im Vergleich zu den sensiblen Zellen. Der mRNA-Menge in den chemosensiblen Zellen steht eine vergleichsweise geringe Menge an Protein gegenüber. Folglich liegt die mRNA in diesen Zellen in einem inaktiven Zustand vor. Es konnten drei Cytoskelettproteine gamma-Actin, beta-Tubulin und alpha-Actinin als Bindungspartner der TCTP-3'UTR in den Melanomzellen identifiziert werden. Eine Bedeutung von TCTP für die Entstehung der Chemoresistenz lässt sich aufgrund seiner anti-apoptotischen Wirkung vermuten. Die Regulation der TCTP-Translation stellt bei durch Cytostatika hervorgerufener Hemmung der Transkription einen wichtigen Pathomechanismus in chemoresistenten Melanomzellen dar. / The translationally controlled tumor protein (TCTP) is a highly conserved protein expressed in all eukaryotic organisms. It was first described in tumor cells showing a special regulation of translation. The chromosomal localisation of the respective human gene TPT1 has been determined (13q14). TCTP has been implicated in cellular processes such as cell growth and apoptosis. Its medical importance has been shown in malignant transformation, allergic reactions and immunity against parasitic organisms. In order to investigate basic mechanisms of translational regulation the rabbit TCTP-mRNA was chosen due to its high homology to its human counterpart. The TPT1 gene is transcribed into two TCTP-mRNAs differing in the length of their 3'untranslated regions. These two mRNAs and variants missing the untranslated regions were cloned into expression vectors. In Electro mobility shift assays, UV-crosslinking assays and RNA affinity purification several TCTP-mRNA binding factors were characterised. Furthermore, the role of TCTP in human chemoresistant melanoma cells was investigated. In cell-free translation assays the importance of the 5'UTR and 3'UTR2 was shown. However, in wheat germ extracts the regulation of the TCTP-mRNA mediated by its 5'UTR is less important. In Electro mobility shift assays and UV-crosslinking assays with radiolabelled transcripts of the untranslated regions great variations in tissue-specific protein binding were found. Recently, TCTP had been implicated in the development of chemoresistance in the human melanoma cell line MeWo. As a first step, the contribution of transcriptional and translational regulation was analysed by comparing TCTP-expression in Northern and Western blot assays. Transcription of the TPT1 gene is increased in chemoresistant melanoma cells whereas translation is inhibited in those cells susceptible to chemotherapeutic agents. Three proteins, gamma-actin, beta-tubulin and alpha-actinin, were identified as factors binding to the TCTP-3'UTR in melanoma cells. For the interaction of these cytoskeleton components their ability to bind intracellular calcium ions could be of great importance. The role of TCTP in the development of chemoresistance can be explained by its anti-apoptotic function. In conclusion, the regulation of TCTP-translation when transcription is blocked by inhibitors of DNA-function is an important mechanism to overcome the effect of these anti-proliferative agents.

Solen utstrålar energi och är förutsättningen för allt biologiskt liv på jorden, dessvärre tycks människan sakna respekt gentemot solen och dess ultravioletta strålning. Dessa strålar kan ge upphov till malignt melanom som är den aggressiva formen av hudcancer. Sjukdomen uppkommer i vanliga leverfläckar eller födelsemärken men den kan också börja direkt i huden. Via lymfkärl och blodkärl kan cancercellerna sprida sig till andra ställen i kroppen så kallad metastasering. Detta innebär att malignt melanom är en allvarlig och livshotande sjukdom. Problemet är att omkring 2 000 personer i Sverige drabbas varje år och är en av de vanligaste cancerformerna i Sverige. Syftet är att beskriva upplevelsen av att leva med malignt melanom utifrån patientens livsvärldsperspektiv. Metoden bygger på en litteraturstudie bygd på åtta kvalitativa artiklar som analyserats enligt Evans (2003) analysmodell. Resultatet visar att patienterna upplevde någon grad av chock, rädsla och oro i samband med diagnosen. Det framkom även i resultatet att en del patienter förnekade sin sjukdom och att flertalet, trots den traumatiska upplevelsen, fick en förändrad positiv livssyn efter tillfrisknade. / <p>Program: Sjuksköterskeutbildning</p><p>Uppsatsnivå: C</p>

Ziel dieser Arbeit ist es ein besseres Verständinis der molekularen Prozesse der Melanomentstehung und Tumorprogression zu gewinnen. Hierfür wurde ein Tiermodell transgener Medakas (Oryzias latipes) verwendet, welche als stabiles Transgen das Konstrukt mitf::xmrk besitzen. Diese Fische entwickelten Pigmentzelltumore, welche für eine Microarrayanalyse herangezogen wurden. Aus diesem Microarraydatensatz wurden 11 Gene ausgewählt, welche in dieser Arbeit näher untersucht wurden. Beobachtungen haben ergeben, dass sich bei transgenen Medakas, welche Xmrk exprimieren, verschiedene pigmentierte Hauttumore entwickeln. Diese Tumore wurden je nach ihrem verschiedenen Histiotyp klassifiziert und untersucht. Um einen Eindruck zu gewinnen, wie Xmrk die Transkription verschiedener Gene, welche in der Krebsentstehung und –progression eine wichtige Rolle spielen, beeinflusst, wurden pigmentierte Hauttumore transgener Medakas, so wie zu Vergleichszwecken hyperpigmentierte Haut transgener Medakas und Lymphome und gesunde Organe von Wildtyp-Medakas, untersucht. Mit Hilfe von Real-time-PCR’s wurden die folgenden Gene untersucht: G6PC, GAMT, GM2A, MAPK3, NID1, SLC24A5, SPP1, PDIA4, RASL11B, TACC2 und ZFAND5. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Expression der Gene GM2A, MAPK3, NID1, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 von Xmrk beeinflusst wird, während dies für die Gene G6PC, GAMT, SPP1 und TACC2 nicht zutrifft. Im Vergleich zu gesunder Haut werden GM2A, MAPK3, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 in Tumoren höher exprimiert. Die Gene G6PC, GAMT, NID1, SPP1 und TACC2 werden dagegen verglichen mit gesunder Haut unverändert oder niedriger exprimiert. Die Bedeutung der erhöhten Genexpression lässt sich in vielen Fällen zurzeit nur theoretisch erfassen. Eine höhere Expression von SLC24A5 beispielsweise lässt vermuten, dass ein Zusammenhang zwischen der Melaninproduktion und der Zellproliferation besteht. Die Überexpression von GM2A weist dagegen auf eine Rolle von GM2A als Tumormarker hin. Dahingegen scheint die erniedrigte Expression von GAMT und G6PC Auskunft über den veränderten Stoffwechsel in Tumoren zu geben. Um diese Ergebnisse zu bestätigen und zu entschlüsseln wie genau Xmrk die Expression der getesteten Gene beeinflusst, sind allerdings noch weitere funktionelle Studien nötig. Generell kommt man zu dem Schluss, dass die Genexpression sich in jedem Tumor unterscheidet. Daher scheint jeder Tumor seinen eigenen Evolutionsweg zu beschreiten. / Target of this work is to get a better understanding in melanomagenesis and tumorprogression. Therefore a model of transgenic medakas (Oryzias latipes) was used, wich had the construct mitf::Xmrk as a stable, integrated transgen. Those fishes developed pigmentcelltumors that, wich where used in a microarrayanalysis. Of the results of this microarray 11 genes where chosen and analysed in this study. Those transgenic medakas which got xmrk injected, but without a tumorsuppresorgen, developed various pigmented kinds of skin cancer. Those tumors were analysed equally to their histiotyps. To get an idea, how Xmrk effects the transcription of several genes, which play an important role in tumor development and progression, pigmented skin cancer of transgenic medakas and for comparison, hyper pigmented skin of transgenic medakas and also lymphoma and healthy organs where tested. The following genes where tested by real-time-PCR: G6PC, GAMT, GM2A, MAPK3, NID1, SLC24A5, SPP1, PDIA4, RASL11B, TACC2 and ZFAND5. It was noticed that the expression of the genes GM2A, MAPK3, NID1, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 gets modified by Xmrk. In contrast the genes G6PC, GAMT, SPP1 and TACC2 didn't. In comparison to healthy skin GM2A, MAPK3, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 and ZFAND5 got higher expressed in tumors. Indeed the expression level of the genes G6PC, GAMT, NID1, SPP1 and TACC2 is the same or even lower than in healthy skin. The meaning of the higher gen expression can currently just be theoretically conceived. The higher expression of SLC24A5 for example leads to guess that there is a link between the production of melanin and cell proliferation. The overexpression of GM2A shows that GM2A plays maybe a role as an tumor marker. However the lower expression of G6PC and GAMT gets references about the metabolism in cancer. To fix this results and get an better understanding how Xmrk affects the expression of this genes, additional funktional studies are necessary. The result is that gene expression differs in each tumor. A common conclusion is not possible. It appears that each tumor goes its own evolutionary way.

Melanome zählen zu den zehn häufigsten Tumorentitäten weltweit. Bei frühzeitiger Diagnose ist eine Exzision im Gesunden kurativ. Sobald eine Resektion im Gesunden jedoch nicht mehr möglich ist, sinken die Heilungschancen drastisch. Maligne Melanome sprechen wenig auf konventionelle Tumortherapien wie Radiatio und zytostatische Chemotherapie an. Daher werden neue Therapieoptionen in der Melanomtherapie getestet. Neueste Ansätze beziehen sich auf die Modulation von Immunzellen mittels monoklonaler Antikörper sowie die Modifikation der Signaltransduktion über die Mitogen-aktivierte Protein Kinase Kinase (MAPKK = MEK), BRAF und c-KIT. Auch Ionenkanäle stellen eine vielversprechende, zukünftige Option in der Behandlung maligner Melanome dar. Ich konnte zeigen, dass neben der bereits beschriebenen funktionellen Expression des „transient receptor potential“ Kanals TRPM8 in Melanomzelllinien auch TRPA1 in verschiedenen Melanomzelllinien exprimiert und funktionell ist. Die Phytopharmaka Senföl (Allylisothiozyanat; AITC) und Zimtaldehyd zeigen in Melanom-Modellen antitumoröse Effekte. Zudem sind beide Substanzen potente Stimulatoren von TRPA1. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob AITC und Zimtaldehyd TRPA1-vermittelt die Proliferation, Apoptose und Migration von Melanomzellen beeinflussen. Das Vorkommen von TRPA1 in verschiedenen Melanomzelllinien wurde auf molekularbiologischer Ebene, mit fluorometrischen Bestimmungen des TRPA1-vermittelten Ca2+-Einstroms sowie in elektrophysiologischen Messungen nachgewiesen. Anschließend wurde die funktionelle Relevanz von TRPA1 bezüglich tumorhemmender Eigenschaften geprüft. Durch die Anwendung von TRPA1-Blockern konnte die AITC- und Zimtaldehyd-induzierte Verminderung der Proliferation nicht aufgehoben werden. Auch bezüglich der Migration und Apoptose konnte keine Korrelation zu einer TRPA1-Modulation festgestellt werden. Daher scheinen die durch AITC und Zimtaldehyd induzierten Effekte höchstwahrscheinlich nicht durch TRPA1 vermittelt zu werden.

Diss. (sammanfattning) Linköping : Univ., 2001. / Härtill 5 uppsatser.

Regensburg, Univ., Diss., 2007

In the first part of the theses, I studied therapeutical effect of intratumoral application of various types of bacteria on melanoma B16-F10 bearing mice alone or in combination with another immunostimulatory compounds. Tumour size, metastasis and survival were monitored. The second part was focused on study of cytotoxic effect of neutrophils on melanoma cells and the role of neutrophil extracellular traps formation.

The aim of this thesis was to investigate the possible role of neutrophil granulocytes in antitumor reactions. Most of our experiments were focused on in vitro studies assessing the cytotoxic effect of mouse neutrophils on B16-F10 melanoma cells labelled with PAMPs. We put an emphasis on activation and generating a prime state of neutrophils. Moreover, a release rate of enzyme myeloperoxidase from azurophil granules was detected as a marker of neutrophil degranulation. We also attempted to attract neutrophils into tumor microenvironment using thioglycolate medium and its main compound casein.