Diese Arbeit verdeutlicht die Wirkung von Chondroitinsulfat auf die Synthese von Prostaglandin E2 in humanen mesenchymalen Stromazellen in Abhängigkeit ihres Sulfatierungsgrades. MSC zeichnen sich durch ihre antiinflammatorischen Eigenschaften aus und haben damit einen modulierenden Effekt auf Wundheilungsprozesse. Als Vorläuferzellen von Osteoblasten sind sie direkt an der Knochenneubildung beteiligt. Eine persistierende Entzündung hat eine kontinuierliche Freisetzung von Zytokinen, wie IL-1 zur Folge. Es konnte gezeigt werden, dass IL-1 in hMSC zu einer Freisetzung von PGE2 führt. Unter kurzzeitiger Wirkung stimuliert PGE2 die Knochenneubildung. Eine langanhaltende Präsenz leitet dagegen die Bildung des Faktors RANKL, einen die Osteoklastogenese stimulierenden Faktor, ein. Seit langem ist der positive Effekt von Chondroitinsulfat in chronischen Entzündungsprozessen, wie Rheumatoider Arthritis, bekannt. Zudem werden sie in aktuellen Studien als Beschichtungsbestandteile von Knochenimplantaten verwendet. Sie führten hier zu einer besseren Bioinduktivität und Biokonduktivität. Bisher ist dennoch der molekulare Wirkmechanismus nicht genau beschrieben. Die Schwierigkeit besteht darin, dass die molekularen Signalkaskaden für die einzelnen Kulturmoldelle Unterschiede aufweisen und kein ubiquitärer Mechanismus dargestellt wird. In hMSC führte die Stimulation mit IL-1 unter vorheriger Zugabe von Chondroitinsulfat zu einer Reduktion der PGE2 Freisetzung. Der Effekt des hochsulfatierten sCS3 war gegenüber dem nativen C4S verstärkt. Die reduzierende Wirkung von C4S setzte verzögert ein. Es ist bereits bekannt, dass die negative Ladung der CS zu einer Bindung von Zytokinen führt. Dadurch wird eventuell die Konzentration der Zytokine, wie IL-1 im Bereich der Zellrezeptoren erniedrigt und führt zu einer verringerten Stimulation der Zelle. Denkbar ist auch die Beeinflussung der intrazellulären Signaltransduktionskaskade durch die Bindung der CS an einen speziellen, bisher unbekannten, Membranrezeptor. Die entscheidenden Enzyme der PGE2 Synthese sind die Cyclooxygenase-2 (Cox-2) und die mikrosomale Prostaglandin E Synthase 1 (mPGES1). Die mRNA beider Enzyme war unabhängig vom Sulfatierungsgrad der CS reduziert. Dieser Effekt konnte auf Protein-ebene nicht belegt werden. Die produzierte Proteinmenge an mPGES1 wird durch IL-1 induziert, bleibt aber auch durch Zugabe von CS unverändert. Somit kann von einer erhöhten Translationseffizient und mRNA Stabilität der mPGES1 RNA ausgegangen werden. MAPK Kinasen sind entscheidende Schnittstellen bei der Regulation der mRNA Stabilität als auch der Aktivität von Transkriptionsfaktoren. In dieser Studie konnte die MAPK p38 als entscheidendes Enzym bei der Wirkung von CS auf die PGE2 Synthese ermittelt werden. Dabei führten sowohl das natürliche C4S als auch das hochsulfatierte sCS3 zu einer verringerten Aktivierung. Der Transkriptionsfaktor NfkB ist einer von mehreren, die an den Promotorbereichen der beiden induzierbaren PGE2 Enzyme, Cox-2 und mPGES1, binden. Es ist anzunehmen, dass die hier aufgezeigte verringerte Aktivität von NfkB als auch die verhinderte Translokation in den Zellkern eine reduzierte Transkription der jeweiligen mRNA bedingten. Abhängig vom untersuchten Modell und den verwendeten Kulturbedingungen können diese Prozesse moduliert sein. Die Erkenntnisse dieser experimentellen Arbeit liefern einen weiteren wichtigen Baustein zum Verständnis der molekularbiologischen Abläufe während entzündlicher Prozesse. Die Verwendung von Chondroitinsulfat, insbesondere hochsulfatiertes CS, in Kombination mit hMSC kann gezielt zu einer Verringerung der Entzündungsreaktion während der Implantateinheilung führen. Die durch PGE2 hervorgerufenen Symptome, wie erhöhte Gefäßpermeabilität, Schwellung und verstärktes Schmerzempfinden begründen diese positiven Effekte.

Die Nicht-alkoholische Steatohepatitis (NASH), gehörig zu der Gruppe der chronischen Lebererkrankungen als eine schwere Form der Nicht-alkoholischen Fettleber-erkrankungen (NAFLD), nimmt in ihrer Prävalenz ständig zu. Gründe dafür sind u.a. eine gesteigerte Nahrungsaufnahme sowie Veränderungen der Nahrungszusammen-setzung. Es kommt zur Ausbildung einer Steatose, die sich unter Mitwirkung verschie-dener Einflussfaktoren zur Steatohepatitis weiterentwickeln kann, wobei die Pathoge-nese noch nicht genau verstanden ist. Die Nicht-alkoholische Steatohepatitis geht oft einher mit Insulinresistenz und starkem Übergewicht. Die Folgen für die Leber sind Funktionseinschränkungen und –verlust, hervorgerufen durch eine massive Akkumula-tion von Triglyzeriden in den Hepatozyten, Entzündungsprozesse sowie einem fibro-tischen Umbau der Leber. Im fortgeschritten Stadium wird eine Lebertransplantation unausweichlich, die jedoch aufgrund des zunehmenden Mangels an Spenderorganen oft nicht möglich ist. Eine Alternative bietet die Transplantation mesenchymaler Stammzellen (MSC). MSC können in vitro in leberzellähnliche Zellen differenziert wer-den und weisen dabei essentielle hepatozytäre Eigenschaften auf, wodurch sie als möglicher Ersatz bzw. als Überbrückungstherapie bis zur Lebertransplantation in Frage kommen. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit dieser Fragestellung. Dazu wur-de ein Tiermodell der NASH mittels Methionin-Cholin-defizienter Diät (MCD-Diät) etab-liert und die Transplantation von hepatozytär differenzierten MSC durchgeführt. An-hand spezifischer zellulärer und biochemischer Marker der NASH konnte die Wirkung des Zelltransplantats auf die Empfängerleber analysiert werden. Es hat sich gezeigt, dass die MSC einen anti-inflammatorischen, anti-fibrotischen und pro-proliferativen Einfluss auf das Empfängerparenchym hatten und somit zur Verbesserung der Symptomatik der NASH beitrugen.

1. Einleitung Multipotente mesenchymale Stromazellen (MSC) stellen eine interessante Therapieoption in der regenerativen Medizin verschiedener Erkrankungen dar. Aufgrund ihrer Herkunft aus mesodermalem Gewebe ist ihr Einsatz in der Therapie von Sehnenerkrankungen als günstig anzusehen, wo sie bei Pferden bereits erfolgreich verwendet werden. Da dieser Erkrankungskomplex mit degenerativen Veränderungen der Achillessehne des Menschen vergleichbar ist, wäre eine Translation der gewonnenen Ergebnisse in die Humanmedizin wünschenswert. Die zugrunde liegenden Wirkmechanismen bei der Sehnenregeneration sind allerdings bis zum heutigen Tage noch nicht vollständig geklärt. Unter anderem wird eine tenogene Differenzierung der MSC mit nachfolgender Produktion von extrazellulärer Matrix (EZM) diskutiert. Als Nachweis hierfür wird die Genexpression von Matrixproteinen sowie Transkriptionsfaktoren angesehen. Die Isolation von MSC ist aus verschiedenen Geweben möglich; allerdings haben Untersuchungen deutliche Unterschiede in den in-vitro-Charakteristika zwischen den Zellquellen aufgezeigt. Trotz dieser unterschiedlichen Eigenschaften fasst die International Society for Cellular Therapy (ISCT) seit 2006 humane MSC als plastikadhärente Zellen mit tripotentem Differenzierungspotential sowie einem definierten Antigenprofil zusammen. Um eine Vergleichbarkeit equiner und humaner MSC und somit eine bessere Übertragbarkeit gewonnener Erkenntnisse aus der Pferdemedizin zu erreichen, steht aktuell die Untersuchung der geforderten Antigenexpression noch aus. 2. Ziele der Untersuchung In der vorliegenden Arbeit sollte daher erstmalig eine vollständige Charakterisierung des geforderten Antigenprofils equiner MSC aus fünf verschiedenen Quellen durchgeführt werden, um einen Vergleich mit humanen Zellen zu ermöglichen. Zudem sollte eine vergleichende Darstellung der Sehnenmarkerexpression durchgeführt werden, welche das Wissen um die in-vitro-Eigenschaften von MSC erweitern und in Folge zur Auswahl einer optimal für die Therapie von Sehnenerkrankungen geeigneten Zellquelle beitragen soll. 3. Materialien und Methoden In der ersten Studie wurden equine MSC aus Knochenmark, Fettgewebe, Nabelschnurblut, Nabelschnurgewebe und Sehnengewebe bis zur Passage 3 kultiviert und anschließend mittels Durchflusszytometrie auf das Vorkommen der Antigene CD 29, CD 44, CD 73, CD 90 und CD 105 sowie das Fehlen der Antigene CD 14, CD 34, CD 45, CD 79α und MHC II untersucht. In der zweiten Studie wurde eine Genexpressionsanalyse der Sehnenmarker Kollagen 1A2, Kollagen 3A1, Decorin, Tenascin-C und Skleraxis vergleichend mittels Echtzeitpolymerasekettenreaktion an den isolierten Zellen durchgeführt. In beiden Studien wurde eine Probenzahl von n= 6 für jede Zellquelle untersucht. 4. Ergebnisse Keine der untersuchten Zellquellen erfüllte die MSC-Definition der ISCT bezüglich des Antigenprofils. Insbesondere durch den fehlenden Nachweis CD 73 (< 3,07 %) in allen untersuchten Proben unterscheiden sich equine und humane MSC. Die einzigen stabil exprimierten Antigene sind die zusätzlich untersuchten Proteine CD 29 (37,5 % - 65,42 %) und CD 44 (32,2 % - 97,18 %). Das Vorkommen CD 105 konnte in MSC aus Fett- und Sehnengewebe belegt werden. Zusätzlich war ein Nachweis von CD 90 in MSC aus Fettgewebe möglich, welche somit die größte Ähnlichkeit mit der humanen Zellpopulation aufweisen. Die Studie zur Genexpressionsanalyse weist auf eine Basisexpression von Kollagen 1A2, 3A1 und Decorin in MSC aus verschiedenen Quellen hin, welche über der von nativem Sehnengewebe liegt. Auch hier weisen wiederum MSC aus Fettgewebe die höchste Expression auf. 5. Schlussfolgerungen Die vorliegende Arbeit leistet einen Beitrag zu einer vertiefenden in-vitroCharakterisierung equiner MSC. Das Antigenprofil equiner MSC ist nicht vollständig mit dem humaner identisch. Eine abschließende Beurteilung sollte durch Untersuchungen mit spezies-spezifischen Antikörpern erfolgen. Die Ergebnisse der Genexpressionsanalyse unterstützen die Theorie, dass MSC die Sehnenheilung durch Produktion von extrazellulärer Matrix beeinflussen. Der Einsatz von MSC aus Fettgewebe in der Therapie von Sehnenerkrankungen sollte forciert werden, da ihre hohe Sehnenmarkerexpression einen Hinweis auf eine Verbesserung der Sehnenregeneration darstellt.

Belastungsinduzierte Sehnen- und Bandschäden, besonders die der Oberflächlichen Beugesehne, sind eine der häufigsten muskuloskelettalen Erkrankungen bei Sportpferden. Die intraläsionale Anwendung von multipotenten mesenchymalen Stromazellen (MSC) stellt eine vielversprechende Therapieoption zur Reduktion der Rezidivraten dar. Der Verbleib der applizierten Zellen und ihre Wirkungsmechanismen sind jedoch noch nicht vollständig geklärt. Die Magnetresonanztomografie (MRT) ist ein hervorragendes Werkzeug zur Erkennung von Sehnengewebsabnormalitäten im distalen Gliedmaßenbereich sowie zum Verfolgen injizierter Zellen. Mit superparamagnetischen Eisenoxid-Partikeln (Spio) markierte MSC werden in der MRT als hypointense Artefakte sichtbar. Gesunde Sehnen zeigen jedoch auch ein hypointenses Signal, wodurch es nicht möglich ist, markierte Zellen von physiologischem Sehnengewebe zu unterscheiden. Ziel dieser Arbeit war die magnetresonanztomografische Darstellung Spio-markierter equiner MSC in unterschiedlichen Zellzahlen in equinem physiologischen Sehnengewebe mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes. In der vorliegenden Arbeit wurden equine MSC mit Spio-Partikeln (BioPal Molday ION Rhodamine B, Inc., Worcester, USA) markiert und in präparierte Schnittinzisionen, in zuvor entnommenen Oberflächlichen Beugesehnen von Kadaverbeinen,in unterschiedlichen Zellzahlen von 106, 105, 104 MSC injiziert. Anschließend erfolgte eine magnetresonanztomografische Untersuchung der Sehnenkonstrukte jeweils in einem 90° sowie 55° Winkel zum Hauptmagnetfeld B0 in drei Magnetresonanztomografen unterschiedlicher Feldstärken (0,27 T (Tesla), 3 T, 7 T). Dabei wurden jeweils T1- und T2*- gewichtete 3D-Gradientenechosequenzen genutzt. Im Anschluss erfolgte eine histologische Validierung der magnetresonanztomografischen Ergebnisse mittels Preußischblau-, Diamino-2-Phenylindol-Färbung (DAPI) und Hämatoxylin-Eosin-Färbung. Im Nieder- und Hochfeld-MRT 3 T konnte eine signifikante Zunahme der Signalintensität der Oberflächlichen Beugesehne in der T1- und T2*-gewichteten Sequenz mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes (Konstruktwinkelung von 55° zum Hauptmagnetfeld B0) im Vergleich zur 90° Standardwinkelung verzeichnet werden (p < 0,05). Des Weiteren konnte die Ausprägung des Magic-Angle-Effektes im 3 T-Hochfeldsystem in der T1- und T2*-gewichteten Sequenz als deutlicher beurteilt werden als im Niederfeldsystem (p < 0,05). Im 7 THochfeldsystem konnten keine signifikanten Unterschiede der Signalintensität der Oberflächlichen Beugesehne in den unterschiedlichen Sequenzen und Winkelungen der Sehnenkonstrukte zum Hauptmagnetfeld B0 gefunden werden. Die Detektion einer Zellzahl von 106 markierten MSC war sowohl im Nieder- als auch im Hochfeldsystem und sowohl in der T1- als auch in der T2*-gewichteten Sequenz mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes sicher möglich (p < 0,05). Darüber hinaus konnte im Hochfeld-MRT 7 T ebenfalls eine Zellzahl von 104 markierten MSC visuell detektiert werden. Des Weiteren konnte im Nieder- sowie 3 THochfeldsystem bei einer Zellzahl von 106 und 105 ein höheres Kontrast-Rausch-Verhältnis der T1-gewichteten Sequenzen beider Winkeltechniken gegenüber der T2*-gewichteten Sequenzen festgestellt werden. Darüber hinaus stellte sich das Kontrast-Rausch-Verhältnis beider Sequenzen mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes höher gegenüber der Standardwinkelung von 90° zum Hauptmagnetfeld B0 dar. Außerdem konnte mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes bei einer Zellzahl von 106 und 105 ein erhöhtes Kontrast-Rausch-Verhältnis in den T1- und T2*-gewichteten Sequenzen des 3 T-Hochfeldsystems gegenüber der Standardwinkelung und des Niederfeldsystems ermittelt werden. Des Weiteren konnte in beiden Systemen eine Erhöhung des Kontrast-Rausch-Verhältnisses mit steigender Zellzahl beobachtet werden. Außerdem zeigte die T1-gewichtete Sequenz mit Hilfe des Magic-Angle- Effektes sowohl im Nieder- als auch im Hochfeldsystem das höchste Kontrast-Rausch-Verhältnis. Bei der qualitativen lichtmikroskopischen Auswertung der Preußischblau-gefärbten Proben konnte in allen Zellzahlen der Nachweis Preußischblau-positiver Strukturen erbracht werden. Der Großteil dieser positiven Strukturen war innerhalb spindelförmiger Zellen lokalisiert. Darüber hinaus konnte ein signifikant höheres Volumen Preußischblau-positiver MSC bei einer Zellzahl von 106 im Vergleich zu einer Zellzahl von 104 ermittelt werden (p <0,05). Des Weiteren konnte Fluoreszenzmikroskopisch in allen markierten Proben die Präsenz Rhodamin B-positiver Zellen entlang der Schnittinzisionen nachgewiesen werden. Schlussfolgerung: Spio-markierte MSC sind in Abhängigkeit von ihrer Zellzahl im Nieder- und Hochfeld-MRT nachweisbar. Es ist eine Detektion ab einer Zellzahl von 105 im Nieder- und Hochfeld-MRT 3 T möglich. Des Weiteren ist die Visualisierung markierter MSC in einer Zellzahl von 104 in einem Hochfeld-MRT 7 T realisierbar. Darüber hinaus ist es mit Hilfe des Magic-Angle-Effektes möglich Spio-markierte MSC in gesundem Sehnengewebe im Nieder- und Hochfeldsystem zu detektieren. Als besonders geeignet konnte aufgrund des höheren Kontrast-Rausch-Verhältnisses die T1-gewichtete Sequenz ermittelt werden. Die Technik dieser Studie kann für zukünftige in-vivo-Studien zur Biodistribution von MSC und dem longitudinalen Zelltracking im Organismus von großem Nutzen sein.:1 EINLEITUNG ................................................................................................................. 1 2 LITERATURÜBERSICHT .............................................................................................. 3 2.1 Anatomie und Physiologie der Sehne am Beispiel der Oberflächlichen Beugesehne des Pferdes ......................................................................................... 3 2.1.1 Makroskopische Anatomie der Oberflächlichen Beugesehne .................................. 3 2.1.2 Struktureller Aufbau und mikroskopische Anatomie ................................................ 6 2.2 Sehnenerkrankungen ............................................................................................... 7 2.2.1 Allgemeines und Definition ...................................................................................... 7 2.2.2 Pathophysiologie ..................................................................................................... 9 2.2.3 Sehnenheilung .......................................................................................................12 2.2.4 Diagnostik von Sehnenerkrankungen .....................................................................14 2.2.5 Therapie .................................................................................................................17 2.3 Multipotente Mesenchymale Stromazellen ............................................................21 2.3.1 Allgemeines ...........................................................................................................21 2.3.2 Einsatz von MSC bei Erkrankungen der equinen Oberflächlichen Beugesehne .....23 2.3.3 Wirkmechanismus ..................................................................................................24 2.3.4 Longitudinales Zelltracking .....................................................................................25 2.4 Magnetresonanztomografie ....................................................................................28 2.4.1 Allgemeines ...........................................................................................................28 2.4.2 Physikalische Prinzipien .........................................................................................28 2.4.3 Relaxation ..............................................................................................................30 2.4.4 Bildkontrast ............................................................................................................31 2.4.5 Repetitionszeit ........................................................................................................32 2.4.6 Echozeit .................................................................................................................32 2.4.7 Darstellung von Sehnen und Bändern ....................................................................33 2.4.8 Magic-Angle-Effekt .................................................................................................34 2.4.9 Suszeptibilitätsartefakte .........................................................................................35 3 ZIELSTELLUNG UND HYPOTHESEN .........................................................................38 4 MATERIAL UND METHODEN ......................................................................................39 4.1 Übersicht Versuchsaufbau......................................................................................39 4.2 Isolation der MSC ....................................................................................................39 4.3 Zellaufbereitung .......................................................................................................40 4.3.1 Expansion der MSC ...............................................................................................41 4.3.2 Markierung der MSC ..............................................................................................41 5.6 Histologie .................................................................................................................77 5.6.1 Preußischblau-Färbung ..........................................................................................77 5.6.2 Vergleich der Volumen der Preußischblau-positiven Strukturen zum Volumen der hypointensen Artefakte im MR-Bild ........................................................................79 5.6.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung ...................................................................................84 5.6.4 Diamino-2-Phenylindol- (DAPI) -Färbung ...............................................................85 6 DISKUSSION ................................................................................................................87 6.1 Diskussion Material und Methodik .........................................................................87 6.1.1 Equine Oberflächliche Beugesehne .......................................................................87 6.1.2 Zellmarkierung und Zellviabilität .............................................................................87 6.1.3 Magnetresonanztomografie ....................................................................................88 6.1.4 Histologie ...............................................................................................................89 6.2 Diskussion Ergebnisse ...........................................................................................90 6.2.1 Magnetresonanztomografie ....................................................................................90 6.2.2 Histologie ...............................................................................................................95 6.3 Schlussfolgerung aus den Ergebnissen ................................................................95 7 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................96 8 SUMMARY....................................................................................................................98 9 LITERATURVERZEICHNIS ........................................................................................ 100 ANHANG ........................................................................................................................... 115 DANKSAGUNG ................................................................................................................. 120

Mesenchymale Stammzellen bieten eine interessante Option in der regenerativen Medizin, da sie praktisch unlimitiert verfügbar sind. Um das Verhalten von humanen MSC zu studieren, werden Untersuchungen momentan an immundefizienten Mäusen durchgeführt, deren Verwendung kostenintensiv und aufwendig ist. Fra-gestellung war, ob durch Immunisolation (Alginat, Dialyseschlauch, Diffusionskammer) die Knorpel erhaltenden -, bzw. bildenden Eigenschaften von MSC-Konstrukten ebenso gut in immunkompetenten Mäusen untersucht werden können. Gleichzeitig sollte geprüft werden, ob die mit einer Immunabschirmung einhergehende Reduktion der Zellversorgung und damit die Annäherung an die Gelenksituation ihre Mineralisierung vermindern kann und ob Mauszellen für eine Veränderung der vordifferenzierten Knorpelpellets verantwortlich sind. Hierzu wurden hBMSC chondrogen differenziert. Die Zellpellets wurden mit Alginat, dem Dialyseschlauch oder der Diffusionskammer verkapselt und parallel zu unver-kapselten Kontrollpellets subkutan in immundefiziente SCID-Mäuse sowie in immunkompetente BDF1-Mäuse implantiert. Die Explantate wurden mit Alzianblau-, Alizarinrot-, Kollagen Typ II-Färbungen, sowie einer ALU in-situ Hybridisierung mar-kiert und mittels Histologiescore doppelt blind bewertet (MannWhitneyU). Überra-schenderweise zeigten die unverkapselten Kontrollen in den BDF1-Mäusen weder Zeichen von Inflammation noch von Destruktion und 4/5 der Pellets waren auf Kol-lagen Typ-II und Alzianblau positiv. Gleichzeitig war der Grad der Mineralisierung in den BDF1-Mäusen gegenüber SCID-Mäusen reduziert (p = 0,03). Durch Alginat wurde die Mineralisierung in den BDF1 Mäusen (0/8) völlig verhindert, während in den SCID-Mäusen noch 7/8 der Pellets Kalzifizierung zeigten (p = 0,001). Die Verkapselung mit Alginat verglichen mit der Kontrolle führte in beiden Mausstämmen zu höheren Scores für Kollagen Typ II (SCID: p = 0,013, BDF1: p = 0,042) und zeigte gleichzeitig eine Reduktion der Mineralisierung (SCID: p = 0,018, BDF1: p = 0,031). In SCID-Mäusen war außerdem der Alzianblau-Wert gegenüber den Kontrollen erhöht (p = 0,003). Die Diffusionskammer erwies sich als ungeeignet, da die Pellets ihre knorpeligen Eigenschaften verloren. Durch die Verwendung des Dialyseschlauches konnte lediglich in der SCID-Maus eine Erhöhung der Kollagen Typ II (p = 0,03) und eine Reduktion der Kalzifizierung (p = 0,004) erreicht werden. Sowohl im Alginatbead in der BDF1-Maus (1/3 Spendern), als auch im Dialyseschlauch mit Kollagenmembran (2/3 Spendern) konnte eine erfolgreiche in vivo Chondrogenese durchgeführt werden. Zur Untersuchung der in vivo Stabilität knorpeliger MSC-basierter Konstrukte stellt die BDF1-Maus eine attraktive, kostengünstige Alternative mit einer gegenüber der SCID-Maus verringerten Mineralisierungsrate dar. Die in vitro gebildete knorpelige Extrazellulärmatrix erzeugt dabei bereits eine Immunisolation, welche die Transplantatdestruktion verhindert. Ob ein intaktes lymphozytäres System die Knorpelstabilität gegenüber defizienten Immunsystemen begünstigt, muss durch die Untersuchung weiterer Ansätze belegt werden. Im Gegensatz zur Diffusionskammer bietet Alginat das richtige Maß an Versorgungsreduktion, um die Stabilisierung des Knorpelphänotyps der Konstrukte zu ermöglichen.

Articular cartilage is a highly specialized, hierarchically organized tissue covering the articular surfaces of diarthrodial joints that absorbs and distributes forces upon mechanical loading and enables low-friction movement between opposing bone ends. Despite a strong resilience towards mechanical stress, once damaged cartilage is generally not regenerated due to a limited repair potential of the residing cells (chondrocytes) and the local absence of vascularized blood vessels and nerves. Eventually, this may lead to osteoarthritis, a chronic degenerative disorder of the synovial joints which has a strongly growing prevalence worldwide. Modern regenerative therapies that aim to rebuild cartilage tissue in vivo and in vitro using chondrocyte- and stem cell-based methods are still not able to produce tissue constructs with desired biomechanical properties and organization for long-term repair. Therefore, cartilage tissue engineering seeks for new ways to solve these problems. In this regard, the application of hydrogel-based scaffolding materials as artificial matrix environments to support the chondrogenesis of embedded cells and the implementation of appropriate biofabrication techniques that help to reconstitute the zonal structure of articular cartilage are considered as promising strategies for sophisticated cartilage regeneration approaches. In this thesis, a modular starPEG-heparin hydrogel platform as cell-instructive hydrogel scaffold was used in combination with a custom-designed 3D inkjet bioprinting method with the intention to develop a printable 3D in vitro culture system that promotes the chondrogenic differentiation of human mesenchymal stromal cells (hMSC) in printed cell-laden hydrogels with layered architectures in order to fabricate cartilage-like tissue constructs with hierarchical organization. Firstly, the successful bioprinting of horizontally and vertically structured, cell-free and -laden hydrogel scaffolds that exhibit layer thicknesses in the range of the superficial zone, the thinnest articular cartilage layer is demonstrated. The long-term integrity of the printed constructs and the cellular functionality of the plotted cells that generally had a high viability after the printing process are shown by a successful PDGF-BB-mediated hMSC migration assay in a printed multilayered hydrogel construct over a culture period of 4 weeks. Secondly, when the established printing procedures were applied for the chondrogenic differentiation of hMSCs, it was found that the printed cell-laden constructs showed a limited potential for in vitro chondrogenesis as indicated by a weaker immunostaining for cartilage-specific markers compared to casted hydrogel controls. In order to increase the post-printing cell density to tackle the limited printable cell concentration which was regarded as the primary reason for the impaired performance of the printed scaffolds, different conditions with varying culture medium and hydrogel compositions were tested to stimulate 3D cell proliferation. However, a significant 3D cell number increase could not be achieved which ultimately resulted in shifting the further focus to casted hMSC-laden starPEG-heparin hydrogels. Thirdly, the chondrogenic differentiation of hMSCs in casted hydrogels proved to be successful which was indicated by a uniform deposition of cartilage-specific ECM molecules comparable with the outcomes of scaffold-free MSC micromass cultures used as reference system. However, the quantitative analysis of biochemical and physical properties of the engineered hydrogel constructs yielded still significant lower values in relation to native articular cartilage tissue. Fourthly, in order to improve these properties and to enhance the chondrogenesis in starPEGheparin hydrogels, a dualistic strategy was followed. In the first part, specific externally supplied stimulatory cues including a triple growth factor supply strategy and macromolecular crowding were applied. As second part, intrinsic properties of the modular hydrogel system such as the crosslinking degree, the enzymatic degradability and the heparin content were systematically and independently altered. It was found that while the external cues showed no supportive benefits for the chondrogenic differentiation, the reduction of the heparin content in the hydrogel proved to be a key trigger that resulted in a significantly increased cartilage-like ECM deposition and gel stiffness of engineered constructs with low and no heparin content. In conclusion, this work yielded important experiences with regards to the application of inkjet bioprinting for hMSC-based cartilage tissue engineering approaches. Furthermore, the obtained data provided valuable insights into the interaction of MSCs and a surrounding hydrogel-based microenvironment that can be used for the further development of chondrosupportive scaffolding materials which may facilitate the fabrication of cartilage-like tissue constructs.

No description available.

Background: The beneficial impact of mesenchymal stem cells (MSC) on both acute and chronic liver diseases has been confirmed, although the molecular mechanisms behind it remain elusive. We aim to identify factors secreted by undifferentiated and hepatocytic differentiated MSC in vitro in order to delineate liver repair pathways potentially targeted by MSC. Methods: Secreted factors were determined by protein arrays and related pathways identified by biomathematical analyses. Results: MSC from adipose tissue and bone marrow expressed a similar pattern of surface markers. After hepatocytic differentiation, CD54 (intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1) increased and CD166 (activated leukocyte cell adhesion molecule, ALCAM) decreased. MSC secreted different factors before and after differentiation. These comprised cytokines involved in innate immunity and growth factors regulating liver regeneration. Pathway analysis revealed cytokine-cytokine receptor interactions, chemokine signalling pathways, the complement and coagulation cascades as well as the Januskinase-signal transducers and activators of transcription (JAK-STAT) and nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor (NOD-like receptor) signalling pathways as relevant networks. Relationships to transforming growth factor beta(TGF-beta) and hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF1-alpha) signalling seemed also relevant. Conclusion: MSC secreted proteins, which differed depending on cell source and degree of differentiation. The factors might address inflammatory and growth factor pathways as well as chemo-attraction and innate immunity. Since these are prone to dysregulation in most liver diseases, MSC release hepatotropic factors, potentially supporting liver regeneration.

Multipotente mesenchymale Stromazellen (MSCs) stellen nicht nur beim humanen Patienten, sondern auch in der Veterinärmedizin einen vielversprechenden Therapieansatz in der Behandlung erkrankter muskuloskelettaler Gewebe dar. Ziel der Behandlung ist dabei die Regeneration der betroffenen Strukturen im Vergleich zur Reparation nach konservativer Therapie. Vor allem im Bereich von Sehnenerkrankungen können nach MSC-Applikation vielversprechende Ergebnisse im Hinblick auf niedrigere Rezidivraten beobachtet werden. Dennoch sind noch nicht alle Umstände einer optimalen MSC-Anwendung geklärt. Hierbei sind unter anderem Fragen bezüglich der Herkunft und Gewinnung von MSCs offen, da Unterschiede von MSCs aufgrund ihrer Gewebezugehörigkeit bereits nachgewiesen wurden. Grundlegende umfassende Arbeiten zum Vergleich von equinen MSCs aus verschiedenen Quellen sowie deren mögliche Beeinflussung durch die Isolierung aus dem Gewebe lagen bislang noch nicht vor. Ziel dieser Studie war es daher, equine MSCs aus verschiedenen Quellen zu gewinnen und mögliche Unterschiede in vitro aufzuzeigen. Weiterhin sollten Unterschiede zwischen den Zelleigenschaften nach Anwendung verschiedener Isolationsprotokolle untersucht werden. In der hier vorliegenden Studie wurden MSCs aus Fett- und Sehnengewebe, Knochenmark, Nabelschnurblut und Nabelschnurgewebe von Pferden isoliert und vergleichend charakterisiert. Dabei wurden für die soliden Körpergewebe zwei unterschiedliche Isolationsmethoden, die Digestion und die Explantation, angewendet, um mögliche Einflüsse auf die gewonnen Zellen zu ermitteln. Die untersuchten Kriterien beinhalteten Zellertrag, Proliferation, Differenzierungspotenz und das Migrationsverhalten von MSCs. Hinblickend auf eine Anwendung von MSCs bei Sehnenerkrankungen wurde auch die Expression von Sehnenmarkern verglichen. In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass sich die MSCs aus verschiedenen Quellen hinsichtlich der Zellausbeute und ihres Wachstumspotentials unterschieden. Aus soliden Geweben konnten mittels Digestion im Vergleich zu Körperflüssigkeiten signifikant mehr MSCs isoliert werden (p < 0,001). Dabei erbrachte die Isolation von MSCs mittels Digestionsmethode einen deutlich höheren Zellertrag nach der Passage 0 im Vergleich zur Explantationsmethode (p < 0,05). Im weiteren Verlauf der Kultivierung zeigten MSCs aus Sehnengewebe und Fettgewebe ein signifikant besseres Proliferationsverhalten im Vergleich zu Knochenmark-MSCs und Nabelschnurblut-MSCs. Im Hinblick auf das Differenzierungspotential konnten signifikante Unterschiede zwischen den MSCs aus den verschiedenen Quellen beobachtet werden. MSCs aus Knochenmark zeigten eine sehr gute osteogene Differenzierungsfähigkeit im Vergleich zu MSCs aus den geburtsassoziierten Geweben (p < 0,05). Im Gegensatz dazu zeichneten sich diese MSCs durch eine deutlich bessere chondrogene Differenzierung im Vergleich zu Knochenmark-MSCs aus (p < 0,05). Im Hinblick auf die Isolationsmethode konnten keine Unterschiede im Differenzierungspotential beobachtet werden. Weitere Unterschiede aufgrund der Zellquelle lassen sich in der Genexpression der Sehnenmarker erkennen. MSCs aus Fettgewebe und Sehnengewebe exprimierten Kollagen 1A2 auf höchstem Niveau. Sklexaris hingegen wurde von MSCs aus Nabelschnurblut und Sehnengewebe am höchstem exprimiert. Dabei zeigten MSCs, die mittels Digestionsmethode isoliert worden waren, ein signifikant höheres Expressionslevel von Skleraxis im Vergleich zur Explantationsmethode (p < 0,05). Die Ergebnisse der vorliegenden Studie lassen einen Einfluss der Zellquelle auf die Zellcharakteristika erkennen. MSCs aus Fettgewebe stellen dabei eine vielversprechende Alternative zu Knochenmark-MSCs dar. Allerdings scheint für eine klinische Anwendung von MSCs eine selektive Auswahl der Zellquelle entsprechend der vorliegenden Erkrankung von Vorteil zu sein. Dabei ist eine Isolierung von MSCs aus soliden Geweben mittels Digestionsverfahren zu empfehlen, da hier deutlich höhere Zellzahlen gewonnen werden können. Eine negative Beeinflussung der Zelleigenschaften durch die enzymatische Digestion lässt sich nach den vorliegenden Ergebnissen nicht vermuten. Inwiefern die beobachteten Unterschiede bei in-vivo-Anwendungen von Bedeutung sind, muss jedoch noch umfassend untersucht werden. / Not only in humans but also in veterinary medicine, multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) are a promising treatment option in the therapy of injured musculoskeletal tissues. This is due to the improved tissue regeneration instead of the insufficient reparation following conventional therapies. With regard to an application of MSCs for treatment of tendinopathies in horses, lower rates of reinjury have been reported. However, further investigations to optimize the MSC treatment are still outstanding. Differences in MSCs from different origins have been already reported, but there are still remaining questions about the influence of origin and isolation procedures of MSCs. Fundamental research on equine MSCs derived from different sources and their potential impact due to the isolation process has not been published so far. The aim of this study was to isolate equine MSCs from different sources and to demonstrate potential differences in vitro. Furthermore, differences in cell features following different isolation methods were investigated. In the present study, MSCs from horses were isolated from adipose tissue, tendon tissue, bone marrow, umbilical cord blood and umbilical cord tissue and subsequently subjected to comparative characterization. In case of the solid tissues, two different isolation methods, digestion and explantation, were performed in order to analyze influences on obtained cells. Investigated cell features included cell yield, proliferation, differentiation and migration potential. Furthermore, expression of tendon markers was evaluated with regard to an application of MSCs in tendinopathies. In the present study it was shown that MSCs derived from different sources differ distinctly in cell yield and proliferation potential. In comparison to body fluids, significantly more MSCs could be isolated from solid tissues when using the digestion method (p < 0.001). Furthermore, the cell yield at first cell harvest was distinctly higher when performing the isolation by digestion in comparison to isolation by explantation (p < 0.05). With regard to further cultivation, MSCs derived from tendon tissue and adipose tissue displayed a significantly better proliferation potential compared to MSCs derived from other sources. Considering the differentiation potential, significant differences were obvious between the MSCs derived from different sources. Bone marrow-MSCs showed an excellent osteogenic differentiation capacity in comparison to MSCs derived from umbilical cord blood and tissue (p < 0.05). In contrast, the birth-associated MSCs displayed a distinctly better chondrogenic differentiation than MSCs derived from bone marrow (p < 0.05). No difference in the differentiation potential was noticeable following the different isolation procedures. Furthermore, differences in the gene expression of tendon markers were evident with regard to the cell source. MSCs derived from adipose tissue and tendon tissue expressed collagen 1A2 on the highest level. On the other hand, scleraxis was expressed highest in MSCs derived from umbilical cord blood and tendon tissue. In these cells, MSCs isolated by the digestion method showed a significantly higher expression level of scleraxis in comparison to MSCs isolated by explantation (p < 0.05). Based on the results obtained so far, a relevant impact of the source of MSCs on cell features was evident. MSCs derived from adipose tissue are a promising alternative to bone marrow-MSCs. However, with regard to a clinical application of MSCs, a selection of the MSC source depending on the respective intended use seems to be advantageous. For routine isolation of MSCs from solid tissues, the digestion method could be recommended due to the higher obtainable cell numbers. Furthermore, a negative influence of the enzymatic digestion on the cell features was not detectable. However, to what extent the observed differences in vitro are relevant for in-vivo-applications needs to be further investigated.

Das essentielle Spurenelement Selen (Se) wird als Selenocystein (Sec) in sog. Selenoproteine eingebaut. Selenoproteine haben aufgrund von Sec besondere Eigenschaften und eine Reihe von wichtigen Funktionen im Körper. Im Menschen führt starker Se-mangel zu degenerativen Knorpelerkrankungen und stellt einen Risikofaktor für die Entwicklung von Krebs, Entzündungen, kognitiven Verfall, Schlaganfall und Schilddrüsenerkrankungen dar. Hypoxie tritt ebenfalls in einer Vielzahl schwerer Erkrankungen wie Krebs, Sepsis oder Trauma auf. Auf zellulärer Ebene wird die Hypoxieantwort über Transkriptionsfaktoren der HIF-Familie („Hypoxia-Inducible Factor“) vermittelt. Die Leber ist das zentrale Organ des Selenmetabolismus. Hier wird über die Nahrung aufgenommenes Selen in organisches Sec umgewandelt und in Form von Selenoprotein P (SePP) dem Körper zur Verfügung gestellt. Die Hypothese dieser Arbeit war, dass Hypoxie die Selenoproteinbiosynthese beeinflusst. Experimentell induzierte Hypoxie führte in humanen hepatokarzinomen Zellen zu einer verminderten Expression fast aller Selenproteinen bis auf die für Überleben und Abwehr von reaktiven Sauerstoffspezies wichtige Glutathion Peroxidase 4 (GPX4), welche auch unter hypoxischen Bedingungen stabil exprimiert wurde. Diese Umverteilung von Sec, weg von der Biosynthese des sezernierten SePP hin zur intrazellulären GPX4, wurde HIF unabhängig vermittelt. Stattdessen wurden Schlüsselenzyme der Sec-Biosynthese spezifisch herunterreguliert. Mesenchymale Stammzellen (MSC) leben im Körper unter hypoxischen Bedingungen und haben aufgrund Ihrer Plastizität ein großes regeneratives Potential. In diesem Zellmodel führte nicht Hypoxie, sondern Se-Supplementation, zu einer Herunterregulation der Selenoprtoeinbiosynthese. Dieser Effekt dürfte für die Proliferationskapazität der MSC essentiell sein. In dieser Arbeit werden diese Ergebnisse vorgestellt und vor dem Hintergrund einer Studie zu Se-Spiegeln bei Patienten mit Polytrauma diskutiert. / The essential trace element Selenium (Se) is incorporated into proteins, so called selenoproteins, in form of the 21st proteinogenic amino acid selenocysteine (Sec). Due to the unique biochemical characteristics of Sec, selenoproteins fulfill a number of important functions within the body. In humans, a profound Se deficiency predisposes to a degenerative cartilage disease and moderate Se deficiency constitutes a risk factor for a variety of diseases, such as cancer, inflammation, cognitive decline, stroke or thyroid diseases. Hypoxia occurs in a number of severe illnesses, e.g. in cancer, sepsis or trauma. The cellular transcriptional response is mediated via „Hypoxia inducible factors“ (HIF). The liver is the central organ of Se metabolism, where dietary Se is organified to Sec and distributed in form of selenoprotein P (SePP) throughout the body. This thesis tested the hypothesis that hypoxia may directly affect selenoprotein biosynthesis. In human hepatocarcinoma cells, an experimentally-induced hypoxia led to a reduction of almost all selenoproteins analyzed, with the notably exception of Glutathione Peroxidase, type 4 (GPX4). The enzyme GPX4, important for neutralizing lipid hydroperoxides, remained stably expressed under hypoxic conditions. This redistribution of Sec, away from the secreted Se transporter SePP towards the intracellular protective enzyme GPX4, was HIF independent and rather a result down-regulation of key enzymes at the bottleneck of Sec biosynthesis. Mesenchymal stem cells (MSC) survive in the human body in a hypoxic niche. Due to their great plasticity, MSC have a huge regenerative potential. In this cell model, it was not hypoxia, but rather Se supply itself, which led to a coordinated down-regulation of the whole Sec biosynthesis machinery causing diminished selenoprotein biosynthesis. In this thesis these results are presented and discussed in light of a clinical trial on the importance of Se in polytraumatic patients.