Die Nicht-alkoholische Steatohepatitis (NASH), gehörig zu der Gruppe der chronischen Lebererkrankungen als eine schwere Form der Nicht-alkoholischen Fettleber-erkrankungen (NAFLD), nimmt in ihrer Prävalenz ständig zu. Gründe dafür sind u.a. eine gesteigerte Nahrungsaufnahme sowie Veränderungen der Nahrungszusammen-setzung. Es kommt zur Ausbildung einer Steatose, die sich unter Mitwirkung verschie-dener Einflussfaktoren zur Steatohepatitis weiterentwickeln kann, wobei die Pathoge-nese noch nicht genau verstanden ist. Die Nicht-alkoholische Steatohepatitis geht oft einher mit Insulinresistenz und starkem Übergewicht. Die Folgen für die Leber sind Funktionseinschränkungen und –verlust, hervorgerufen durch eine massive Akkumula-tion von Triglyzeriden in den Hepatozyten, Entzündungsprozesse sowie einem fibro-tischen Umbau der Leber. Im fortgeschritten Stadium wird eine Lebertransplantation unausweichlich, die jedoch aufgrund des zunehmenden Mangels an Spenderorganen oft nicht möglich ist. Eine Alternative bietet die Transplantation mesenchymaler Stammzellen (MSC). MSC können in vitro in leberzellähnliche Zellen differenziert wer-den und weisen dabei essentielle hepatozytäre Eigenschaften auf, wodurch sie als möglicher Ersatz bzw. als Überbrückungstherapie bis zur Lebertransplantation in Frage kommen. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit dieser Fragestellung. Dazu wur-de ein Tiermodell der NASH mittels Methionin-Cholin-defizienter Diät (MCD-Diät) etab-liert und die Transplantation von hepatozytär differenzierten MSC durchgeführt. An-hand spezifischer zellulärer und biochemischer Marker der NASH konnte die Wirkung des Zelltransplantats auf die Empfängerleber analysiert werden. Es hat sich gezeigt, dass die MSC einen anti-inflammatorischen, anti-fibrotischen und pro-proliferativen Einfluss auf das Empfängerparenchym hatten und somit zur Verbesserung der Symptomatik der NASH beitrugen.

Am Herzzentrum Leipzig konnte bereits unter Einsatz von neonatalen Kardiomyozyten ein dreidimensionales vaskularisiertes Engineered Heart Tissue (EHT) etabliert und in Rat- ten mit dilatativer Kardiomyopathie implantiert werden. In Hinblick auf einen möglichen klinischen Einsatz zur Behandlung von fortgeschrittenen kardialen Erkrankungen ist es notwendig die neonatalen Kardiomyozyten der etablierten EHTs durch eine alternative Zellsorte zu ersetzen. In der vorliegenden Arbeit wurden mesenchymale Stammzellen (MSCs) aus dem Kno- chenmark der Ratte verwendet, da sie autolog aus fast jedem Körpergewebe gewonnen werden können und somit ethisch und immunologisch unbedenklich sind. Es ist gelungen formstabile, transplantationsfähige Engineered Tissues sowohl aus selbst isolierten MSCs (sMSC-ET) als auch aus kommerziell erworbenen MSCs (cMSC-ET) herzustellen. Bereits in vitro hatten sich in den künstlich hergestellten sMSC-ETs und cMSC-ETs Mikrogefäße entwickelt. Nach Implantation der MSC-ETs um ein Rattenherz verbesserte sich deren Vas- kularisierung signifikant. Zusätzlich konnte in vivo eine De-novo-Synthese von elastischen Fasern als Zeichen eines Anpassungsprozesses nachgewiesen werden. Das Hauptziel dieser Arbeit, nämlich die kardiale Differenzierung der MSCs, wurde jedoch verfehlt. Entspre- chend diesem Ergebnis steht bis heute ein endgültiger Beweis aus, ob MSCs fähig sind sich in funktionelle echte Kardiomyozyten zu differenzieren. Überdies entwickelte sich aus einem der drei implantierten cMSC-ETs ein hochmalignes undifferenziertes pleomorphes Sarkom, welches infiltrierend in das Rattenherz einwuchs. Diese Beobachtung wurde nicht für sMSC-ETs gemacht. Bei der histologischen Analyse des pleomorphen Sarkoms zeigte sich, dass dieses keine gewebespezifischen Connexine an Stellen des invasiven Wachstums exprimierte und nahezu keine am Übergang vom Tumor- zum Herzgewebe. Gleichwohl bestand zwischen proliferativer Aktivität und Connexin- Expression eine negative Korrelation. Diese Beobachtungen unterstützen zwei bekannte Theorien. Zum einen könnte das invasive Wachstum von Tumoren durch eine gestörte bzw. fehlende Kommunikation von Gap-Junction-Kanälen zwischen Tumor- und gesunden Gewebe ermöglicht worden sein. Zum anderen könnten Connexine ihrerseits über zellge- bundene molekulare Wechselwirkungen die Tumorprogression beeinträchtigen. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass MSCs nicht für die Herstellung von artifi- ziellem Herzgewebe geeignet sind, wohl aber für die Herstellung von künstlichen Blutge- fäßsystemen. Als sinnvolle Zellalternative bieten sich induzierte pluripotente Stammzellen (IPS-Zellen) an, da deren Differenzierbarkeit zu funktionellen Kardiomyozyten glaubhaft bewiesen werden konnte. Auch IPS-Zellen bergen ein onkogenes Potential. Daher gilt es einheitliche Kontrollen und Sicherheitsmessungen in der Herstellung von pluripotenten wie auch multipotenten Stammzellen für zellbasierte Therapien zu entwickeln und verpflichtend einzuführen.

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Der Ersatz von geschädigtem Gewebe durch körpereigene Reparaturprozesse wird auf zellulärer Ebene durch Stammzellen unterstützt. Diese Regenerationsfähigkeit ist allerdings in einigen Geweben nur eingeschränkt vorhanden. So kommt es bei der Sehnenheilung des Pferdes unter konventioneller Therapie zur narbigen Reparation mit hohen Rezidivraten. Die Anwendung von multipotenten mesenchymalen Stromazellen (MSC) stellt eine innovative Therapiemethode dar, da die tenogene Differenzierung zum Zellersatz mit anschließender Matrixmodulation führen könnte. Es ist jedoch unklar, ob eine entzündliche Umgebung in diesem Zusammenhang Einfluss auf funktionelle Eigenschaften der MSC hat. In dieser Arbeit wurden erstmalig funktionelle Eigenschaften, mit dem Fokus des tenogenen Differenzierungspotentials, von aus Fettgewebe isolierten equinen MSC, unter dem Einfluss proinflammatorischer Zytokine und einer direkten Leukozyten-Ko-Kultur, untersucht. Es wurde ein komplexes In-vitro-Modell entwickelt, um die in vivo vorherrschenden Bedingungen bestmöglich zu berücksichtigen. Es konnte erstmals nachgewiesen werden, dass funktionelle und tenogene Eigenschaften von MSC in einem komplexen In-vitro-Modell unter dem Einfluss von proinflammatorischen Zytokinen oder Leukozyten beeinträchtigt werden. Dies hebt die Notwendigkeit zur Untersuchung der komplexen Zusammenhänge während einer akuten Entzündungsreaktion hervor. Es bleibt zu klären, ob trotz der starken Beeinflussung der tenogenen Eigenschaften der vorherrschende Mechanismus der Stammzell-unterstützten Sehnenheilung die tenogene Differenzierung der MSC sein kann.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Multipotente mesenchymale Stromazellen 2.1.1 Eigenschaften 2.1.2 Quellen und Charakterisierung 2.1.3 Therapeutisches Potential 2.2 Pathologie der equinen oberflächlichen Beugesehne 2.2.1 Tiermodell Pferd 2.2.2 Erkrankungen der equinen oberflächlichen Beugesehne 2.2.3 Die Bedeutung der Entzündungsreaktion 2.2.4 Die Bedeutung proinflammatorischer Zytokine und Leukozyten 2.3 Therapeutische Möglichkeiten zur Behandlung von Sehnenpathologien 2.4 Sehnen-Tissue Engineering 2.5 Induktion der tenogenen Differenzierung von MSC 2.6 Bioreaktorsysteme im Sehnen-Tissue Engineering 3 Zielstellung und Hypothesen 4 Tiere, Material und Methoden 4.1 Mesenchymale Stromazellen 4.1.1 Tiere 4.1.2 Material 4.1.3 Methoden 4.1.3.1 Auftauen von AT-MSC 4.1.3.2 Kultivierung von AT-MSC 4.1.3.3 Passagieren von AT-MSC 4.2 Equine oberflächliche Beugesehnen 4.2.1 Material 4.2.2 Methoden 4.2.2.1 Gewinnung von equinen OBS 4.2.2.2 Dezellularisierung von equinen OBS 4.2.2.3 Zuschnitt zu Sehnenscaffolds 4.3 Leukozyten 4.3.1 Spendertier 4.3.2 Material 4.3.3 Methoden 4.3.3.1 Blutentnahme 4.3.3.2 Leukozytenisolierung durch Dichtegradientenzentrifugation 4.3.3.3 Leukozytenstimulation 4.4 Versuchsaufbau 4.5 Aussaat von Scaffold- und Monolayerkulturen 4.5.1 Material 4.5.2 Methoden 4.5.2.1 Monolayerkulturen 4.5.2.2 Scaffoldkulturen 4.6 Bioreaktor 4.7 Stimulation und Stimulationsmuster 4.8 Zugabe von Zytokinen 4.9 Auswertung 4.10 Phasenkontrastmikroskopie und Zellzahlbestimmung 4.10.1 Material 4.10.2 Methoden 4.10.2.1 Automatisierte Auswerung von Aufnahmen der Phasenkontrastmikroskopie 4.10.2.2 Zellzahlbestimmung 4.11 Lebend/Tot-Färbung 4.11.1 Material 4.11.2 Methoden 4.11.2.1 Lebend/Tot-Färbung der Monolayerkulturen 4.11.2.2 Lebend/Tot-Färbung der Scaffoldkulturen 4.11.2.3 Auswertung 4.12 Histologie 4.12.1 Material 4.12.2 Methoden 4.12.2.1 Fixierung und Paraffineinbettung 4.12.2.2 Mikrotomschnitte 4.12.2.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 4.12.2.4 Auswertung 4.13 Real-Time PCR 4.13.1 Material 4.13.2 Methoden 4.13.2.1 RNA-Isolierung aus Scaffoldkulturen 4.13.2.2 Zellaufschluss der Monolayerkulturen 4.13.2.3 cDNA-Synthese durch Reverse Transkription 4.13.2.4 Real-Time PCR 4.14 Tripotente Differenzierung 4.14.1 Material 4.14.2 Methoden 4.14.2.1 Zellaussaat, Kultivierung und Fixierung 4.14.2.2 Färbung der adipogenen Differenzierung 4.14.2.3 Färbung der osteogenen Differenzierung 4.14.2.4 Färbung der chondrogenen Differenzierung 4.14.2.5 Automatische Auswertung 4.15 Statistische Auswertung 5 Ergebnisse 5.1 Morphologie, Proliferation und Konfluenz der MSC 5.2 Lebend/Tot-Färbung 5.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 5.4 Genexpression der muskuloskelettalen Marker 5.4.1 Monolayerkultur 5.4.2 Unstimulierte Scaffoldkultur 5.4.3 Stimulierte Scaffoldkultur 5.4.4 Vergleichende Analyse der Versuchsreihen 5.5 Tripotente Differenzierung 5.5.1 Adipogene Differenzierung 5.5.2 Chondrogene Differenzierung 5.5.3 Osteogene Differenzierung 6 Diskussion 6.1 Diskussion der verwendeten Methoden 6.2 Diskussion der Ergebnisse 6.3 Schlussfolgerung 7 Zusammenfassung 8 Summary 9 Literaturverzeichnis 10 Anhang 10.1 Herstellung von Reagenzien 10.2 RNA-Isolierung mittels RNeasy Mini Kit® 10.3 Färbeprotokolle 10.4 Herstellung von Silikonschalen 10.5 Extreme Ausreißerwerte der Genexpressionsanalysen 10.5.1 Monolayerkultur 10.5.2 Unstimulierte Scaffoldkultur 10.5.3 Stimulierte Scaffoldkultur Danksagung

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Articular cartilage is a highly specialized tissue which provides a lubricated gliding surface in joints and thereby enables low-friction movement. If damaged once it has a very low intrinsic healing capacity and there is still no treatment in the clinic which can restore healthy cartilage tissue. 3D biofabrication presents a promising perspective in the field by combining healthy cells and bioactive ink materials. Thereby, the composition of the applied bioink is crucial for defect restoration, as it needs to have the physical properties for the fabrication process and also suitable chemical cues to provide a supportive environment for embedded cells. In the last years, ink compositions with high polymer contents and crosslink densities were frequently used to provide 3D printability and construct stability. But these dense polymeric networks were often associated with restricted bioactivity and impaired cell processes like differentiation and the distribution of newly produced extracellular matrix (ECM), which is especially important in the field of cartilage engineering. Therefore, the aim of this thesis was the development of hyaluronic acid (HA)-based bioinks with a reduced polymer content which are 3D printable and additionally facilitate chondrogenic differentiation of mesenchymal stromal cells (MSCs) and the homogeneous distribution of newly produced ECM. Starting from not-printable hydrogels with high polymer contents and restricted bioactivity, distinct stepwise improvements were achieved regarding stand-alone 3D printability as well as MSC differentiation and homogeneous ECM distribution. All newly developed inks in this thesis made a valuable contribution in the field of cartilage regeneration and represent promising approaches for potential clinical applications. The underlying mechanisms and established ink design criteria can further be applied to other biofabricated tissues, emphasizing their importance also in a more general research setting. / Gelenkknorpel ermöglicht durch seine gleitfähige Oberfläche reibungsarme Bewegungen der Gelenke. Ist der Knorpel jedoch einmal geschädigt, kann er sich kaum selbst regenerieren und es gibt noch keine klinische Lösung, die das native Gewebe wiederherstellen kann. Ein vielversprechender Ansatz im Feld ist die 3D Biofabrikation, da sie gesunde Zellen mit bioaktiven Tintenmaterialen kombiniert. Hierbei ist die Zusammensetzung der Tinte besonders wichtig für die Funktionsweise des Konstruktes, da sie sowohl die physikalischen Voraussetzungen für den 3D Druck als auch die biologische Unterstützung für die Zellkultivierung mitbringen muss. Bisher wurden häufig Tintenzusammensetzungen mit hohen Polymergehalten und Vernetzungsdichten verwendet, um 3D-Druckbarkeit und Konstruktstabilität zu gewährleisten. Das verursachte jedoch häufig eine eingeschränkte Bioaktivität und die Beeinträchtigung von Zellprozessen wie Differenzierung und der Verteilung der neu gebildeten Extrazellulärmatrix (ECM), die insbesondere in der Knorpelregeneration von großer Bedeutung ist. Daher war das Ziel dieser Arbeit 3D-druckbare Tinten auf Hyaluronsäure (HA)-Basis mit reduziertem Polymergehalt zu entwickeln, die die chondrogene Differenzierung von mesenchymalen Stromazellen (MSCs) unterstützen und eine homogene Verteilung der neu produzierten ECM ermöglichen. Ausgehend von nicht-druckbaren Hydrogelen mit hohem Polymergehalt und eingeschränkter Bioaktivität wurde eine schrittweise Verbesserung hinsichtlich 3D-Druckbarkeit, MSC-Differenzierung und homogener ECM-Verteilung erreicht. Alle hier neu entwickelten Tinten leisten einen wertvollen Beitrag auf dem Gebiet der Knorpelregeneration mit Potenzial zur klinischen Anwendung. Die zugrunde liegenden Mechanismen und etablierten Designkriterien können weiterhin auch auf andere biofabrizierte Gewebe übertragen werden, was ihre Bedeutung auch für ein weiter gefasstes Forschungsfeld unterstreicht.

Zur Therapie von Knochendefekten, die nach Traumata, nach Infektion oder Knochennekrosen ohne das Einbringen von Knochenersatz nicht zu heilen sind, wird versucht, Knochenersatz oder Knochenersatzgewebe mit Hilfe des Tissue Engineerings zu züchten. Da eine vollständige Vaskularisation für das Einheilen großer Ersatzgewebe unabdingbar ist, wird durch verschiedene Strategien versucht eine Blutgefäßversorgung solcher Knochenersatzgewebe zu erzielen. Das Ziel dieser Arbeit ist die Generierung axial vaskularisierten Knochenersatzgewebes mit einer β-Trikalziumphosphat-Hydroxylapatitkeramik, mesenchymalen Stammzellen und BMP-2 (bone morphogenetic protein 2) im Großtiermodell des Schafes. Um das Potential zur Knochenbildung bei Verwendung einer β-Trikalziumphosphat-Hydroxylapatitkeramik mit und ohne Zugabe des Wachstumsfaktors bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) von ovinen mesenchymalen Stammzellen sowohl als direkt reimplantierte oder vorher expandierte Zellquelle zu untersuchen, wurden im ersten Teil dieser Studie die mesenchymalen Stammzellen des Schafes isoliert und durch Durchflusszytometrie auf Proteinebene und PCR-Untersuchung auf Genebene charakterisiert. Die für die Induktion der Knochenbildung nötige Konzentration von BMP-2 in Kombination mit der Knochenersatzmatrix und Fibrinkleber im Schaf wurde durch subkutane Implantation evaluiert. Nach zwölf Wochen Implantationsdauer wurden die Konstrukte mit 2,5 μg/ml, 12,5 μg/ml und 60 μg/ml BMP-2 im Fibrinkleber durch histologische Auswertung untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass für die Ausbildung von lamellärem Knochengewebe 60μg/ml BMP-2 nötig waren. Als nächster Schritt wurden zur Untersuchung des Verhaltens der mesenchymalen Stammzellen für unterschiedliche Implantationsdauern sowohl direkt reimplantierte mesenchymale Stammzellen als auch expandierte Stammzellen im subkutanen Modell des Schafes untersucht. Das Verhalten der verschieden prozessierten Stammzellen war bezüglich ihres Proliferations- und Apoptoseverhaltens, das immunhistologisch untersucht wurde, ähnlich. Das Potential zur ektopen Knochenbildung der direkt reimplantierten mesenchymalen Stammzellen alleine oder in Kombination mit 60 μg/ml BMP-2 und der expandierten mesenchymalen Stammzellen jeweils mit β-Trikalziumphosphat-Hydroxylapatitkeramik und Fibrinkleber wurde nach zwölfwöchiger subkutaner Implantation untersucht. Durch PCR-Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass in allen drei Gruppen Knochengene im Vergleich zur Kontrollgruppe mit β-Trikalziumphosphat-Hydroxylapatitkeramik und Fibrinkleber hochreguliert waren. Die quantitative histologische Auswertung ergab, dass die innerhalb der Konstrukte gebildete Knochenfläche im Vergleich zu den anderen Gruppen in den Konstrukten mit expandierten mesenchymalen Stammzellen signifikant größer war. Zur Generierung axial vaskularisierten Knochengewebes wurde das AV-Loop-Modell der Ratte auf das Schaf übertragen und das Potential von direkt reimplantierten mesenchymalen Stammzellen mit β-Trikalziumphosphat-Hydroxylapatitkeramik allein und mit der Zugabe von 60 μg/ml BMP-2 untersucht. Neben der Analyse der Vaskularisierung dieser Konstrukte durch immunhistologische und bildgebende Methoden wurde die Knochenbildung anhand histologischer Präparate quantifiziert. Die AV-Loop-Konstrukte beider Gruppen waren nach zwölfwöchiger Implantationsdauer vollständig vaskularisiert. Die für die Gruppe mit BMP-2 als Wachstumsfaktor durchgeführten intravitalen MRT-Untersuchungen zeigten, dass der Zuwachs an Gefäßen vor allem zwischen der vierten und achten Woche stattfand. Die quantitative Auswertung der neugebildeten Knochenfläche wurde semiautomatisch an histologischen Präparaten durchgeführt. In der Gruppe mit β-Trikalziumphosphat-Hydroxylapatitkeramik, direkt reimplantierten mesenchymalen Stammzellen und 60 μg/ml BMP-2 war die Knochenfläche signifikant größer als in der Gruppe ohne Wachstumsfaktor. Mit dieser Studie konnte erstmals im Großtiermodell gezeigt werden, dass mesenchymale Stammzellen nach direkter Reimplantation im subkutanen Modell und im AV-Loop-Modell zur Induktion der Knochenbildung fähig sind. Durch die Generierung axial vaskularisierten Knochenersatzgewebes im Großtiermodell des Schafes könnte es gelingen, die Größenlimitierung der durch Tissue Engineering gezüchteten Ersatzgeweben zu überwinden.

Zur Therapie von Knochendefekten, die nach Traumata, nach Infektion oder Knochennekrosen ohne das Einbringen von Knochenersatz nicht zu heilen sind, wird versucht, Knochenersatz oder Knochenersatzgewebe mit Hilfe des Tissue Engineerings zu züchten. Da eine vollständige Vaskularisation für das Einheilen großer Ersatzgewebe unabdingbar ist, wird durch verschiedene Strategien versucht eine Blutgefäßversorgung solcher Knochenersatzgewebe zu erzielen. Das Ziel dieser Arbeit ist die Generierung axial vaskularisierten Knochenersatzgewebes mit einer β-Trikalziumphosphat-Hydroxylapatitkeramik, mesenchymalen Stammzellen und BMP-2 (bone morphogenetic protein 2) im Großtiermodell des Schafes. Um das Potential zur Knochenbildung bei Verwendung einer β-Trikalziumphosphat-Hydroxylapatitkeramik mit und ohne Zugabe des Wachstumsfaktors bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) von ovinen mesenchymalen Stammzellen sowohl als direkt reimplantierte oder vorher expandierte Zellquelle zu untersuchen, wurden im ersten Teil dieser Studie die mesenchymalen Stammzellen des Schafes isoliert und durch Durchflusszytometrie auf Proteinebene und PCR-Untersuchung auf Genebene charakterisiert. Die für die Induktion der Knochenbildung nötige Konzentration von BMP-2 in Kombination mit der Knochenersatzmatrix und Fibrinkleber im Schaf wurde durch subkutane Implantation evaluiert. Nach zwölf Wochen Implantationsdauer wurden die Konstrukte mit 2,5 μg/ml, 12,5 μg/ml und 60 μg/ml BMP-2 im Fibrinkleber durch histologische Auswertung untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass für die Ausbildung von lamellärem Knochengewebe 60μg/ml BMP-2 nötig waren. Als nächster Schritt wurden zur Untersuchung des Verhaltens der mesenchymalen Stammzellen für unterschiedliche Implantationsdauern sowohl direkt reimplantierte mesenchymale Stammzellen als auch expandierte Stammzellen im subkutanen Modell des Schafes untersucht. Das Verhalten der verschieden prozessierten Stammzellen war bezüglich ihres Proliferations- und Apoptoseverhaltens, das immunhistologisch untersucht wurde, ähnlich. Das Potential zur ektopen Knochenbildung der direkt reimplantierten mesenchymalen Stammzellen alleine oder in Kombination mit 60 μg/ml BMP-2 und der expandierten mesenchymalen Stammzellen jeweils mit β-Trikalziumphosphat-Hydroxylapatitkeramik und Fibrinkleber wurde nach zwölfwöchiger subkutaner Implantation untersucht. Durch PCR-Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass in allen drei Gruppen Knochengene im Vergleich zur Kontrollgruppe mit β-Trikalziumphosphat-Hydroxylapatitkeramik und Fibrinkleber hochreguliert waren. Die quantitative histologische Auswertung ergab, dass die innerhalb der Konstrukte gebildete Knochenfläche im Vergleich zu den anderen Gruppen in den Konstrukten mit expandierten mesenchymalen Stammzellen signifikant größer war. Zur Generierung axial vaskularisierten Knochengewebes wurde das AV-Loop-Modell der Ratte auf das Schaf übertragen und das Potential von direkt reimplantierten mesenchymalen Stammzellen mit β-Trikalziumphosphat-Hydroxylapatitkeramik allein und mit der Zugabe von 60 μg/ml BMP-2 untersucht. Neben der Analyse der Vaskularisierung dieser Konstrukte durch immunhistologische und bildgebende Methoden wurde die Knochenbildung anhand histologischer Präparate quantifiziert. Die AV-Loop-Konstrukte beider Gruppen waren nach zwölfwöchiger Implantationsdauer vollständig vaskularisiert. Die für die Gruppe mit BMP-2 als Wachstumsfaktor durchgeführten intravitalen MRT-Untersuchungen zeigten, dass der Zuwachs an Gefäßen vor allem zwischen der vierten und achten Woche stattfand. Die quantitative Auswertung der neugebildeten Knochenfläche wurde semiautomatisch an histologischen Präparaten durchgeführt. In der Gruppe mit β-Trikalziumphosphat-Hydroxylapatitkeramik, direkt reimplantierten mesenchymalen Stammzellen und 60 μg/ml BMP-2 war die Knochenfläche signifikant größer als in der Gruppe ohne Wachstumsfaktor. Mit dieser Studie konnte erstmals im Großtiermodell gezeigt werden, dass mesenchymale Stammzellen nach direkter Reimplantation im subkutanen Modell und im AV-Loop-Modell zur Induktion der Knochenbildung fähig sind. Durch die Generierung axial vaskularisierten Knochenersatzgewebes im Großtiermodell des Schafes könnte es gelingen, die Größenlimitierung der durch Tissue Engineering gezüchteten Ersatzgeweben zu überwinden.

Mesenchymale Stromazellen (MSCs) werden beim Pferd bereits mit vielversprechenden Ergebnissen zur Behandlung von muskuloskelettalen Erkrankungen, insbesondere von Sehnenerkrankungen, eingesetzt. In bisherigen klinischen Studien lag das Hauptaugenmerk auf der Behandlung von Erkrankungen der Oberflächlichen Beugesehne bei Rennpferden, die jedoch in Deutschland nur einen verhältnismäßig kleinen Anteil des Patientenaufkommens darstellen. Die zu erwartenden Ergebnisse nach MSC-Behandlung von Fesselträgererkrankungen sind dagegen noch nicht bekannt. Darüber hinaus sind die grundlegenden Kenntnisse zur Biologie equiner MSCs noch unzureichend, was Verständnis und Optimierung des bestehenden Therapiekonzeptes erschwert. Häufig wird die Verwendung alternativer Gewebequellen für MSCs diskutiert, wobei jedoch nur wenige vergleichende Daten zu den jeweiligen zellulären Eigenschaften vorliegen. Ziel dieser Arbeit war es daher, zum einen mehr Kenntnisse über die zu erwartenden klinischen Ergebnisse nach MSC-Behandlung von Sehnenerkrankungen zu erlangen, einschließlich Erkrankungen des Fesselträgers, zum anderen den Wissensstand hinsichtlich der in-vitro-Charakterisierung equiner MSCs zu erweitern, wobei ein Vergleich klinisch relevanter Charakteristika zwischen MSCs aus verschiedenen Gewebequellen angestrebt wurde. In die klinische Studie wurden 98 Pferde, die aufgrund von Sehnen- und Banderkrankungen mit MSCs behandelt worden waren, einbezogen. Von 58 dieser Tiere konnten Langzeitergebnisse nach einem Beobachtungszeitraum von mindestens einem Jahr erhoben werden. Diese wurden hinsichtlich des Behandlungserfolges sowie möglicher Einflussfaktoren ausgewertet, wobei die Behandlung als erfolgreich bewertet wurde, wenn die Patienten nach dem Beobachtungszeitraum voll trainiert oder im Sport eingesetzt werden konnten und dabei kein Rezidiv aufgetreten war. Die Behandlung mit MSCs wurde bei 84,5 % der Pferde als erfolgreich eingestuft, wobei Erkrankungen der Oberflächlichen Beugesehne mit 84,2 % und Erkrankungen des Fesselträgers mit 83,3 % gleichermaßen gute Ergebnisse zeigten. Tendenziell beeinflussten Nutzungsdisziplin, Erkrankungsstadium und Patientenalter das klinische Ergebnis ebenso wie bei konventioneller Behandlung. Insgesamt war nach MSC-Behandlung das Auftreten von Rezidiven deutlich seltener zu beobachten als in der Literatur für die konventionelle Behandlung beschrieben wird. Für die in-vitro-Studie zur vergleichenden Charakterisierung equiner MSCs aus verschiedenen Quellen wurden Knochenmark, Fett- und Sehnengewebe sowie Nabelschnurblut und -gewebe gewonnen. Aus diesen Proben wurden jeweils die plastikadhärenten MSCs isoliert und hinsichtlich Zellausbeute, Proliferations- und Migrationseigenschaften, tripotentem Differenzierungspotential sowie der Expression der Sehnenmarker Kollagen 1A2 und Skleraxis vergleichend untersucht. Die Ausbeute an MSCs war bei allen soliden Geweben (Fett-, Sehnen-, und Nabelschnurgewebe) hochsignifikant höher (p < 0,001). Ebenso proliferierten MSCs aus Fett- und Sehnengewebe signifi-kant schneller als MSCs aus Knochenmark oder Nabelschnurblut (p < 0,01). Von letzteren wurden darüber hinaus etwa drei viertel aller Zellkulturen vor der achten Passage seneszent. Das höchste Migrationspotential zeigten wiederum MSCs aus Sehnen- und Fettgewebe, wobei hier MSCs aus Nabelschnurgewebe das ungünstigste Ergebnis erzielten (p < 0,01). Die adipogene Differenzierung gelang bei MSCs aus allen Quellen vergleichbar gut. Bei der osteogenen Differenzierung erreichten MSCs aus Knochenmark das beste Ergebnis, während MSCs aus Nabelschnurblut und –gewebe nur schwach osteogen differenzierten (Tag 21: p < 0,01; Tag 35: p < 0,05). Im Gegensatz dazu erreichten MSCs aus Nabelschnurblut bei der chondrogenen Differenzierung die meisten Scorepunkte, MSCs aus Knochenmark dagegen die wenigsten (p < 0,05). Kollagen 1A2 wurde von MSCs aus Fettgewebe am höchsten exprimiert, Skleraxis von MSCs aus Nabelschnurblut. MSCs aus Sehnengewebe exprimierten beide Sehnenmarker auf fast ebenso hohem Level. MSCs aus Knochenmark dagegen zeigten hier jeweils die niedrigste Expression (p < 0,05 für Kollagen 1A2). Basierend auf den Ergebnissen der klinischen Studie ist die MSC-Therapie nach wie vor als vielversprechende Behandlungsoption für Sehnenerkrankungen anzusehen und ist auch für die Behandlung von Fesselträgererkrankungen geeignet. Zukünftige, kontrollierte klinische Studien müssen jedoch die Wirksamkeit der MSC-Therapie noch weitergehend bestätigen. Die in-vitro-Studie zeigte signifikante Unterschiede zwischen equinen MSCs aus verschiedenen Quellen auf, die bei der Auswahl einer Gewebequelle für die MSC-Isolierung für klinische Anwendungen berücksichtigt werden sollten. MSCs aus Fettgewebe erscheinen aufgrund ihrer sehr guten Proliferations- und zuverlässigen Differenzierungseigenschaften als eine gute Alternative zu MSCs aus Knochenmark für autologe Therapien. MSCs aus Sehnengewebe sind den hier vorliegenden Ergebnissen zufolge besonders gut für die Behandlung von Sehnenerkrankungen geeignet; vor einer routinemäßigen Anwendung dieser MSCs sollten jedoch ihre Eigenschaften weiterführend untersucht werden. / In horses, mesenchymal stromal cells (MSCs) are used for the treatment of musculoskeletal diseases, especially tendon injuries, with promising results. Previous clinical studies mainly focused on the treatment of superficial digital flexor tendon injuries in racehorses, which, however, represent only a relatively small percentage of the overall equine case load in Germany. Average outcome to be expected following MSC treatment of suspensory ligament injuries was not yet determined. Moreover, basic knowledge on equine MSC biology is still deficient, hampering the understanding and thus the optimisation of the existing treatment regime. The use of alternative MSC sources is frequently discussed, yet to date, only few data comparing the cellular properties of equine MSCs from different sources have been published. The aim of this study was, on the one hand, to gain more knowledge concerning the expected outcome after MSC treatment of tendon injuries, including injuries to the suspensory ligament. On the other hand, it was aimed at expanding the knowledge on equine MSC characterisation in vitro, thereby focusing on the comparison of clinically relevant properties of MSCs derived from different sources. In the clinical study, 98 horses were included, all of which had received MSC treatment for tendon or ligament injuries. In 58 of these horses, long term results after a follow-up period of at least one year could be collected. These data were analysed with respect to treatment outcome and potential influencing factors. Treatment was considered successful when horses were back to full training or competition after the follow-up period, without having suffered a re-injury. The overall success rate was 84.5 %. Success rates in horses suffering from superficial digital flexor tendon injuries and in horses suffering from suspensory ligament injuries were comparably good (84.2 % and 83.3 %, respectively). Similar to conventional therapies, the sports discipline in which the horses performed, age and disease stage tended to influence the outcome. Overall, re-injury rates after MSC treatment were considerably lower than those described in the literature following conventional treatment. For the comparative characterisation of MSCs from different sources in vitro, samples of bone marrow, adipose and tendon tissue, as well as umbilical cord blood and –tissue were collected. Plastic-adherent MSCs were isolated out of these samples and comparatively characterised focusing on cell yields, proliferation and migration properties, trilineage differentiation potential and the expression of the tendon markers collagen 1A2 and scleraxis. MSC yields were significantly higher in all solid tissues (adipose, tendon and umbilical cord tissue) (p < 0.001). Further, MSCs from adipose and tendon tissue proliferated significantly faster than MSCs from bone marrow or umbilical cord blood (p < 0.01). Moreover, approximately three quarters of the samples derived from the latter sources underwent senescence before reaching passage eight. The highest migration potential was found in MSCs derived from tendon and adipose tissue again, while MSCs from umbilical cord tissue showed the least (p < 0.01). The adipogenic differentiation potential was comparably good in MSCs from all different sources. The osteogenic differentiation was most distinct in MSCs from bone marrow, while MSCs from umbilical cord blood and tissue showed only weak evidence of differentiation (day 21: p < 0.01; day 35: p < 0.05). In contrast, following chondrogenic differentiation, MSCs from umbilical cord blood scored highest and MSCs from bone marrow scored lowest (p < 0.05). Collagen 1A2 was most highly expressed in MSCs from adipose tissue, highest scleraxis expression levels were found in MSCs from umbilical cord blood. MSCs from tendon tissue, however, expressed both markers at almost evenly high levels. Contrastingly, lowest expression levels of both markers were found in MSCs derived from bone marrow (p < 0.05 for collagen 1A2). Based on the results of the clinical study, MSC therapy can still be considered a very promising treatment option for tendon diseases and is also a suitable treatment for suspensory ligament injuries. In the future, controlled clinical studies will have to further confirm the efficacy of this treatment regime. The in-vitro-study showed significant differences between equine MSCs derived from different sources, which should be considered when choosing a MSC source for clinical applications. For autologous therapies, MSCs derived from adipose tissue appear to be a good alternative to MSCs derived from bone marrow, due to their remarkable proliferation and reliable differentiation capacities. Furthermore, according to this study, MSCs derived from tendon tissue are especially suitable for treating tendon injuries. Prior to routine clinical applicability of these MSCs, however, their properties should be further investigated.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die biologische Charakterisierung neuartiger nanostrukturierter und für die Knochenregeneration geeigneter Calciumphosphatzemente (CPC). Hierzu wurde ein aus α-Tricalciumphosphat, Calciumhydrogenphosphat, gefälltem Hydroxylapatit und Calciumcarbonat bestehender CPC verwendet, der mit den Biomolekülen Cocarboxylase, Glucuronsäure, Weinsäure, Glucose-1-phosphat, Arginin, Lysin und Asparaginsäure-Natriumsalz modifiziert wurde. Ermittelt wurde dabei der Einfluss der Modifikationen auf die Proteinadsorption und die Biokompatibilität. In Vorversuchen wurden die Zementmodifikationen hinsichtlich ihrer Bindungskapazität für humane Serumproteine und für das knochenspezifische Protein Osteocalcin (OC) sowie hinsichtlich ihrer Eignung für die Adhäsion, Proliferation und osteogene Differenzierung von humanen fötalen Osteoblasten (hFOB 1.19) und humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) untersucht. Dabei erwiesen sich die Modifikationen mit Cocarboxylase, Arginin und Asparaginsäure-Natriumsalz als besonders günstig. Mit diesen „Favoriten“ erfolgte eine detailliertere Analyse der Adsorption humaner und boviner Serumproteine sowie der knochen-spezifischen Proteine Osteocalcin, BMP-2 und VEGF. Dabei führte sowohl der Zusatz von Cocarboxylase, als auch der von Arginin und Asparaginsäure-Natriumsalz zu einer erhöhten Adsorption von Serumproteinen. Die Bindungsaffinität des Basiszements gegenüber Osteocalcin, BMP-2 und VEGF konnte durch Funktionalisierung mit Arginin gesteigert werden. Während die Modifizierung mit Cocarboxylase nur die VEGF-Adsorption förderte, bewirkte der Zusatz von Asparaginsäure-Natriumsalz eine Erhöhung der Osteocalcin- und BMP-2-Adsorption. Bedingt durch die größere spezifische Oberfläche der noch nicht abgebundenen Zemente, war die Menge adsorbierter Proteine auf frisch hergestellten Zementproben im Vergleich zu abgebundenen und ausgehärteten Zementen signifikant höher. Die Eignung der ausgewählten Zementvarianten als Knochenersatzmaterialien wurde mithilfe humaner mesenchymaler Stammzellen zweier verschiedener Spender getestet. Bei Verwendung abgebundener und ausgehärteter Zemente waren die hMSC in der Lage, auf allen Modifikationen zu adhärieren, zu proliferieren und in die osteogene Richtung zu differenzieren. Eine vorherige Inkubation der Zementproben mit humanem Serum förderte dabei vor allem die Zelladhäsion. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass hMSC im Gegensatz zu anderen Studien auch auf frisch hergestellten Zementproben adhärieren, proliferieren und differenzieren können. Die Modifizierung des Basiszements mit Cocarboxylase führte hierbei zu einer gegenüber den anderen Modifikationen signifikant erhöhten Zelladhäsion und -vitalität. Neben den verschieden modifizierten Pulver/Flüssigkeitszementen wurden im Rahmen dieser Arbeit neuartige ready-to-use Zementpasten untersucht. Diese zeigten allerdings im Vergleich zu den herkömmlichen Zementen eine geringere Proteinbindungsaffinität. HMSC, die auf den Pastenzementen kultiviert wurden, war es wiederum möglich zu adhärieren, zu proliferieren und den osteoblastenspezifischen Marker Alkalische Phosphatase zu exprimieren. Hinsichtlich ihrer Biokompatibilität sind sie damit vergleichbar zu den herkömmlichen Pulver/Flüssigkeitszementen.