Os princípios biológicos da regeneração óssea guiada (ROG) têm contribuído para o desenvolvimento de membranas que, em odontologia, são utilizadas em diversas situações como tratamentos com implantes dentários, aumento de rebordo alveolar e reparo de defeitos ósseos de origem traumática e patológica. Resultados de experimentos in vitro comparando a membrana obtida pela associação do polímero poli(fluoreto de vinilideno-trifluoretileno) e da cerâmica titanato de bário (P(VDFTrFE)/ BT) à membrana de politetrafluoretileno (PTFE) mostraram uma resposta favorável de osteoblastos, fibroblastos e queratinócitos à membrana de P(VDFTrFE)/ BT. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da membrana de P(VDFTrFE)/ BT sobre a formação óssea in vivo. Foram criados defeitos ósseos com 5 mm de diâmetro em calvárias de ratos machos Wistar (peso 200-250 g), distribuídos em três grupos com relação à utilização ou não de membranas nos defeitos ósseos: (1) membrana de P(VDF-TrFE)/BT; (2) membrana de PTFE; (3) nenhum tipo de membrana. Ao final de 4 e 8 semanas os animais foram eutanasiados e as amostras foram submetidas à: (1) análise por microtomografia computadorizada (micro-CT) para avaliar volume ósseo, superfície óssea, superfície óssea específica, número de trabéculas, separação trabecular e espessura trabecular, (2) análise histológica com base em cortes histológicos não descalcificados, (3) análise por reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR em tempo real) para avaliar a expressão gênica dos marcadores ósseos runt-related transcription factor 2 (RUNX2), fosfatase alcalina (ALP), sialoproteína óssea (BSP), osteocalcina (OC), osteoprotegerina (OPG) e receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL) e (4) análise da expressão de microRNAs (miRs) pela técnica de sequenciamento na plataforma Illumina. Os dados das análises morfométricas e da expressão gênica foram submetidos ao teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Fischer quando apropriado, e para a análise da expressão de miRs foi utilizado o teste de Mann-Whitney para comparar a membrana de P(VDF-TrFE)/BT à de PTFE. Para todas as comparações o nível de significância adotado foi de 0,05. Os defeitos que não receberam a membrana tiveram uma formação óssea insignificante. Ambas as membranas favoreceram a formação óssea, sendo a superfície óssea maior sobre a membrana de P(VDF-TrFE)/BT comparada à de PTFE em 4 (p=0,01) e 8 (p=0,001) semanas e a separação trabecular maior sobre a membrana de PTFE comparada à de P(VDF-TrFE)/BT em 4 (p=0,05) e 8 (p=0,001) semanas. A expressão gênica de BSP (p=0,01), OC (p=0,001) e OPG (p=0,001) foi maior e de RANKL (p=0,001) foi menor sobre a membrana de P(VDFTrFE)/ BT comparada à de PTFE em 4 semanas. A expressão gênica de RUNX2 (p=0,001) e OC (p=0,05) foi maior e de ALP (p=0,05), RANKL (p=0,01) e OPG (p=0,001) foi menor sobre a membrana de P(VDF-TrFE)/BT comparada à de PTFE em 8 semanas. Quarenta e cinco e 13 miRs foram regulados positivamente (>2 vezes) em 4 semanas e 8 semanas, respectivamente, e 11 e 39 miRs foram regulados negativamente (>2 vezes) em 4 semanas e 8 semanas, respectivamente, pela membrana de P(VDF-TrFE)/BT comparada à de PTFE. Os resultados indicam que a membrana de P(VDF-TrFE)/BT favorece a formação óssea quando comparada à membrana de PTFE e, portanto, pode ser considerada um biomaterial promissor para ser utilizado em procedimentos de ROG. / Biological principles of guided bone regeneration (GBR) have contributed to development of membranes that, in dentistry, are used in several situations such as treatment with dental implants, alveolar bone augmentation and repair of traumatic and pathological bone defects. Results of in vitro experiments comparing membrane obtained by the combination of poly(vinylidene fluoride-trifluoroethylene) and barium titanate ceramics (P(VDF-TrFE)/BT) with polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane showed a favorable response of osteoblasts, fibroblasts and keratinocytes to the P(VDF-TrFE)/BT membrane. The aim of this study was to evaluate the effect of P(VDFTrFE)/ BT membrane on in vivo bone formation. Bone defects with 5 mm in diameter were created in calvaria of male Wistar rats (weight 200-250 g), distributed into three groups regarding the use or not of membranes on defects: (1) P(VDF-TrFE)/BT membrane; (2) PTFE membrane; (3) no membrane. At the end of 4 and 8 weeks, the animals were euthanized and samples were subjected to: (1) computed microtomography analysis (micro-CT) to assess bone volume, bone surface, specific bone surface, trabecular number, trabecular thickness and trabecular separation; (2) histological analysis based on non-decalcified histological sections; (3) real time polymerase chain reaction (real time PCR) to evaluate gene expression of the bone markers runt-related transcription factor 2 (RUNX2), alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), osteocalcin (OC), osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL); (4) microRNAs (miRs) sequencing analysis at Illumina platform. Data from morphometric and gene expression analyses were submitted to the Kruskal-Wallis test followed by Fischer\'s test, when appropriate, and from miRs expression to the Mann-Whitney test to compare P(VDF-TrFE)/BT with PTFE membrane. For all comparisons, the significance level was 0.05. Defects without membrane exhibit a non significant bone formation. Both membranes favored osteogenesis with an increased bone formation on the P(VDF-TrFE)/BT membrane compared with PTFE at 4 (p=0.05) and 8 weeks (p=0.001). Trabecular separation was greater on PTFE membrane compared with the P(VDF-TrFE)/BT at 4 (p=0.05) and 8 weeks (p=0.001). At 4 weeks, the gene expression of BSP (p=0.01), OC (p=0.001) and OPG (p=0.001) were higher on P(VDF-TrFE)/BT membrane compared with PTFE, while RANKL (p=0.001) was lower. The gene expression of RUNX2 (p=0.001) and OC (p=0.05) were higher and ALP (p=0.05), RANKL (p=0.01) and OPG (p=0.001) were lower on the membrane of P(VDF- TrFE)/BT compared with PTFE at 8 weeks. Fortyfive and 13 miRs were up-regulated (> 2 fold) at 4 weeks and 8 weeks, respectively, and 11 and 39 miRs were negatively regulated (> 2 fold) at 4 weeks and 8 weeks, respectively, on the P(VDF-TrFE)/BT membrane compared with PTFE membrane. The results indicate that the P(VDF-TrFE)/BT membrane favors bone formation compared with PTFE membrane and, therefore, may be considered a promising biomaterial for using in GBR procedures.

A terapia fotodinâmica é uma técnica que utiliza uma substância fotossensibilizadora, luz de comprimento de onda adequado e oxigênio para produzir um efeito citotóxico, sendo uma alternativa aos tratamentos convencionais para o câncer. Este tratamento, quando realizado nos vasos sanguíneos, leva à destruição deles. No entanto, a recuperação dos vasos é observada algum tempo depois, o que pode ser um processo angiogênico (formação de novos vasos sanguíneos) induzido pela própria terapia. Os vasos sanguíneos fornecem oxigênio e nutrientes às células, levando ao crescimento de tecidos, inclusive tumorais. Para a investigação da angiogênese após a terapia fotodinâmica, foi utilizado o modelo de membrana corioalantoica de ovos de galinha, pois possui alta vascularização e fácil acesso aos vasos sanguíneos. A terapia fotodinâmica foi feita nos vasos da membrana com o fotossensibilizador Photogem®, em uma concentração de 10 μg/mL, e subdoses de luz para não levar o embrião à morte. As doses de luz de 6 e 15 J/cm2 foram estabelecidas para os experimentos e foi observada diminuição na densidade de vasos 3 horas após a terapia fotodinâmica, com um aumento 24 horas depois. Para a quantificação desses efeitos, uma rotina no MATLAB® foi elaborada para determinar a porcentagem de área ocupada pelos vasos sanguíneos nas imagens da membrana, que foram realizadas antes, a cada 30 minutos durante as primeiras 3 horas após o tratamento e 24 horas depois. Além disso, para uma análise da distribuição de grandes e pequenos vasos, o comprimento e o diâmetro de cada vaso nas imagens foram medidos com o software ImageJ®, que permitiu verificar que os menores vasos são os mais afetados 3 horas depois da terapia, com aumento no número desses vasos após 24 horas. Como isso poderia ser um indício de um processo angiogênico após a terapia fotodinâmica, marcadores de angiogênese foram utilizados em Western Blot. Apesar de esse método molecular não ter mostrado diferença entre o grupo com terapia fotodinâmica e os grupos controle, as análises por imagem indicam a formação de novos vasos 24 horas após a terapia, com uma rede vascular diferente da que havia antes. / Photodynamic therapy is a technique that uses a photosensitizing substance, light of adequate wavelength and oxygen to produce a cytotoxic effect, being an alternative to conventional treatments for cancer. This treatment, when carried out in the blood vessels, leads to their destruction. However, vessel recovery is observed some time later, which may be an angiogenic process (formation of new blood vessels) induced by the therapy itself. The blood vessels supply oxygen and nutrients to the cells, leading to tissue growth, including tumoral. For the investigation of angiogenesis after photodynamic therapy, the chorioallantoic membrane model of chicken eggs was used, because it has high vascularization and easy access to the blood vessels. Photodynamic therapy was performed on membrane vessels with the Photogem® photosensitizer, at a concentration of 10 μg/mL, and light subdoses to avoid leading the embryo to death. Light doses of 6 and 15 J/cm2 were established for the experiments and a decrease in vessel density 3 hours after photodynamic therapy was observed, with an increase 24 hours later. For quantification of these effects, a routine in MATLAB® was designed to determine the percentage of area occupied by blood vessels in the membrane images, which were performed before, every 30 minutes for the first 3 hours after treatment and 24 hours later. Furthermore, for an analysis of the distribution of large and small vessels, the length and diameter of each vessel in the images were measured with the ImageJ® software, which allowed to verify that the smaller vessels are most affected 3 hours after the therapy, with an increase in the number of these vessels after 24 hours. Since this could be an indication of an angiogenic process after photodynamic therapy, angiogenesis markers were used in Western Blot. Although this molecular method showed no difference between the group with photodynamic therapy and the control groups, the image analysis indicates the formation of new vessels 24 hours after the therapy, with a vascular network different from before.

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A membrana amniótica tem se consolidado no tratamento das afecções da superfície ocular. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade e a eficácia do implante de MA eqüina, preservada em glicerina a 98%, na reparação de ceratoplastias lamelares em cães, por meio do estudo da avaliação clínica pós-operatória dos animais, do tempo de cicatrização, da reconstrução da arquitetura da córnea, da resposta inflamatória, e da composição colágena do estroma corneal no local do implante. Foram selecionados 12 cães, sem raça definida, machos ou fêmeas, divididos em quatro grupos de três, que tiveram tempos de observação distintos: 2, 7, 21 e 40 dias. Foi realizada ceratoplastia lamelar de 5 mm de diâmetro em um dos olhos de cada animal, seguida da aplicação do implante de membrana amniótica eqüina de 6 mm. Durante o período de observação, exame clínico oftalmológico foi realizado nos cães, com intervalos de 48 horas e ao final deste período, foram submetidos á eutanásia. Os olhos em estudo foram enucleados e fixados para posterior análise. Foram utilizados três métodos de coloração para o estudo histológico do tecido implantado: hematoxilina-eosina (HE), ácido periódico de Schiff (PAS) e picrossirius. Além disso, procedeu-se a imunomarcação para colágenos tipo I, III, e V, com uso de pepsina para digestão das fibras colágenas heterotípicas exposição dos epítopos. Clinicamente os implantes foram completamente epitelizados em aproximadamente 10 dias, os neovasos apresentaram involução progressiva a partir dos 20 dias de pós-operatório, estando ausentes ao final dos 40 dias de observação, restando apenas uma nébula no local da lesão. À microscopia óptica, observou-se resposta inflamatória moderada, presença de epitélio pavimentoso estratificado aos sete dias e epitelização completa aos 21 dias. Aos 40 dias a membrana basal do epitélio apresentou-se reconstituída. O colágeno tipo I teve sua expressão no estroma intensificada aos 21 dias de pós- operatório. O colágeno tipo III está presente na membrana amniótica, sua a ausência no local do implante, aos 21 dias, mostrou remodelamento do tecido implantado. O colágeno tipo V, presente no estroma da córnea, teve sua expressão aumentada aos 7 e 21 dias, retornando à distribuição normal aos 40 dias de pós-operatório. Assim concluí-se que: a membrana amniótica eqüina é viável como implante em córnea de cão, sendo incorporada ao estroma, resultando em restabelecimento parcial da transparência no local de implante; o colágeno do tecido implantado é remodelado e substituído já aos 21 dias de pós-operatório; a pepsina foi eficiente na digestão das fibras e exposição dos epítopos dos colágenos nas fibras heterotípicas / The amniotic membrane has consecrated itself in the treatment of ocular surface diseases. The objective of this study was to evaluate the efficiency and viability of the equine amniotic membrane graft, preserved in glycerin at 98%, in the lamellar keroplasty recovery in dogs. Evaluation was based on clinical post-surgical exam, healing time, corneal architectural reconstruction, inflammatory response and collagen composition of the corneal stroma at the graft site. Twelve mixed-breed, male and female dogs were divided into four groups of three dogs. Each group was submitted to different observation periods of 2, 7, 21 and 40 days. Each dog was submitted to a 5 mm lamellar keratoplasty in one eye, followed by a 6 mm equine amniotic membrane graft. Each animal was submitted to clinical ophthalmologic exam every 48 hours. At the end of the evaluation period, the animal was euthanized and the grafted eye was removed and fixated for posterior analysis. For the histological study of the tissue graft, three methods of coloration were used: hematoxylin eosin (HE), periodic acid of Schiff (PAS) and picrosirius. Immunolocalization for the collagen types I, III and V using pepsin for fiber digestion of heterotypic fibrils and epitope exposure, was made. Clinically, the grafts were completely epithelized in approximately 10 days and neovascularization regressed progressively 20 days after surgery, being completely absent after 40 days, when only a nebula remained at the graft site. Optic microscopy revealed mild inflammatory response and presence of stratified pavement epithelium after 7 days and complete epithelization 21 days after surgery. At the end of 40 days the basal membrane was reconstituted. Type I collagen had its expression in the stroma intensified 21 days after the surgery. By day 21 the absence of collagen III in the corneal stroma showed graft remodeling, since this was formerly present in the amniotic membrane. The expression of type V fiber in the corneal stroma showed a mildly intensified expression at 7 and 21 days of observation, but returned to its normal distribution 40 days after surgery. Conclusion was that the equine amniotic membrane is a viable graft for the dog\'s cornea as it is incorporated to the stroma, resulting in partial transparency at the site of the graft. Twenty-one days after surgery, collagen from the graft is already remodeled and substituted. Pepsin is efficient for fiber digestion and collagen epitope exposure in heterotypical fibers.

O objetivo deste estudo foi estabelecer cultura primária de células derivadas da granulação óssea (GO) de seres humanos para determinar seu padrão de crescimento in vitro e determinar os efeitos biológicos de três membranas reabsorvíveis feitas de colágeno (BioGide®, GenDerm®, CollaTape®) em culturas de fibroblastos gengivais humanos (FGH) e células da granulação óssea (GO). Foram coletadas amostras de tecido ósseo presente no alvéolo de cicatrização de dois pacientes adultos saudáveis sistemicamente com indicação de cirurgia periodontal regenerativa pela técnica do enxerto ósseo em neoformação. Imediatamente após a coleta, as amostras foram transportadas ao laboratório de cultura de células para estabelecimento da cultura primária. As células foram cultivadas em atmosfera úmida, contendo 5% CO2 a 37oC. A curva de crescimento das células foi determinada por meio de contagem de células viáveis. Após a caracterização da curva de crescimento, foram realizadas a caracterização da amostra por meio de determinação da atividade de fosfatase alcalina e de mineralização. Posteriormente, os efeitos de três diferentes tipos de membranas colágenas sobre a proliferação de células GO e FGH foram investigados por meio do teste MTT. As amostras foram divididas em oito grupos: (1) células FGH em meio DMEM (C-FGH); (2) células FGH em meio DMEM condicionado com membrana GenDerm (GD-FGH); (3) células FGH em meio DMEM condicionado com membrana BioGide (BG-FGH); (4) células FGH em meio DMEM condicionado com membrana ColaTape (CT-FGH); (5) células GO em meio DMEM (C-GO); (6) células GO em meio DMEM condicionado com membrana GenDerm (GD-GO); (7) células GO em meio DMEM condicionado com membrana BioGide (BG-GO); (8) células GO em meio DMEM condicionado com membrana CollaTape (CT-GO). O teste de proliferação celular mostrou que houve aumento significativo (p< 0.05; ANOVA para medidas repetidas) do número de células vitais presentes na cultura nos dias 3 (90,8%), 5 (132,50%), 7 (137,50%) e 10 (227,50%) em relação ao controle (dia 0). Foram observadas atividade de fosfatase alcalina e de mineralização in vitro. Houve aumento do número de células FGH e GO viáveis em todos os grupos (p< 0.05; ANOVA para medidas repetidas). Houve maior efeito proliferativo nas células FGH e GO nos grupos GD e CT, com diferenças estatisticamente significantes entre os grupos (p< 0.05; Mann Whitney) apenas no período de 96 horas. Esses achados sugerem que as células GO apresentam alta atividade de proliferação e síntese, sendo compatíveis com células de linhagem osteoblástica. Duas membranas colágenas testadas exerceram maior ação proliferativa tardia sobre osteoblastos, indicando sua eficácia na regeneração dos tecidos periodontais. / The aim of this study was to establish primary culture of cells derived from human bone granulation tissue (GO) in order to determine its growth pattern in vitro and the biological effects of three absorbable collagen membranes (BioGide®, GenDerm®, CollaTape®) in human gingival fibroblasts (FGH) and human bone granulation (GO) cell cultures. Samples of bone tissue present at healing sockets of two systemically healthy adults with indication of periodontal regenerative therapy by the newly forming bone were collected. Immediately after, samples were transported to the laboratory of cell culture to the establishment of primary cultures. Cells were cultivated in humid atmosphere with 95% CO2 at 37oC. Cells growth pattern were determined by counting of viable cells. After characterization of growth pattern, samples were characterized according to alkaline phosphatase activity and mineralization detected by alizarin red. Afterwards, the effects of three different types of collagen membranes on GO and FGH cells were investigated by MTT test. Samples were divided into eight groups: (1) FGH cells in DMEM (C-FGH); (2) FGH in DMEM conditioned by GenDerm® membrane (GD-FGH); (3) FGH in DMEM conditioned with BioGide® (BG-FGH); (4) FGH in DMEM conditioned by CollaTape® (CT-FGH); (5) GO cells in DMEM (C-GO); (6) GO cells in DMEM conditioned by GenDerm® (GD-GO); (7) GO cells in DMEM conditioned by BioGide® (BG-GO); (8) GO cells in DMEM conditioned by CollaTape® (CT-GO). Cell proliferation test showed a significant (p< 0.05; ANOVA for repeated measures) increase in the number of vital cells present in the culture at days 3 (90.8%), 5 (132.50%), 7 (137.50%) and 10 (227.50%) compared to control (dia 0). It was observed alkaline phosphatase activity and mineralization in vitro. There was an increase in the number of FGH and GO viable cells at all groups (p< 0.05; ANOVA for repeated measures). Greater proliferative effect at FGH and GO cells at GD and CT groups, with significant differences between groups (p< 0.05; Mann Whitney) only at 96 hs. Two of the collagen membranes tested exerted greater late proliferative effects on osteoblasts, suggesting its efficacy in the regeneration of periodontal tissues.

Orientador: Dionei Ramos / Banca: Ercy Mara Cipulo Ramos / Banca: Renata Calciolari Rossi e Silva / Resumo: Introdução: Sabe-se que o transporte mucociliar (TMC) é o mecanismo de defesa mais importante do sistema respiratório e que a exposição contínua à fumaça do cigarro torna este mecanismo deficiente. Já é conhecido que o exercício físico aeróbico em indivíduos saudáveis promove uma melhor função mucociliar. Entretanto, o comportamento deste mecanismo de defesa em indivíduos tabagistas após o exercício físico, ainda não está bem esclarecido na literatura, assim como o comportamento da modulação autonômica cardíaca nestes indivíduos. O tabagismo está relacionado ao desenvolvimento de diversas doenças, o que torna essencial o incentivo a ações efetivas como a implementação de programas de cessação ao tabagismo. Objetivos: Esta dissertação teve como objetivos: Comparar e correlacionar a resposta aguda do transporte mucociliar e da modulação autonômica cardíaca de tabagistas e não tabagistas submetidos a um estímulo de exercício físico submáximo e máximo e descrever um programa de cessação tabagística com novos procedimentos que elevam o índice de sucesso de abstinência. Métodos: Para o primeiro objetivo, avaliou-se 53 indivíduos, sendo 33 tabagistas e 20 não tabagistas. Todos foram submetidos a avaliação da transportabilidade mucociliar por meio do teste tempo de trânsito de sacarina (TTS) e da função autonômica por meio da variabilidade da frequência cardíaca antes e após um estímulo de exercício submáximo pelo teste de caminhada de seis minutos e exercício máximo pelo teste progressivo exaustivo em esteira (TPEE). Para o segundo objetivo... / Abstract: Introduction: It is known that the mucociliary transport (MCT) is the most important defense mechanism of the respiratory system and continuous exposure to cigarette smoke makes this faulty mechanism. It is already known that aerobic exercise in healthy subjects promotes better mucociliary function. However, this behavior defense mechanism in smokers after exercise is still not very clear in the literature, as well as the behavior of the cardiac autonomic modulation in these individuals. Smoking is related to the development of various diseases, which makes it essential to encourage the effective actions such as the implementation of smoking cessation programs. Objectives: This research aimed to: compare and correlate the acute response of the mucociliary transport and cardiac autonomic modulation of smokers and nonsmokers underwent a submaximal exercise stimulus and maximum and describe a smoking cessation program with new procedures that raise the abstinence success rate. Methods: For the first goal, it assessed 53 subjects, 33 smokers and 20 nonsmokers. All patients underwent assessment of mucociliary transportability through saccharin transit time test (STT) and autonomic function by means of heart rate variability before and after a submaximal exercise stimulus the six-minute walk test and maximal exercise by exhaustive progressive treadmill test (EEPT). For the second goal, described a smoking cessation program with the implementation of new procedures... / Mestre

A rota de biossíntese de colesterol tem sido estudada pelo seu envolvimento com a secreção de hormônios. A secreção de insulina depende do colesterol e de intermediários da sua biossíntese como o geranilgeranil pirofosfato. Para compreender a contribuição destes elementos na secreção de insulina foram utilizados inibidores de diferentes pontos da rota de biossíntese do colesterol. Estudou-se a contribuição do geranilgeranil pirofosfato e do colesterol na secreção de insulina estimulada pela glicose e analisados parâmetros físicos de membrana dos quais decorrem aspectos funcionais da célula beta. Sinvastatina inibiu a secreção de insulina sem afetar o conteúdo celular de colesterol, mas inibindo a geranilgeranilação de proteínas. A diminuição do conteúdo de colesterol aumenta a fluidez de membrana desorganizando lipid rafts. A suplementação com colesterol recupera a função secretória. Por tanto, a inibição da síntese de colesterol diminui a secreção de insulina através da redução da isoprenilação de proteínas e da alteração estrutural de membranas celulares. / Cholesterol biosynthesis pathway has been studied for its involvement with the hormone secretion process. Insulin secretion depends on cholesterol and its biosynthesis intermediates such as geranylgeranyl pyrophosphate. For understand their contribution on the glucose stimulated insulin secretion, cholesterol biosynthesis pathway key steps inhibitors were used. The geranylgeranyl pyrophosphate and cholesterol contribution to the insulin secretion was studied so as physical parameters of the membrane, from where derive key functions of it. Simvastatin inhibited insulin secretion without affecting total cellular cholesterol, but inhibiting protein geranylgeranylation. The cholesterol reduction increased the membrane fluidity with consequent disorganization of membrane lipid rafts, in which secretion machinery is organized. Cholesterol supplementation recovers cellular secretory function. We conclude that cholesterol biosynthesis inhibition reduces insulin secretion through protein isoprenylation impairment and structural disarrangement of the cellular membranes.

O objetivo do presente estudo foi avaliar a ação do ácido indol-3-acético (AIA) combinado com a peroxidase de raiz forte (HRP), formando um sistema gerador de espécies reativas de oxigênio, sobre a viabilidade de Staphylococcus aureus. Para tal, avaliou-se a viabilidade do S. aureus através da contagem das unidades formadoras de colônias após crescimento em ágar manitol, potencial e integridade de membrana por citometria de fluxo e integridade do DNA através de eletroforese em gel de poliacrilamida. Para realização dos ensaios foram utilizadas cepas de S. aureus recuperadas de casos de mastites clínicas. As cepas foram cultivadas em meio BHI (brain-heart-infusion) a 37ºC \"overnight\". Nos ensaios, o microrganismo foi incubado na ausência (controle) e presença de AIA (1 mmol/L)/HRP (1 &micro;mol/L) em diferentes tempos (0, 1,5, 3 e 6 horas) a 37ºC. Foram realizados também ensaios contendo o microrganismo incubado na presença de AIA ou de HRP. O sistema AIA/HRP inibiu em 96%, 98%, 99% a formação de colônias do microrganismo para os tempos de 1,5, 3 e 6 horas, respectivamente, em relação ao controle em cada tempo. Ocorreu uma redução na polarização da membrana do microrganismo em 38, 69 e 99% nos tempos 1,5, 3 e 6 horas, respectivamente e uma diminuição significativa do número de microrganismos com membrana integra de 17 e 22% quando estes foram incubados por 3 e 6 horas, respectivamente em relação ao controle nos respectivos tempos. A adição das enzimas antioxidantes catalase ou superóxido dismutase ao meio de incubação não alterou o efeito deletério promovido pelo sistema AIA/HRP avaliado pelas unidades formadoras de colônias, despolarização e integridade de membrana. O sistema AIA/HRP não induziu a fragmentação do DNA do S. aureus após 3 e 6 horas de incubação. No presente estudo, foi possível verificar que a oxidação do AIA pela HRP produz uma resposta citotóxica potente capaz de promover a inibição do crescimento de S. aureus em ágar manitol, provocar a despolarização e a perda da integridade da membrana do microrganismo, sugerindo a possibilidade da utilização do sistema AIA/HRP como uma possível terapia alternativa contra bactérias. / The objective of this study was to evaluate the action of the indole-3-acetic acid (IAA) in combination with horseradish peroxidase (HRP), forming a system generator of reactive oxygen species, on the viability of Staphylococcus aureus. To this end, was evaluated the of viability of S. aureus through the counting of the colony forming units after growth in mannitol agar, membrane potential and membrane integrity by flow cytometry and integrity of the DNA through the polyacrylamide gel electrophoresis. For the tests were used strains of S. aureus recovered from cases of clinical mastitis. The strains were grown in BHI medium (brain-heart-infusion) at 37°C overnight. In the tests, the microorganism was incubated in the absence (control) and presence of IAA (1 mmol/L)/HRP (1 &micro;mol/L) at different times (0, 1.5, 3 and 6 hours) at 37°C. There were also conducted tests containing the microorganism incubated in the presence of IAA or HRP. The system IAA/HRP inhibited at 96%, 98%, 99% colony formation of microorganism to the times of 1.5, 3 and 6 hours, respectively, in relation to the control in every time. There was a decrease in polarization of the membrane of the microorganism on 38, 69 and 99% at times 1.5, 3 and 6 hours, respectively, and a significant decrease in the number of microorganisms with membrane integrity, 17 and 22% when they were incubated for 3 and 6 hours, respectively, in relation to the control in their time. The addition of the antioxidant enzymes catalase and superoxide dismutase in incubation medium did not alter the deleterious effect promoted by the system IAA/HRP assessed by colony forming units, membrane potential and membrane integrity. The system IAA/HRP did not induce the DNA fragmentation of S. aureus after 3 and 6 hours of incubation. In the present study, it was possible to verify that the oxidation of the IAA by HRP produces a potent cytotoxic response capable of promoting the inhibition of growth of S. aureus in mannitol agar, causing depolarization and the loss of integrity of the membrane of the microorganism, suggesting the possibility of using the system IAA/HRP as a possible alternative therapy against bacteria.

Tese de mestrado. Engenharia Biomédica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2010

A membrana corioalantóica (MCA) é uma das membranas extraembrionárias do embrião da galinha, cuja característica principal é ser muito vascularizada e permeável a trocas iônicas e gasosas. O ambiente onde está inserida permite o desenvolvimento de vários modelos experimentais, incluindo estudos de angiogênese, toxicologia e biocompatibilidade, bem como análise do processo de reparo e de carcinogênese de inúmeros tecidos. O objetivo deste trabalho foi verificar as alterações histomorfológicas de fragmentos de gengiva enxertados na MCA, com o intuito de verificar a viabilidade da utilização desse modelo em estudos envolvendo a mucosa oral. Fragmentos de gengiva foram coletados de pacientes submetidos a cirurgia de exodontia e enxertados na MCA de ovos fecundados de galinha após 9 dias de desenvolvimento embrionário. A coleta das gengivas foi feita após 1, 3 e 5 dias de inserção na MCA. As alterações morfológicas microscópicas foram anallisadas no decorrer do tempo no epitélio e na lâmina própria da gengiva e na MCA. Análise de TUNEL foi realizada para se comprovar a presença ou não de apoptose nos tecidos da gengivais. Foram realizadas também análises imuno-histoquímicas e quantificação da expressão de queratinas 10 (K10) e 14 (K14), para verificar as alterações de diferenciação epitelial, e CD34, para mensuração da vascularização. Do total de 25 ovos embrionados utilizados, 10 ovos receberam as gengivas para o experimento; o restante não mostrou viabilidade embrionária e foi descartado. Após 1 dia de inoculação, a interface MCA-gengiva exibiu intenso infiltrado inflamatório, o qual invadiu a lâmina própria. Após 5 dias, essa reação inflamatória ficou restrita à interface MCA-gengiva. As principais modificações morfológicas na gengiva foram observadas nos períodos de 3 e 5 dias de inoculação, em que houve perda da arquitetura do epitélio, mantendo-se somente a camada basal viável, e redução da celularidade na lâmina própria. Observou-se aumento da vascularização no período de 5 dias, atestada pela quantificação de vasos CD34 positivos. O epitélio remanescente exibiu ausência de estratificação e de expressão de K10, intensa marcação de K14 e células TUNEL negativas, sugerindo a presença de células epiteliais viáveis e pouco diferenciadas. Concluiu-se que a gengiva foi incorporada à MCA, com redução paulatina da reação inflamatória e revascularização, bem como manteve-se viável nesse ambiente em um período de 5 dias; contudo, sofreu processos de adaptação que incluíram a perda da estratificação epitelial e a redução da celularidade na lâmina própria. / Chorioallantoic membrane (CAM) is one of the chicken embryo extra embryonic membrane, whose main characteristic is being very vascularized and permeable for ionic and gaseous exchanges. The environment where it is inserted allows the development of many experimental model, including studies about angiogenesis, toxicology and biocompatibility, as well as analysis of the repair process and carcinogenesis of many tissues. The objective of this study was to verify the histomorphological changes of gingival fragments grafted on CAM, with the intent to check the viability of this model in studies involving oral mucosa. Fragments of gingiva were collected from patients undergoing dental extraction and grafted on CAM of fertilized chicken egg after 9 days of embryonic development. The collect of gingiva were made after 1, 3 and 5 days of insertion on CAM. The morphological alterations were analyzed over the time in the epithelium and lamina propria of gingiva and CAM. TUNEL analysis were made to evaluate the presence or not of apoptosis in the gingival tissue. Imunohistochemistry and quantification of the expression of keratin 10 (K10) and 14 (K14) were also made to check any alteration of epithelial differentiation, and CD34, for measurement of vascularization. Total of 25 fertilized egg were used, 10 eggs received gingiva for experiments; remaining egg didn\'t show embrionary viability and were discarded. After 1 day of inoculation, the CAM-gingiva interface exhibited a intense inflammatory infiltrate, which invaded the lamina propria. After 5 days, this inflammatory reaction were restricted to the CAM-gingiva interface. The main morphological changes in the gingiva were observed between 3 to 5 days of inoculation, in which there was loss of epithelial architecture, only the basal layer were viable, and a reduction of cellularity in lamina propria. Were observed a increase of vascularization in period of 5 days, attested by the quantification of positive CD34 vessel. The remaining epithelia showed the absence of stratification and expression of K10, intense marking of K14 and TUNEL cell negative, suggesting the presence of viable epithelial cells and less differentiated. It was concluded that the gingiva was incorporated by CAM, with gradual reduction of inflammatory reaction and revascularization, as well remained viable in this environment in a period of 5 days; however, it underwent processes of adaptation that included the loss of epithelial stratification and the reduction of cellularity in the lamina propria.