Thesis (doctoral)--Lund University, 1998. / Added t.p. with thesis statement inserted. Includes bibliographical references.

Thesis (Ph. D.)--West Virginia University, 2000. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains xi, 126 p. : ill. Vita. Includes abstract. Includes bibliographical references (p. 93-115).

Thesis (doctoral)--Lund University, 1998. / Added t.p. with thesis statement inserted. Includes bibliographical references.

Studies reported in this thesis address the question of how pre-termination ribosomal complexes stalled during translation of mRNA are recycled. The process of recycling of the stalled ribosomes involves many translational factors. During the course of my studies, I have uncovered new roles of SsrA (tmRNA), IF3 and ribosome recycling factor (RRF) in recycling stalled ribosomes. These findings are summarized as follows: (i) A physiological connection between tmRNA and peptidyl-tRNA hydrolase functions in Escherichia coli The bacterial ssrA gene codes for a dual function RNA, tmRNA, which possesses tRNA-like and mRNA-like regions. The tmRNA appends an oligopeptide tag to the polypeptide on the P-site tRNA by a trans-translation process that rescues ribosomes stalled on mRNAs and targets the aberrant protein for degradation. In cells, processing of the stalled ribosomes is also pioneered by drop-off of peptidyl-tRNAs. The ester bond linking the peptide to tRNA is hydrolyzed by peptidyl-tRNA hydrolase (Pth), an essential enzyme, which releases the tRNA and the aberrant peptide. As the trans-translation mechanism utilizes the peptidyl-transferase activity of the stalled ribosomes to free the tRNA (as opposed to peptidyl-tRNA drop-off), the need for Pth to recycle such tRNAs is bypassed. Thus, we hypothesized that tmRNA may rescue a defect in Pth. The findings of the experiments detailed in this thesis show that SsrA rescues a defect in Pth by reducing the peptidyl-tRNA load on Pth. (ii) Evidence for a role of initiation factor 3 in recycling ribosomal complexes stalled on mRNAs in Escherichia coli. Specific interactions between ribosome recycling factor (RRF) and EF-G mediate disassembly of post-termination ribosomal complexes for new rounds of initiation. The interactions between RRF and EF-G are also important in peptidyl-tRNA release from pre-termination complexes. Unlike the post-termination complexes (harboring tRNA), the pre-termination complexes (harboring peptidyl-tRNA) are not recycled by RRF and EF-G in vitro, suggesting participation of additional factor(s) in the process. Using a combination of biochemical and genetic approaches, we show that, 1. Inclusion of IF3 with RRF and EF-G results in recycling of the pre-termination complexes; 2. IF3 overexpression in Escherichia coli LJ14 rescues its temperature sensitive phenotype for RRF; (3) Transduction of infC135 (encoding functionally compromised IF3) in E. coli LJ14 generates a ‘synthetic severe’ phenotype; (4) The infC135 and frr1 (a promoter down RRF gene) alleles synergistically rescue a temperature sensitive mutation in peptidyl-tRNA hydrolase in E. coli; and (5) IF3 facilitates ribosome recycling by Thermus thermophilus RRF and E. coli EFG in vivo and in vitro. These lines of evidence clearly demonstrate the physiological importance of IF3 in the overall mechanism of ribosome recycling in E. coli. (iii) The role of RRF in dissociating of pre-termination ribosomal complexes stalled during elongation Translating ribosomes often stall during the repetitive steps of elongation for various reasons. The stalled ribosomes are rescued by the process of trans-translation involving tmRNA (SsrA) or by a factor mediated dissociation of the stalled ribosome into its subunits leading to the drop-off of the peptidyl-tRNA. The mechanistic details of how the factor mediated dissociation is carried out, is not well studied. Studies described in the above section have highlighted the role of RRF in dissociating stalled pre-termination complexes. However, the in vivo studies in this area have been limited for lack of defined pre-termination complexes. Two in vivo systems based on translation of AGA minigene and the ung gene (EcoUngstopless) transcripts were designed. Evidence is presented to show that translation of both of these transcripts is toxic to E. coli because of the accumulation of the transcript specific stalled pre-termination complexes. Availability of these model systems has allowed us to address the role of RRF in dissociating stalled ribosomes. We show that RRF rescues stalled ribosomes on these constructs and its overexpression can rescue the toxicity. The physiological importance of this observation is highlighted by the rescue of AGA minigene inhibitory effect on λimmP22 hybrid phage growth upon RRF overexpression.

Orientador: Michel Georges Albert Vincentz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T12:39:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Duarte_GustavoTurqueto_D.pdf: 11219627 bytes, checksum: b885f7a08525b694c5783c91f122c6c1 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: As plantas, sendo organismos sésseis, desenvolveram um conjunto de mecanismos que possibilitam a adaptação a condições ambientais adversas visando à manutenção da homeostase energética para o desenvolvimento e propagação. Tais respostas valem-se da integração entre a biossíntese de hormônios, ativação de vias gênicas de resposta a estresse e um balanço adequado do uso da energia disponível. Os açúcares, além de serem fontes de carbono e energia, também atuam como moléculas sinalizadoras podendo agir conjuntamente com sinais hormonais na adaptação a estresses bióticos e abióticos e no controle do desenvolvimento. Nesse contexto, diversos estudos apontam para uma importante relação entre o ácido abscísico (ABA), um dos principais hormônios relacionados à resposta a estresses, e a glicose. A sinalização por ABA, além de atuar sobre a regulação da transcrição, é conhecida por envolver fatores de controle de estabilidade do RNAm. Contudo, a participação destes mecanismos em respostas mediadas por glicose ainda é pouco explorada. Num primeiro momento, o presente trabalho visou avaliar o potencial das participações de regulações pós-transcricionais em resposta a ABA e glicose em Arabidopsis thaliana, através da determinação do perfil de expressão de RNAm após a inibição da transcrição. Um modelo experimental com condições de inibição de transcrição otimizadas foi estabelecido e utilizado para análise de transcriptoma por microarranjos CATMA em resposta à glicose e ABA. Um total de 962 genes foi identificado como diferencialmente expresso após os tratamentos, sugerindo uma possível regulação pós-transcricional por glicose sobre 204 transcritos, por ABA sobre 245 e pela combinação dos dois sinais sobre 513 transcritos. Esses genes foram classificados de acordo com o Gene Ontology, sugerindo uma relação importante com respostas adaptativas a condições de estresse. Aparentemente, as respostas mediadas por glicose e ABA seguem estratégias opostas, sendo que as respostas pós-transcricionais por ABA podem também atuar como um mecanismo rápido de retro-regulação negativa sobre a via central de sinalização desse hormônio, uma forma de dessensibilizar e reiniciar as respostas da via. Na segunda parte deste trabalho, levando em consideração as evidências do envolvimento do controle de estabilidade de RNAm na sinalização por glicose, foi avaliada a participação da via de regulação por microRNAs (miRNAs) em respostas mediadas por esses sinal durante os estágios iniciais de desenvolvimento da planta. Os mutantes ago1-25 e hyl1-2, deficientes em atividade e biossíntese de miRNAs, respectivamente, apresentaram hipossensibilidade à glicosedurante um determinado período do desenvolvimento da planta, entre a germinação e o estabelecimento. Tal resultado levanta a possibilidade de que a via dos miRNAs participa do atraso do desenvolvimento mediado por glicose. Visando compreender quais miRNAs poderiam estar envolvidos, análise de expressão em larga escala por reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR) de 200 precursores de miRNAs (pri-miRs) em resposta a glicose foi conduzida, apontando para uma potencial regulação sobre 38 deles, vários dos quais já são conhecidos por participarem direta ou indiretamente do controle de desenvolvimento da planta. Aparentemente, a deficiência na maquinaria de miRNAs leva a um desbalanço nas regulações de genes responsivos à glicose durante os primeiros estágios de desenvolvimento / Abstract: Plants, as sessile organisms, have developed a set of mechanisms that allow efficient adaptation to adverse environmental conditions. These processes rely on the integration of hormone biosynthesis, activation of stress-responsive pathways and on a balanced use of the available energy. Sugars, besides their role as carbon and energy sources, may also function as signaling molecules that may act together with hormonal signals to trigger adaptive responses to biotic and abiotic stresses. In this context, several studies have indicated an important relation between abscisic acid (ABA), one of the major hormones related to abiotic stresses responses, and glucose. ABA signaling, besides its function over transcription control, is known to involve factors regulating the stability of mRNAs. However, the importance of glucose-mediated mRNA decay control is essentially unknown. Our work intended to evaluate the potential of the participation of post-transcriptional regulations in response to ABA and glucose in Arabidopsis thaliana, by determining mRNA profile alteration in response to these signals after transcription inhibition. An experimental model which optimizes the conditions for transcription inhibition was established and used for transcriptome profiling with CATMA microarrays. A total of 962 genes were found to be differentially expressed after the treatments, suggesting a possible post-transcriptional control acting upon 204, 245 and 513 transcripts in response to glucose, ABA and the combination glucose + ABA, respectively. The genes were classified by their functions according to Gene Ontology, suggesting a close relation with adaptive response to stress conditions. Apparently, ABA- and glucose-mediated control of mRNA stability follows two opposite strategies, while ABA post-transcriptional responses may also act as a fast negative feedback mechanism over its own core signaling pathway, as a way to desensitize and reset the pathway responses. The second part of this work focused on the participation of microRNAs (miRNAs) pathway in responses mediated by glucose during plant early developmental stages. The mutants ago1-25 and hyl1-2, which are deficient in miRNA activity and biogenesis, respectively, showed hyposensitivity to glucose during a narrow time window of early plant development, between germination and seedling establishment. Such result raises the possibility that miRNA pathway may be involved in the glucose-mediated delay of early seedling development. To obtain further evidences about which miRNAs could be involved, the expression profile of 200 pri-miRs was evaluated by large-scale quantitative real-timepolymerase chain reaction (qRT-PCR) profiling, indicating that 38 pri-miRNA are potentially regulated by glucose, several of which are known to participate directly or indirectly in plant development. The data indicate that deficiency in miRNA machinery leads to an imbalance on glucose control over gene expression during early seedling development / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

L’expression des gènes chez les organismes eucaryotes est un processus hautement régulé dans l’espace et dans le temps. Les ARN messagers, premièrement décrits comme simples intermédiaires entre l’ADN et les protéines, s’avèrent être des éléments centraux de la régulation de l’expression génique :les régulations post-transcriptionnelles vont influencer la stabilité, la traductibilité et la localisation des ARN messagers (ARNm). Le contrôle de la dégradation des ARNm est un moyen efficace d’adapter rapidement la production des protéines en fonction des besoins de la cellule. La dégradation des ARNm est un processus actif qui nécessite soit l’élimination de la coiffe en 5’ ou de la queue polyA en 3’, soit un clivage endonucléolytique. Dans la plupart des cas, le messager est premièrement déadénylé, puis décoiffé avant d’être dégradé dans le sens 5’-3’ ou dans le sens 3’-5’. De plus, les ARNm en cours de dégradation sont relocalisés dans des granules cytoplasmiques appelés Processing Bodies où les facteurs de la dégradation sont concentrés. On trouve dans les messagers codant pour des protéines dont la production doit être finement régulée, une variété importante d’éléments régulateurs (éléments cis) le plus souvent au sein de leur région 3’ non traduite. La régulation de la stabilité d’ARNm porteurs d’éléments riches en adénine et uridine (ARE) dans leur région 3’ non traduite (3’UTR) par les protéines capables de reconnaitre et lier ces éléments (ARE-BP) constitue un des exemples les plus documentés de régulations post-transcriptionnelles de l’expression des gène, mais le mécanisme moléculaire de cette régulation est encore mal compris.<p>Nous avons utilisé le messager codant pour le peptide antimicrobien CécropineA1 lié par l’ARE-BP dTIS11 comme modèle pour étudier les régulations post-transcriptionnelles dépendantes des ARE chez la drosophile. Au cours de ce travail, nous avons démontré que le messager CecA1 subit une déadénylation biphasique. En effet, une déadénylation initiale racourcie la queue polyA sans diminuer la quantité de messager, puis une seconde déadénylation, prise en charge par le complexe de déadénylation CCR-NOT nécessite la présence de la protéine dTIS11 et conduit à la dégradation totale du transcrit. L’observation des intermédiaires de la dégradation nous montre que, après sa déadénylation totale, le messager est décoiffé, puis dégradé dans les deux directions: 3’-5’ et 5’-3’. Contrairement à ce qui a été montré pour ces homologues mammifères, la protéine dTIS11 n’induit pas l’accumulation du messager CecA1 dans les Processing Bodies mais favorise la deuxième phase de déadénylation alors que le messager CecA1 est associé à la machinerie de traduction afin d’induire une dégradation rapide et efficace du transcrit.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Introduction<p><p>Avec plus de 7000 cas diagnostiqués par an en Belgique, le cancer bronchique est l’un des cancers les plus fréquents chez l'homme. Son pronostic est très réservé, la survie à 5 ans tous stades confondus étant inférieure à 15 %. Ce faible taux de guérison s’explique en grande partie par le fait que le diagnostic se réalise généralement à un stade avancé de la maladie. Une méthode de détection précoce, l’endoscopie en autofluorescence, exploite des variations de la fluorescence bronchique sous l'effet d'un laser et permet ainsi de dévoiler des lésions précancéreuses invisibles en lumière blanche. Réalisée à l’Institut Jules Bordet depuis 1996, la photodétection nous a permis de constituer une banque de biopsies d’épithélium bronchique à tous les stades de la carcinogenèse bronchique, conservées initialement en blocs paraffinés et, depuis 2003, par congélation. <p><p>Hypothèse<p><p>Nous avons émis l’hypothèse que la compréhension de la genèse du carcinome épidermoïde bronchique par la caractérisation de l’évolution des anomalies moléculaires dans les lésions précancéreuses et cancéreuses de l'arbre bronchique nous permettrait d’identifier de nouvelles cibles de détection et éventuellement de chimioprévention pour le cancer bronchique. L'objectif de nos travaux a donc été de caractériser les modifications moléculaires successives et/ou cumulatives sous-jacentes à la transition entre les différents stades histologiques de la carcinogenèse épidermoïde bronchique (épithélium bronchique normal du fumeur, hyperplasie, métaplasie, dysplasies légère, modérée et sévère, CIS et les carcinomes invasifs). Différentes techniques complémentaires ont été successivement utilisées à cet effet :1) étude de l’expression protéique par immunohistochimie (IHC) et immunofluorescence (IF), 2) étude de l’expression des ARNs messagers par microdamiers, 3) étude de l’expression des microARNs par RT-PCR quantitative.<p><p>Travaux réalisés<p><p>Afin de sélectionner les protéines à étudier aux différents stades de la carcinogenèse épidermoïde bronchique, nous avons réalisé une étude méthodologique de la littérature chez les patients atteints de cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC). En effet, d’une part, la petite taille des biopsies bronchiques que nous projetions d’étudier et, d’autre part, le faible taux de découvertes de lésions de haut grade lors de la réalisation de bronchoscopies en fluorescence limitent le nombre d’analyses réalisables. Les revues systématiques de la littérature, intégrant une analyse méthodologique des études publiées et une méta-analyse de leur impact pronostique en terme de survie, ont permis de choisir une série de marqueurs sur base de leur intérêt potentiel grâce à la puissance apportée par l’agrégation de grands nombres de cas. <p><p>La mutation de KRAS identifiée par PCR constitue un facteur péjoratif pour la survie des patients atteints de CBNPC et plus spécifiquement des adénocarcinomes (ADC). Etant donné que notre projet est consacré à la genèse du carcinome épidermoïde bronchique (CEB), nous n’avons pas étudié ce facteur dans nos biopsies. <p><p>Par contre, les revues systématiques ont montré un impact en terme de survie dans les CBNPC, y compris dans les CEB, pour l’angiogenèse, des récepteurs de facteurs de croissance épithéliale (EGFR et c-erbB-2) et des marqueurs de la prolifération cellulaire (Ki-67). Nous avons donc étudié l’expression de ces protéines par IHC dans les lésions précurseurs de CEB et dans les CEB. L’expression de Ki-67 est augmentée aux stades de dysplasie sévère et de CIS par rapport à ceux de dysplasies légère et modérée. La mesure de l’expression de Ki-67 dans ces biopsies aide donc à les classifier en lésions de bas et de haut grade. L’étude de la corrélation de l’expression de plusieurs protéines (EGFR, c-erbB-2 et Ki-67) dans les mêmes lésions bronchiques a montré que la majorité des biopsies de haut grade (dysplasies sévères et CIS) expriment anormalement EGFR et/ou Ki-67. Par contre, l’homologue d’EGFR, c-erbB-2, n’apparaît que plus tardivement, dans les carcinomes invasifs. <p><p>Nous avons également caractérisé l’expression de protéines impliquées dans les voies de l'apoptose dans les lésions précurseurs de CEB. L’expression du facteur suppresseur de tumeurs p53 s’est avérée être un marqueur pronostique péjoratif important pour la survie des patients atteints de CNBPC et augmente dès les premières étapes de la tumorigenèse bronchique et même déjà dans l’épithélium morphologiquement normal du fumeur. L'altération de l'expression de p53 est donc un événement très précoce dans la genèse du CEB et la positivité de p53 augmente ensuite avec la sévérité des lésions. Dans le but de caractériser les voies de contrôle de p53 au cours de la carcinogenèse épidermoïde bronchique, nous avons analysé l'expression de 3 autres protéines, MDM2, p14arf et la nucléophosmine (NPM), dans une série de 200 biopsies. L’expression de MDM2, NPM et p14arf est respectivement altérée aux stades de dysplasie légère, modérée et sévère. Au stade de dysplasie sévère, l’expression de p14arf, inhibiteur de MDM2, peut soit disparaître, soit se concentrer dans les nucléoles. Tant la perte de p14arf que sa concentration dans les nucléoles sont associées à une augmentation de l’expression de MDM2. Nous avons également observé que la délocalisation de NPM depuis le nucléoplasme vers le nucléole est hautement corrélée à celle de p14arf. En IF, NPM et p14arf colocalisent dans le nucléoplasme dans les échantillons de bas grade ou dans les nucléoles dans les lésions de haut grade. Par contre, la protéine MDM2 n’est détectée dans les nucléoles quelles que soient les localisations de p14arf ou de NPM et quel que soit le stade. Ces données sont en faveur de l’hypothèse selon laquelle la localisation de p14arf dans les nucléoles empêcherait la formation des complexes p14arf–MDM2 et pourrait ainsi faciliter la carcinogenèse pulmonaire. Nos résultats suggèrent également que la présence de NPM dans le nucléoplasme pourrait jouer un rôle protecteur contre le dommage cellulaire et la transformation maligne tandis que sa délocalisation vers les nucléoles et ce, peut-être par la délocalisation de p14arf, favoriserait la carcinogenèse bronchique. Enfin, suite à la réalisation d’une méta-analyse montrant le rôle de la cyclooxygénase 2 (COX-2) en tant que facteur pronostique dans les CBNPC de stade précoce, l’expression de la protéine COX-2 a été analysée par IHC dans 106 biopsies. Cette étude montre que cette protéine s’accumule exclusivement à partir du stade de dysplasie sévère, permettant ainsi de séparer les lésions bronchiques de bas et de haut grade. Avec une haute valeur prédictive positive (100 %) et une bonne valeur prédictive négative (82,35 %), COX-2 apparaît donc comme un marqueur précoce potentiel à tester pour le dépistage du cancer bronchique.<p><p>En parallèle à ces travaux, nous avons collecté des biopsies fraîchement congelées aux différents stades de la carcinogenèse épidermoïde pour une analyse du transcriptome. La première étape a consisté à définir le profil d’expression génique par la technique des microdamiers. Après son extraction et sa rétrotranscription, l’ARN a été marqué et hybridé sur des lames commercialisées par Agilent Technologies. Au total, 122 échantillons, dont minimum 12 de chaque catégorie, ont été hybridés avec un contrôle commun (issu d’un mélange de biopsies bronchiques normales de non-fumeurs). Une analyse en composante principale a montré que la hiérarchie de la classification histologique était bien représentée par les profils d’expression génique des biospies aux différents stades. Quelle que soit la liste de gènes de départ sélectionnée pour réaliser le regroupement hiérarchisé, nous avons observé, de manière constante et robuste, une différence majeure de profil d’expression génique entre, d’une part, les tissus bronchiques les plus « normaux » (normal normofluorescent, histologiquement normal mais hypofluorescent et hyperplasie) et, d’autre part, toutes les autres catégories histologiques dites « anormales ou modifiées » à partir de la métaplasie jusqu’au carcinome invasif. Parmi les épithéliums bronchiques « modifiés », deux grands groupes se distinguent :d’un côté, les métaplasies et dysplasies légères, qui sont très souvent bénignes et réversibles pour la plupart, et de l’autre côté, les dysplasies sévères, les CIS et les carcinomes invasifs, lésions à risque beaucoup plus élevé d’évoluer vers un cancer ou déjà malignes. Les échantillons au stade de dysplasie modérée se classent tantôt dans le deuxième groupe avec les dysplasies légères tantôt dans le troisième avec les dysplasies sévères. Il semble donc que le stade histologique de la dysplasie modérée soit un groupe hétérogène n’ayant pas de réalité biologique et qu’il serait plus adéquat de les reclasser dans un des 2 autres groupes sur base des arguments moléculaires. Nous avons obtenu les listes de gènes dont l’expression varie de manière statistiquement significative entre les différentes étapes de la carcinogenèse épidermoïde bronchique. Par ailleurs, nous avons pu mettre en évidence un profil d’expression génique permettant de discriminer les lésions bronchiques de mauvais pronostic (dysplasies sévères ou plus) de celles de meilleur pronostic (tissu normal et anomalies morphologiques de bas grade). Les gènes qui constituent ce profil permettant d’identifier les lésions de mauvais pronostic sont des candidats pour la détection précoce du cancer bronchique. De plus, nos données de génomique confirment la surexpression de certains ARNs messagers correspondant à des protéines dont la surexpression a été rapportée dans les études d’IHC comme COX-2, MDM2, Ki-67, les cytokératines, les métallopeptidases, les cyclines. Par ailleurs, certaines protéines dont le rôle dans les cancers pulmonaires invasifs a déjà été décrit mais pas aux stades pré-invasifs, parmi lesquelles la protéine PTH-like, des protéines liées à TNF ou d’autres liées à IGF, E2F ou à Wnt, semblent impliquées aux stades précoces de la carcinogenèse épidermoïde bronchique. Enfin, de nouveaux acteurs possibles de ce processus ont été mis en évidence.<p><p>Nous avons également étudié l’évolution de l’expression des microARNs au cours de la carcinogenèse bronchique par des RT-PCR quantitatives (LDA) sur 60 des biopsies dont nous avons étudié le transcriptome (6 par catégorie) et en utilisant la classification en 3 groupes issue des analyses des microdamiers d’expression génique. Cette étude montre que plusieurs miARNs sont différentiellement exprimés durant la carcinogenèse bronchique. De plus, deux étapes successives et distinctes ont été mises en évidence pour l’évolution de l’expression des miARNs au cours de la carcinogenèse bronchique. Aux stades les plus précoces, correspondant à la progression de l’épithélium normal du non-fumeur vers l’épithélium histologiquement normal du fumeur et l’hyperplasie jusqu’au groupe des anomalies morphologiques relativement bénignes (métaplasie, dysplasies légère et modérée), on observe une réduction significative de l’expression de la grande majorité des miARNs. Aux stades plus tardifs de la carcinogenèse (dysplasie sévère, CIS et CEB), même si 74 % des miARNs altérés restent encore régulés négativement par rapport à leur niveau d’expression dans l’épithélium normal du non-fumeur, la proportion de miARNs dont l’expression est augmentée (43 %) s’accroît par rapport à leur niveau d’expression dans les stades qui les précèdent (métaplasie, dysplasies légère et modérée). En outre, lorsque l’on compare ce dernier groupe à celui des lésions plus sévères (dysplasie sévère et CIS), qui progressent fréquemment vers des carcinomes invasifs, 80 % des miARNs augmentent leur niveau d’expression. Par ailleurs, l’expression de certains microARNs évolue de manière linéaire. En particulier, l’expression de miR 34c, cible transcriptionnelle de p53, et celle de miR 15a, inhibiteur de Bcl2, diminuent progressivement entre les différents stades à partir du tissu bronchique normal du non-fumeur jusqu’au CEB. Enfin, les profils d’expression des miARNs permettent de prédire avec précision la classification histologique non seulement entre les lésions de bas grade (métaplasie, dysplasies légère et modérée) et de haut grade (dysplasie sévère et CIS) mais également entre les CIS et les carcinomes invasifs. Les miARNs qui constituent ces signatures sont donc des candidats potentiels pour la détection précoce du cancer bronchique.<p><p>Conclusions<p><p>Nos travaux montrent que les anomalies moléculaires apparaissent aux stades les plus précoces de la transformation maligne de l’épithélium bronchique. L’expression protéique des marqueurs étudiés -p53, MDM2, p14arf, NPM, Ki-67, COX-2, c-erbB-2, et EGFR- permet d’affiner la classification des lésions bronchiques précancéreuses et de mieux comprendre les voies de la carcinogenèse précoce. Les profils d'expression des gènes et des microARNs apportent une approche originale des étapes successives du processus de carcinogenèse épidermoïde bronchique et ont mis en évidence des signatures permettant de discriminer les lésions qui sont à très haut risque de progression vers un cancer invasif ou qui sont déjà néoplasiques de celles de meilleur pronostic. Les marqueurs qui constituent ces profils sont des candidats potentiels pour la détection précoce du cancer bronchique.<p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les récentes études transcriptomiques chez divers organismes ont montré que la transcription des gènes convergents peut produire des ARN messagers (ARNm) chevauchants. Ce phénomène a été analysé dans le contexte de l’interférence par ARN (ARNi) nucléaire, et peu d’information existe quant au destin cytoplasmique des messagers 3’ chevauchants ou leur impact sur l’expression des gènes. Dans ce travail, nous avons abordé les conséquences potentielles de l’interaction entre des paires d’ARNm sens-antisens chez Saccharomyces cerevisiae, un organisme modèle naturellement dépourvu de l’ARNi. Nous avons démontré que les extrémités 3’ complémentaires des ARNm peuvent interagir dans le cytoplasme et moduler la stabilité ainsi que la traduction d’ARNm. Nos résultats sont issus d’une étude détaillée d’une paire d’ARNm convergents, POR1 et OCA2, ensuite généralisée par l’approche de l’ARNi reconstituée chez S. cerevisiae. L’analyse globale a confirmé que dans les cellules sauvages, les paires d’ARNm sens-antisens forment des duplexes d’ARN in vivo et ont un rôle potentiel à moduler l’expression d’ARNm ou de protéines respectifs, dans des différentes conditions de croissance. Nous avons montré que le destin de centaines des messagers convergents est contrôlé par Xrn1, révélant l’importance de cette exoribonucléase 5’-3’ cytoplasmique très conservée dans la régulation post-transcriptionnelle des gènes convergents. Notre travail ouvre donc la perspective de considérer un nouveau mécanisme de l’interaction entre les paires d’ARNm sens-antisens dans le cytoplasme, chez les organismes contenant ou non la voie de l’interférence par ARN. / Recent transcriptome analyses have revealed that convergent gene transcription can produce many 3’ overlapping mRNAs in diverse organisms. This phenomenon has been studied in the context of nuclear RNA interference (RNAi) pathway, however little is known about the cytoplasmic fate of 3’ overlapping messengers or their impact on gene expression. In this work, we address the outcomes of interaction between sense-antisense mRNA pairs in Saccharomyces cerevisiae, a model organism naturally devoid of RNAi. We demonstrate that the complementary tails of 3’ overlapping mRNAs can interact in the cytoplasm in a sequence-specific manner and promote post-transcriptional remodeling of mRNA stability and translation. Our findings are based on the detailed analysis of a convergent mRNA pair, POR1 and OCA2, subsequently generalized using the reconstituted RNAi approach in S. cerevisiae. Genome-wide experiments confirm that in wild-type cells, sense-antisense mRNA pairs form RNA duplexes in vivo and thus have potential roles in modulating the respective mRNA or protein levels under different growth conditions. We show that the fate of hundreds of messenger-interacting messengers is controlled by Xrn1, revealing the extent to which this conserved 5’-3’ cytoplasmic exoribonuclease plays an unexpected but key role in the post-transcriptional control of convergent gene expression. In sum, our work opens a perspective to consider an additional, cytoplasmic mechanism of interaction between sense-antisense mRNA pairs, in both RNAi-positive and negative organisms.

Doctor of Philosophy / Department of Animal Sciences and Industry / Bradley J. Johnson / We used a total of fifty-nine gilts (BW=137.7 kg) from three different breeding groups were used to assess the effects of feeding L-carnitine during gestation on gilt growth characteristics, gilt and fetal blood metabolites, litter characteristics, and IGF axis components in fetal hepatic and skeletal muscle, maternal uterine and chorioallantois tissues, and porcine embryonic myoblasts collected from fetuses. Experimental treatments were arranged in a 2 × 3 factorial arrangement with main effects of L-carnitine and day of gestation. Gilts were fed a constant feed allowance of 1.75 kg/d and a top-dress containing either 0 or 50 ppm of L-carnitine starting on the first day of breeding through the allotted gestation length (40, 55, or 70). No differences (P > 0.16) were observed for BW or estimated protein or fat mass at any gestation length. Gilts fed L-carnitine tended to have greater (P = 0.10) backfat at d 40 and were numerically heavier at d 70 compared to control gilts. No differences (P > 0.77) were observed in circulating total and free carnitine at breeding, but concentrations increased (P < 0.01) as gestation length increased for the gilts fed L-carnitine compared to those fed the control diet. Fetuses from the gilts fed L-carnitine tended to be heavier (P = 0.06) and fetal circulating IGF-II lower (P = 0.09) at day 70 compared to the fetuses from the control gilts. Insulin-like growth factor-I (IGF-I) mRNA was lower (P = 0.05) in fetal hepatic tissue in fetuses collected from gilts fed supplemental L-carnitine. Insulin-like growth factor binding protein-3 (IGFBP-3; P = 0.05) and IGFBP-5 mRNA increased (P = 0.01) and IGF-I mRNA numerically increased (P = 0.16) in the endometrium of gilts supplemented with L-carnitine. At d 55 or 70 gestation, fetuses were removed for collection of porcine embryonic myoblasts (PEM) from the semitendinosus. There were no treatment differences (P > 0.10) for the expression of IGF-I, IGF-II or IGFBP-5 mRNA levels. However, PEM isolated from fetuses collected from gilts fed L-carnitine had lower (P = 0.08) IGFBP-3 mRNA levels compared to the controls. Myoblasts isolated from fetuses obtained from gilts fed L-carnitine had greater (P = 0.09; 8.8 %) 5.1H11 monoclonal antibody attachment after 72 h in culture. Although not significant (P = 0.20), the total number of PEM in the S phase of the cell cycle was 4.7 % greater in PEM collected from fetuses from gilts fed L-carnitine compared to the controls. This study shows L-carnitine supplementation to gestating gilts has beneficial effects on average fetal weight, due in part to changes in the expression of the IGF axis at the fetal-maternal interface in swine. These changes in the IGF axis play a fundamental role in porcine fetal growth and development due to enhanced proliferation and delayed differentiation of PEM.

Post-transcriptional regulatory mechanisms are widely used to influence cell fate decisions in germ cells, early embryos, and neurons. Many conserved cytoplasmic RNA regulatory proteins associate with each other and assemble on target mRNAs, forming ribonucleoprotein (RNP) complexes, to control the mRNAs translational output. How these RNA regulatory networks are orchestrated during development to regulate cell fate decisions remains elusive. We addressed this problem by focusing on Caenorhabditis elegans germline development, an exemplar of post-transcriptional control mechanisms. Here, we report the discovery of GLS-1, a new factor required for many aspects of germline development, including the oocyte cell fate in hermaphrodites and germline survival. We find that GLS-1 is a cytoplasmic protein that localizes in germ cells dynamically to germplasm (P) granules. Furthermore, its functions depend on its ability to form a protein complex with the RNA-binding Bicaudal-C ortholog GLD-3, a translational activator and P granule component important for similar germ cell fate decisions. Based on genetic epistasis experiments and in vitro competition experiments, we suggest that GLS-1 releases FBF/Pumilio from GLD-3 repression. This facilitates the sperm-to-oocyte switch, as liberated FBF represses the translation of mRNAs encoding spermatogenesis-promoting factors. Our proposed molecular mechanism is based on the GLS-1 protein acting as a molecular mimic of FBF/Pumilio. Furthermore, we suggest that a maternal GLS-1/GLD-3 complex in early embryos promotes the expression of mRNAs encoding germline survival factors. Our work identifies GLS-1 as a fundamental regulator of germline development. GLS-1 directs germ cell fate decisions by modulating the availability and activity of a single translational network component, GLD-3. Hence, the elucidation of the mechanisms underlying GLS-1 functions provides a new example of how conserved machinery can be developmentally manipulated to influence cell fate decisions and tissue development.