Background: Bacterial contamination of surfaces with methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is a serious problem in the hospital environment and is responsible for significant nosocomial infections. The pathogenic contaminants form biofilms, which are difficult to treat with routine biocides. Thus, a continuous search for novel disinfection methods is essential for effective infection control measures. This demonstration of a novel technique for the control of virulent pathogens in planktonic form as well as in established biofilms may provide a progressive alternative to standard methodology. Methods: We evaluated a novel technique of normal atmospheric nonthermal plasma known as floating-electrode dielectric-barrier discharge (FE-DBD) plasma against a control of planktonic and biofilm forms of Escherichia coli, S aureus, multidrug-resistant methicillin-resistant S aureus (MRSA) -95 (clinical isolate), -USA300, and -USA400, using widely accepted techniques such as colony count assay, LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability assay, and XTT (2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide) assay. Results: Exposure of free living planktonic forms of E coli, S aureus, and MRSA were rapidly inactivated by DBD plasma. Approximately 107 bacterial cells were completely (100%) killed, whereas 108 and 109 were reduced by approximately 90% to 95% and 40% to 45%, respectively, in less than 60 seconds (7.8 J/cm2) and completely disinfected in ≤120 seconds. In established biofilms, the susceptibility of MRSA USA400 was comparable with USA300 but less susceptible than MRSA95 (clinical isolate), S aureus, and E coli (P < .05) to FE-DBD plasma, and plasma was able to kill MRSA more than 60% within 15 seconds (1.95 J/cm2). The killing responses were plasma exposure-time dependent, and cell density dependent. The plasma was able disinfect surfaces in a less than 120 seconds. Conclusion: Application of DBD plasma can be a valuable decontamination technique for the removal of planktonic and biofilm-embedded bacteria such as MRSA -USA 300, -USA 400, methicillin-sensitive S aureus (MSSA), and E coli, the more common hospital contaminants. Of interest, E coli was more resistant than S aureus phenotypes.

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Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biological and Medical Sciences Student: Bc. Lucie Polenová Supervisor: MUDr. Pavla Paterová Title of diploma thesis: Detection of methicillin - resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Hospital České Budějovice, a. s. and in University Hospital Hradec Králové The resistance of microbes to antibiotics belongs to worldwide health problems. Infections, which are caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), occur mainly in hospitals. It is because of incorrect and excesive consumption of antibiotics. Insufficient observance of hygienic-epidemiological measures helps to spread resistant strains. Background: The aim of the study was to determine the incidence of MRSA strains in two Czech hospitals - in Hospital České Budějovice, a.s. and in University Hospital Hradec Králové. To compare results with figures in the previous years and sort isolated strains by different characteristics in both hospitals. Methods: Results of the study are based on retrospective data analysis from electronic database. All data from hospitalized patients or outpatients during 1.1.2015 - 31.12.2015 with isolation of MRSA were counted. Processing and cultivation of isolates were made by standard microbiology measures. Strains,...

Introdução: A pneumonia associada à ventilação mecânica (PAV) causada por Staphylococcus aureus resistente à meticilina (SARM) é uma infecção nosocomial frequente em pacientes críticos. A vancomicina é o tratamento de escolha, porém tem apresentado altas taxas de falha terapêutica, sendo uma das possíveis causas a baixa penetração no tecido pulmonar após administração intravenosa. Diversos estudos experimentais têm demonstrado que a administração de antibióticos por nebulização possibilita a obtenção de altas concentrações no tecido pulmonar e maior efeito bactericida que a obtida por infusão intravenosa. Entretanto, até o momento, a literatura carece de estudos comparando a utilização de vancomicina por via intravenosa com a via inalatória. Objetivo: O objetivo principal deste estudo foi comparar a concentração de vancomicina atingida no tecido pulmonar saudável após a administração de dose única via intravenosa ou por nebulização, em suínos anestesiados e submetidos à ventilação mecânica. Métodos: Vinte e quatro suínos foram submetidos à anestesia intravenosa, intubação e ventilação mecânica e aleatorimanete distribuidos: Doze animais receberam uma dose única de vancomicina por infusão intravenosa (15 mg.Kg-1), dos quais seis animais foram eutanasiados uma hora após término da administração e seis animais foram eutanasiados após 12 horas e doze animais receberam uma dose única de vancomicina por nebulização com nebulizador de placa vibratória (37,5 mg.Kg-1), dos quais seis animais foram eutanasiados uma hora após término da administração e seis animais foram eutanasiados após 12 horas. Foram coletadas amostras de sangue para dosagem sérica de vancomicina antes da administração em 30\', 1, 2, 4, 6, 8 e 12h após o término da administração. Após a eutanásia, foram coletadas amostras de tecido pulmonar de regiões dependentes e não dependentes para dosagem tecidual de vancomicina. Nos animais que receberam a vancomicina por nebulização, a deposição extrapulmonar deste antibiótico foi calculada após da lavagem das partes do circuito ventilatório e da câmara de nebulização. A dosagem de vancomicina foi realizada por meio de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE-UV). Resultados: A concentração de vancomicina no tecido pulmonar obtida no grupo nebulizado de uma hora foi aproximadamente treze vezes maior que a concentração pulmonar obtida no grupo intravenoso de uma hora; (mediana e intervalo interquartílico) 161 (71-301) vs. 12 (4-42) Mig.g-1 (p < 0,05), respectivamente. A concentração pulmonar de vancomicina no grupo nebulizado de 12 horas foi 63 (23-119) Mig.g-1 e níveis indetectáveis de vancomicina foram obtidos no grupo intravenoso de 12 horas; 0 (0-19) Mig.g-1 (p < 0,05). Houve ausência de um pico sérico de vancomicina após o término da administração por nebulização no grupo de doze horas comparado ao grupo intravenoso. Conclusão: A administração de vancomicina por nebulização apresentou maiores concentrações pulmonares do que pela via intravenosa. Os resultados sugerem uma passagem lentificada da vancomicina pela barreira alvéolo-capilar após nebulização / Introduction: Ventilator-associated pneumonia caused by Staphylococcus aureus methicillin resistant is a frequent nosocomial infection in critically ill patients. Vancomycin is the treatment of choice, but it has presented high rates of therapeutic failure, possibly due to its low penetration in lung tissue following intravenous administration. Many studies have shown that lung tissue deposition and antibacterial efficiency of nebulized antibiotics were greater than by intravenous administration. However, to date, the literature lacks studies comparing the use of vancomycin intravenously with the inhalation route Objective: The aim of this study was to compare vancomycin concentration in healthy lungs after a single dose nebulized or intravenously administered in anesthetized and ventilated piglets. Methods: Twenty four piglets were anesthetized, intubated and submitted to mechanical ventilation. Twelve animals received a single dose of vancomycin by intravenous infusion (15 mg.kg-1), of which six animals were euthanized one hour after the end of administration and six animals were euthanized after 12 hours and twelve animals received a single dose of vancomycin using a vibrating plate nebulizer (37,5 mg.kg-1), of which six animals were euthanized one hour after the end of administration and six animals were euthanized after 12 hours. Blood samples were collected for serum vancomycin dosage before and at 30\', 1, 2, 4, 6, 8 and 12 hours after the end of administration. After euthanasia, tissue samples from dependent and non-dependent lung tissue were collected for tissue dosage of vancomycin. In animals receiving vancomycin by nebulization, the extrapulmonary deposition of this antibiotic was calculated after washing the parts of the ventilator circuit and the nebulization chamber. The dosage of vancomycin was performed using high performance liquid chromatography (HPLC-UV). Results: Vancomycin lung tissue concentrations in one-hour aerosol group were thirteen times greater than pulmonary concentration in one-hour intravenous group (median and interquartile range): 161 (71-301) Mig.g-1 vs. 12 (4-42) Mig.g-1 (p < 0.05). Vancomycin lung tissue concentration in twelve-hour aerosol group was 63 (23-119) ?g.g-1 and it was undetectable in twelve-hour intravenous group; 0 (0-19) Mig.g-1 (p < 0.05). There was no vancomycin serum peak following the end of administration by nebulization in the 12-hour group compared to intravenous administration. Conclusion: Administration of vancomycin by nebulization showed higher lung tissue concentrations than intravenous route. The results suggest a slower passage of vancomycin through alveolar capillary barrier after nebulization

Introdução: Staphylococcus aureus é um patógeno que frequentemente coloniza pacientes cirróticos e transplantados de fígado. A colonização por S. aureus aumenta o risco de infecções invasivas por MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus) o que aumenta a duração da hospitalização, os custos, a morbidade e a mortalidade. Com isso, é de grande importância o desenvolvimento de estratégias para identificação rápida, prevenção e controle de MRSA nesta população de pacientes. Objetivos: detectar MRSA em pacientes hepatopatas e descrever as características fenotípicas e moleculares de isolados MRSA neste grupo de pacientes. Metodologia: swabs nasais e inguinais foram coletados de 126 pacientes pré-transplante e 64 pacientes transplantados de fígado. Os swabs foram destinados para cultura microbiológica e também para extração direta de DNA. Foi determinada a Concentração Inibitória Mínima de 10 antimicrobianos de todos os isolados MRSA os quais também foram submetidos à caracterização de SCCmec, PFGE e spa typing. Amostras de DNA também foram submetidas à PCR 16S, MPCR coA/mecA e caracterização de SCCmec. Resultados: de acordo com a cultura microbiológica 12% dos swabs cultivados apresentaram crescimento de MRSA, resultando em 44 isolados MRSA. Todos os isolados foram resistentes à oxacilina, penicilina e sensíveis à vancomicina; todos amplificaram os genes coA e mecA; SCCmec tipo II e spa t002 predominaram nos dois grupos de estudo; além disso houve um cluster entre os isolados, o qual foi relacionado ao clone New York/Japan. O Clone Endêmico Brasileiro (BEC) foi relacionado somente à 4 isolados póstransplante. 98% das amostras de DNA amplificaram o gene 16S; a M-PCR identificou a presença de MRSA em 71% amostras de DNA e 61% das amostras tiveram a caracterização de SCCmec. O SCCmec tipo II predominou nos dois grupos de estudo. Conclusão: uma alta proporção de pacientes hepatopatas está colonizada com MRSA. Pacientes transplantados de fígado foram mais colonizados que pacientes cirróticos pela cultura microbiológica. A M-PCR coA/mecA diretamente de swabs foi mais sensível que a cultura microbiológica para identificar MRSA. Além disso, o PFGE demonstrou ter maior poder discriminatório que spa typing e não houve uma boa concordância entre os padrões de PFGE e spa types. Este estudo também demonstrou que está havendo uma mudança de clones MRSA em nosso hospital, devido à substituição do clone BEC pelo clone NY/Japan na última década / Introduction: Staphylococcus aureus is a pathogen that frequently colonizes cirrhotic and also liver transplanted patients. The S. aureus colonization increases the risk of invasive infections by MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus) that increases the duration of hospitalization, costs, morbidity and mortality. Thus, it is of great importance to develop strategies for early identification, prevention and control of MRSA in this population of patients. Objectives: to detect MRSA in patients with liver diseases, in addition to observe the phenotypic and molecular characteristics of MRSA isolates in this group of patients. Methods: nasal and groin swabs were collected from 126 patients pre-transplant and 64 liver transplanted patients. The swabs were designed to microbiological culture and also to direct extraction of DNA. Determined the Minimum Inhibitory Concentration of 10 antimicrobials of all MRSA isolates which were also submitted to M-PCR of coA/mecA, characterization of SCCmec, PFGE and spa typing. DNA samples were also submitted to PCR of 16S, M-PCR of coA/mecA and characterization of SCCmec. Results: according to microbiological culture, 12% of swabs showed growth of MRSA, resulting in 44 MRSA isolates. All isolates were resistant to oxacillin, penicillin and vancomycin susceptible; all amplified the coA and mecA genes; SCCmec type II and spa t002 predominated in both groups; in addition there was a cluster among isolates, which was related to clone New York / Japan. Furthermore Brazilian Endemic Clone (BEC) was also related to 4 post transplantation isolates. 98% of DNA samples amplified 16S gene; M-PCR identified the presence of MRSA in 71% of DNA samples and 61% of the samples had the characterization of SCCmec. SCCmec type II was predominant in the two study groups. Conclusion: a high proportion of patients with liver disease are colonized with MRSA. Liver transplant patients are more colonized that cirrhotic patients by culture method. M-PCR CoA / mecA directly from swabs was more sensitive than microbiological culture to identify MRSA. Moreover, the PFGE shown to have a higher discriminatory power than spa typing and there was no good concordance between PFGE patterns and spa types. This study also demonstrated that there is a change of MRSA clones in our hospital, due to the replacement of the clone BEC by NY/Japan clone in the last decade

Introdução: A pneumonia associada à ventilação mecânica (PAV) causada por Staphylococcus aureus resistente à meticilina (SARM) é uma infecção nosocomial frequente em pacientes críticos. A vancomicina é o tratamento de escolha, porém tem apresentado altas taxas de falha terapêutica, sendo uma das possíveis causas a baixa penetração no tecido pulmonar após administração intravenosa. Diversos estudos experimentais têm demonstrado que a administração de antibióticos por nebulização possibilita a obtenção de altas concentrações no tecido pulmonar e maior efeito bactericida que a obtida por infusão intravenosa. Entretanto, até o momento, a literatura carece de estudos comparando a utilização de vancomicina por via intravenosa com a via inalatória. Objetivo: O objetivo principal deste estudo foi comparar a concentração de vancomicina atingida no tecido pulmonar saudável após a administração de dose única via intravenosa ou por nebulização, em suínos anestesiados e submetidos à ventilação mecânica. Métodos: Vinte e quatro suínos foram submetidos à anestesia intravenosa, intubação e ventilação mecânica e aleatorimanete distribuidos: Doze animais receberam uma dose única de vancomicina por infusão intravenosa (15 mg.Kg-1), dos quais seis animais foram eutanasiados uma hora após término da administração e seis animais foram eutanasiados após 12 horas e doze animais receberam uma dose única de vancomicina por nebulização com nebulizador de placa vibratória (37,5 mg.Kg-1), dos quais seis animais foram eutanasiados uma hora após término da administração e seis animais foram eutanasiados após 12 horas. Foram coletadas amostras de sangue para dosagem sérica de vancomicina antes da administração em 30\', 1, 2, 4, 6, 8 e 12h após o término da administração. Após a eutanásia, foram coletadas amostras de tecido pulmonar de regiões dependentes e não dependentes para dosagem tecidual de vancomicina. Nos animais que receberam a vancomicina por nebulização, a deposição extrapulmonar deste antibiótico foi calculada após da lavagem das partes do circuito ventilatório e da câmara de nebulização. A dosagem de vancomicina foi realizada por meio de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE-UV). Resultados: A concentração de vancomicina no tecido pulmonar obtida no grupo nebulizado de uma hora foi aproximadamente treze vezes maior que a concentração pulmonar obtida no grupo intravenoso de uma hora; (mediana e intervalo interquartílico) 161 (71-301) vs. 12 (4-42) Mig.g-1 (p < 0,05), respectivamente. A concentração pulmonar de vancomicina no grupo nebulizado de 12 horas foi 63 (23-119) Mig.g-1 e níveis indetectáveis de vancomicina foram obtidos no grupo intravenoso de 12 horas; 0 (0-19) Mig.g-1 (p < 0,05). Houve ausência de um pico sérico de vancomicina após o término da administração por nebulização no grupo de doze horas comparado ao grupo intravenoso. Conclusão: A administração de vancomicina por nebulização apresentou maiores concentrações pulmonares do que pela via intravenosa. Os resultados sugerem uma passagem lentificada da vancomicina pela barreira alvéolo-capilar após nebulização / Introduction: Ventilator-associated pneumonia caused by Staphylococcus aureus methicillin resistant is a frequent nosocomial infection in critically ill patients. Vancomycin is the treatment of choice, but it has presented high rates of therapeutic failure, possibly due to its low penetration in lung tissue following intravenous administration. Many studies have shown that lung tissue deposition and antibacterial efficiency of nebulized antibiotics were greater than by intravenous administration. However, to date, the literature lacks studies comparing the use of vancomycin intravenously with the inhalation route Objective: The aim of this study was to compare vancomycin concentration in healthy lungs after a single dose nebulized or intravenously administered in anesthetized and ventilated piglets. Methods: Twenty four piglets were anesthetized, intubated and submitted to mechanical ventilation. Twelve animals received a single dose of vancomycin by intravenous infusion (15 mg.kg-1), of which six animals were euthanized one hour after the end of administration and six animals were euthanized after 12 hours and twelve animals received a single dose of vancomycin using a vibrating plate nebulizer (37,5 mg.kg-1), of which six animals were euthanized one hour after the end of administration and six animals were euthanized after 12 hours. Blood samples were collected for serum vancomycin dosage before and at 30\', 1, 2, 4, 6, 8 and 12 hours after the end of administration. After euthanasia, tissue samples from dependent and non-dependent lung tissue were collected for tissue dosage of vancomycin. In animals receiving vancomycin by nebulization, the extrapulmonary deposition of this antibiotic was calculated after washing the parts of the ventilator circuit and the nebulization chamber. The dosage of vancomycin was performed using high performance liquid chromatography (HPLC-UV). Results: Vancomycin lung tissue concentrations in one-hour aerosol group were thirteen times greater than pulmonary concentration in one-hour intravenous group (median and interquartile range): 161 (71-301) Mig.g-1 vs. 12 (4-42) Mig.g-1 (p < 0.05). Vancomycin lung tissue concentration in twelve-hour aerosol group was 63 (23-119) ?g.g-1 and it was undetectable in twelve-hour intravenous group; 0 (0-19) Mig.g-1 (p < 0.05). There was no vancomycin serum peak following the end of administration by nebulization in the 12-hour group compared to intravenous administration. Conclusion: Administration of vancomycin by nebulization showed higher lung tissue concentrations than intravenous route. The results suggest a slower passage of vancomycin through alveolar capillary barrier after nebulization

Wong, Kai Yi. / Thesis (M.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2011. / Includes bibliographical references (leaves 101-110). / Abstracts in English and Chinese. / Abstract --- p.4 / 摘要 --- p.7 / Acknowledgements --- p.9 / List of Tables --- p.10 / List of Figures --- p.11 / List of Abbreviations and Symbols --- p.12 / Chapter Chapter 1 --- Introduction --- p.14 / Chapter 1.1 --- Staphylococcus aureus --- p.14 / Chapter 1.2 --- Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) --- p.14 / Chapter 1.2.1 --- Methicillin resistance of MRSA --- p.15 / Chapter 1.2.2 --- Staphylococcal Chromosomal Cassette mec (SCCmec) --- p.16 / Chapter 1.2.3 --- Hospital-associated MRSA (HA-MRSA) and Community-associated MRSA (CA-MRSA) --- p.22 / Chapter 1.2.3.1 --- Hospital-associated MRSA (HA-MRSA) --- p.23 / Chapter 1.2.3.2 --- Community-associated MRSA (CA-MRSA) --- p.23 / Chapter 1.2.4 --- Pathogenesis of MRSA infection --- p.27 / Chapter 1.2.4.1 --- Possible virulence genes contributing to necrotizing pneumonia --- p.29 / Chapter 1.2.4.1.1 --- Panton-Valentine Leukocidin (PVL) --- p.29 / Chapter 1.2.4.1.2 --- Phenol-soluble modulins (PSMs) --- p.36 / Chapter 1.3 --- Evolution of MRSA --- p.36 / Chapter 1.4 --- Epidemiology of MRSA --- p.38 / Chapter 1.4.1 --- Epidemiology of MRSA worldwide --- p.38 / Chapter 1.4.1.1 --- Epidemiology of HA-MRSA worldwide --- p.38 / Chapter 1.4.1.2 --- Epidemiology of CA-MRSA worldwide --- p.39 / Chapter 1.4.2 --- Epidemiology of MRSA in Hong Kong --- p.40 / Chapter 1.5 --- Clinical significance of MRSA --- p.41 / Chapter 1.6 --- Antibiotics --- p.43 / Chapter 1.6.1 --- Beta-lactams --- p.43 / Chapter 1.6.2 --- Fluoroquinolone --- p.44 / Chapter 1.6.3 --- Linezolid --- p.45 / Chapter 1.6.4 --- Glycopeptides --- p.45 / Chapter 1.6.5 --- Aminoglycosides --- p.46 / Chapter 1.6.6 --- Fusidic acid --- p.46 / Chapter 1.6.7 --- Clindamycin --- p.47 / Chapter 1.7 --- Hypothesis --- p.47 / Chapter Chapter 2 --- Methods and Materials --- p.50 / Chapter 2.1 --- Bacterial isolate --- p.50 / Chapter 2.2 --- Effect of subinhibitory antibiotics on the expression of mRNA in MRSA in vitro --- p.53 / Chapter 2.2.1 --- Collection of bacterial fraction --- p.53 / Chapter 2.2.2 --- RNA extraction and DNA digestion --- p.53 / Chapter 2.2.3 --- Reverse transcription for cDNA synthesis --- p.54 / Chapter 2.2.4 --- Quantitative real-time PCR (qPCR) analysis (pvl and psma\-A expression) --- p.55 / Chapter 2.2.5 --- Preparation of standard controls for quantification of DNA copy number in qPCR reactions... --- p.58 / Chapter 2.3 --- Effect of subinhibitory concentration of antibiotics on MRSA pneumonia in a murine model --- p.60 / Chapter 2.4 --- Statistical Analysis --- p.62 / Chapter Chapter 3 --- Results --- p.63 / Chapter 3.1 --- Effect of subinhibitory antibiotics on the expression ofmRNA in MRSA in vitro --- p.63 / Chapter 3.2 --- Effect of subinhibitory concentration of antibiotics on MRSA pneumonia in a murine model --- p.74 / Chapter Chapter 4 --- Discussion --- p.80 / Chapter 4.1 --- Effect of subinhibitory antibiotics on the expression of mRNA in MRSA in vitro --- p.81 / Chapter 4.2 --- Effect of subinhibitory concentration of antibiotics on MRSA pneumonia in a murine model --- p.87 / Chapter 4.3 --- Correlation of effects of subinhibitory antibiotics on the expression ofmRNA in MRSA in vitro and on MRSA pneumonia in a murine model --- p.91 / Chapter 4.4 --- Limitations of Study --- p.95 / Chapter 4.5 --- Future Work --- p.95 / Chapter Chapter 5 --- Conclusions --- p.97 / References --- p.99 / Chapter Appendix I- --- Materials and Reagents --- p.109 / Chapter Appendix II- --- Average and standard deviation of the copy number ratio (pvl or psmal-4 copy number/JdiS1 copy number) --- p.111 / Chapter Appendix III- --- In-vivo experimental data for infected control group and seven antibiotic groups --- p.116

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UNIFSJ / A colonização por Staphylococcus aureus representa o principal risco para infecções, principalmente em crianças, que apresentam elevada morbimortalidade relacionada a este patógeno. Tal microrganismo apresenta grande variabilidade molecular que confere mudanças epidemiológicas constantes. Linhagens com características variadas de resistência e virulência emergem e sucumbem, constituindo-se em um desafio para a saúde pública mundial. Nos últimos anos, alguns estudos têm sugerido uma mudança epidemiológica nas linhagens de S. aureus resistentes a meticilina (MRSA) no Brasil. O objetivo do presente estudo é atualizar o conhecimento acerca da epidemiologia molecular de MRSA colonizando crianças e adolescentes em Niterói – Rio de Janeiro. Trata-se de estudo de corte transversal, realizado com crianças e adolescentes, de zero a 16 anos, em creches, ambulatórios e hospitais na cidade de Niterói-RJ, no período de agosto de 2011 a junho de 2013. Um total de 1500 participantes (500 de creches, 500 de ambulatório e 500 de hospitais) foi submetido à coleta de secreção nasal por meio de swabs para pesquisa de MRSA. Destes, 749 (49,9%) das 1500 amostras foram caracterizados como S. aureus, sendo 288 (57,6%) das 500 amostras de ambulatório, 239 (47,8%) das 500 de hospitais e 222 (44,4%) das 500 das creches desta região. Do total, 144 (9,6%) das 1500 amostras foram caracterizadas como MRSA, sendo 31 (6,2%) das 500 das creches, 45(9%) das 500 de ambulatório e 68 (13,6%) das 500 dos hospitais. As 144 amostras de MRSA foram submetidas às técnicas de genotipificação por PCR dos genes mecA, lukS/lukFPV e SA442 para a identificação do gene de resistência a meticilina, da leucocidina Panton-Valentine (PVL) e confirmação da espécie S. aureus, respectivamente. Foram realizados testes de susceptibilidade antimicrobiana com 14 antimicrobianos selecionados de acordo com o CLSI (2012). Também foram realizados PCR-multiplex para identificação do tipo de cassete mec (SCCmec) e sequenciamento dos genes da proteína A (spa-Typing) e genes constitutivos (MLST), para a caracterização molecular das linhagens de MRSA. Observou-se a prevalência de diferentes clones de MRSA, incluindo os mais frequentes, ST5-MRSA-IV (CC5) e ST30-MRSA-IV (CC30), cujas características, corroboram com a literatura de linhagens de grande relevância, disseminadas em nível pandêmico, “Clone pediátrico” e “Clone SWP”, respectivamente. Nas creches e nos hospitais, foram identificados seis de complexos clonais (CC) diferentes em cada cenário. Já o ambulatório apresentou nove CCs diferentes. O PVL foi observado em 30 (54,5%) das 55 CC30. Das amostras classificadas como CC5 34 (57,6%) de 59 apresentaram resistência ou resistência intermediária à eritromicina. Evidenciou-se variação sazonal de colonização por MRSA, com maior frequência no verão. Nossos resultados confirmam a mudança epidemiológica do até então conhecido Clone Epidêmico Brasileiro para linhagens amplamente descritas pela literatura e disseminadas em nível pandêmico, com grande relevância, conhecidas como “Clone Pediátrico” e “Clone SWP” em crianças e adolescentes no Brasil, com variação sazonal na frequência de colonização por MRSA. Tais achados são relevantes para uma melhor compreensão do comportamento epidemiológico da colonização por MRSA em nível local, com informações que auxiliem nas estratégias de vigilância epidemiológica para o controle desse patógeno. / The colonization by Staphylococcus aureus (S. aureus) is the main risk factor for infections, especially in children who have high morbidity and mortality related to this pathogen. This microorganism has large molecular variability that provides constant epidemiological changes. Lineages with varied characteristics of resistance and virulence emerge and succumb, constituting a challenge to global public health. In recent years, some epidemiologic studies have suggested a change in strains of methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in Brazil. The aim of this study is to update the knowledge of the molecular epidemiology of MRSA colonizing children and adolescents in Niterói - Rio de Janeiro. This is a cross-sectional study, conducted with children and adolescents in community day care centers, outpatient clinics and hospitals in Niterói, RJ, from August 2011 to June 2013. A total of 1500 participants (500 of day care centers, 500 of outpatient clinic and 500 of hospitals) was submitted to nasal secretion collection using swabs for MRSA research. Of these, 749/1500 (49.9%) were characterized as S. aureus, being that 288/500 (57.6%) were of outpatient clinic, 239/500 (47.8%) of hospitals and 222/500 (44.4 %) of the day cares centers. Among the samples of S. aureus 144/1500 (9.6%) were characterized as MRSA, with 31/500 (6.2%) from day care centers, 45/500 (9%) from outpatient clinics and 68/500 (13 6%) of hospitals. The 144 samples of MRSA were submitted to genotyping by PCR from the mecA, luks/lukFPV and SA442 genes to identifi of methicillin resistance gene, the Panton-Valentine leukocidin (PVL) toxin and species, respectively. Antimicrobial susceptibility tests were performed with 14 antimicrobials selected according to the CLSI (2012). It was also performed multiplex-PCR to identify the type of cassette mec (SCCmec) and sequencing of the genes of protein A (spa-Typing) and constitutive genes (MLST), for molecular characterization of MRSA lineages. We observed the prevalence of different MRSA, including the most commons, ST5-MRSA-IV (CC5) and ST30-MRSA-IV (CC30), whose characteristics corroborate with the literature of relevant lineages, disseminated on pandemic level, "Pediatric Clone" and "SWP Clone", respectively. In day care centers and hospitals six types of different clonal complexes (CC) have been identified in each environment, and the outpatient clinics had nine different CCs. The CC30 showed a frequency of 54.5% (30/55) for positivity of PVL genes. Samples classified as CC5 showed 57.6% (34/59) of resistance or intermediate resistance to erythromycin. This finding corroborates with literature, which describes about the epidemiological distribution of these strains. Our results confirm the epidemiological change of the Epidemic Brazilian Clone to strains widely described in the literature with pandemic level of disseminated and great relevance, known as "Pediatric Clone" and "SWP Clone" in children and adolescents in Brazil with seasonal variation in the frequency of MRSA colonization. These findings are relevant for a better understanding of the epidemiological changes of MRSA colonization locally, with information that assists in epidemiological surveillance strategies for the control of this pathogen.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:38:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Mirna Miyamoto.pdf: 3227973 bytes, checksum: 7f5d27c4ca1e753ebe05cec66ce51343 (MD5) Previous issue date: 2010-06-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Staphylococcus aureus is a potential pathogen, accounting for 60% of infections in ICU`s and can be found in the nasopharyngeal region and also in the nasal cavity, especially in health care workers who become sources of dissemination of these microorganisms in hospital. However, the indiscriminate use of antibiotics to combat these pathogens, has caused the emergence of bacteria possessing resistance genes such as mecA. Of which are about 30 to 50% of the strains of S. aureus and more than 50% of coagulase-negative staphylococci. The CONS are increasingly becoming the target of concern in hospital environments, increasing the need for screening, prevention and control of resistant strains. Therefore, the objective of this work was the characterization of Staphylococcus sp., looking for the resistance gene and genetic mapping of S. aureus in clinical samples from the cities of Manaus and Porto Velho. The techniques used were biochemical tests, antibiogram, PCR (for 16 rRNA gene and mecA) and MLST. The four strains of CONS were found, three of Staphylococcus sciuri and S. epidermidis, characterized by phenotypic and genotypic tests. They were possessed of the methicillin resistance gene mecA. As for S. aureus studied, failed to detect the presence of the mecA gene, but gene mapping was performed from these samples with the technique of MLST, using five housekeeping genes. In this analysis we observed the formation of two large clusters between the cities of Manaus and Porto Velho, and two samples showed genetic divergence from other, thus demonstrating genetic variability between the cities of northern Brazil. The evidence related in the scientific literature, little research related to knowledge and epidemiological characterization of strains existing in the Amazon region, in this research, we discussed some questions of phenotypic analysis, characterization of new resistant strains and preparation of database for future development of biotechnological tools. / Staphylococcus aureus é um patógeno em potencial, sendo responsável por 60% das infecções nos CTIs, podendo ser encontrado na região da nasofaringe e também nas fossas nasais, principalmente em profissionais da saúde que se tornam fontes de disseminação desses micro-organismos no ambiente hospitalar. No entanto, o uso indiscriminado de antimicrobianos no combate desses patógenos, tem ocasionado o surgimento de bactérias possuidoras de genes de resistência, como o gene mecA, entre as quais, cerca de 30 a 50% das cepas de S. aureus e mais de 50% são de estafilococos coagulase-negativos são portadores deste gene. Os CONS estão cada vez mais se tornando alvo de preocupação nos ambientes hospitalares, aumentando a necessidade de rastreamento, prevenção e controle das cepas resistentes. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização de Staphylococcus sp., quanto a presença do gene de resistência e mapeamento genético de S. aureus em amostras clínicas das cidades de Manaus e Porto Velho. As técnicas aplicadas foram testes bioquímicos, antibiograma, PCR (para gene 16S rRNA e gene mecA) e MLST. Neste trabalho, encontramos quatro cepas de CONS, três de Staphylococcus sciuri e um S. epidermidis, caracterizados por testes fenotípicos e genotípicos, sendo estas possuidoras do gene de resistência a meticilina mecA. Quanto aos S. aureus estudados, não se detectou a presença do gene mecA, mas foi realizado o mapeamento gênico destas amostras com a técnica de MLST, utilizando cinco genes constitutivos. Nesta análise, foi observada a formação de dois grandes agrupamentos principais (clusters) entre as cidades de Manaus e Porto Velho, e duas amostras apresentaram divergência gênica das outras, demonstrando assim, variabilidade genética entre essas cidades da Região Norte do Brasil. Diante das evidências científicas na literatura, escassas pesquisas relacionadas ao conhecimento epidemiológico e caracterização das linhagens existentes na região Amazônica, nesta pesquisa, foram discutidas algumas questões de análise fenotípica, caracterizações de novas cepas resistentes e elaboração de banco de dados para futuro desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas.

Introdução: Staphylococcus aureus é um patógeno que frequentemente coloniza pacientes cirróticos e transplantados de fígado. A colonização por S. aureus aumenta o risco de infecções invasivas por MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus) o que aumenta a duração da hospitalização, os custos, a morbidade e a mortalidade. Com isso, é de grande importância o desenvolvimento de estratégias para identificação rápida, prevenção e controle de MRSA nesta população de pacientes. Objetivos: detectar MRSA em pacientes hepatopatas e descrever as características fenotípicas e moleculares de isolados MRSA neste grupo de pacientes. Metodologia: swabs nasais e inguinais foram coletados de 126 pacientes pré-transplante e 64 pacientes transplantados de fígado. Os swabs foram destinados para cultura microbiológica e também para extração direta de DNA. Foi determinada a Concentração Inibitória Mínima de 10 antimicrobianos de todos os isolados MRSA os quais também foram submetidos à caracterização de SCCmec, PFGE e spa typing. Amostras de DNA também foram submetidas à PCR 16S, MPCR coA/mecA e caracterização de SCCmec. Resultados: de acordo com a cultura microbiológica 12% dos swabs cultivados apresentaram crescimento de MRSA, resultando em 44 isolados MRSA. Todos os isolados foram resistentes à oxacilina, penicilina e sensíveis à vancomicina; todos amplificaram os genes coA e mecA; SCCmec tipo II e spa t002 predominaram nos dois grupos de estudo; além disso houve um cluster entre os isolados, o qual foi relacionado ao clone New York/Japan. O Clone Endêmico Brasileiro (BEC) foi relacionado somente à 4 isolados póstransplante. 98% das amostras de DNA amplificaram o gene 16S; a M-PCR identificou a presença de MRSA em 71% amostras de DNA e 61% das amostras tiveram a caracterização de SCCmec. O SCCmec tipo II predominou nos dois grupos de estudo. Conclusão: uma alta proporção de pacientes hepatopatas está colonizada com MRSA. Pacientes transplantados de fígado foram mais colonizados que pacientes cirróticos pela cultura microbiológica. A M-PCR coA/mecA diretamente de swabs foi mais sensível que a cultura microbiológica para identificar MRSA. Além disso, o PFGE demonstrou ter maior poder discriminatório que spa typing e não houve uma boa concordância entre os padrões de PFGE e spa types. Este estudo também demonstrou que está havendo uma mudança de clones MRSA em nosso hospital, devido à substituição do clone BEC pelo clone NY/Japan na última década / Introduction: Staphylococcus aureus is a pathogen that frequently colonizes cirrhotic and also liver transplanted patients. The S. aureus colonization increases the risk of invasive infections by MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus) that increases the duration of hospitalization, costs, morbidity and mortality. Thus, it is of great importance to develop strategies for early identification, prevention and control of MRSA in this population of patients. Objectives: to detect MRSA in patients with liver diseases, in addition to observe the phenotypic and molecular characteristics of MRSA isolates in this group of patients. Methods: nasal and groin swabs were collected from 126 patients pre-transplant and 64 liver transplanted patients. The swabs were designed to microbiological culture and also to direct extraction of DNA. Determined the Minimum Inhibitory Concentration of 10 antimicrobials of all MRSA isolates which were also submitted to M-PCR of coA/mecA, characterization of SCCmec, PFGE and spa typing. DNA samples were also submitted to PCR of 16S, M-PCR of coA/mecA and characterization of SCCmec. Results: according to microbiological culture, 12% of swabs showed growth of MRSA, resulting in 44 MRSA isolates. All isolates were resistant to oxacillin, penicillin and vancomycin susceptible; all amplified the coA and mecA genes; SCCmec type II and spa t002 predominated in both groups; in addition there was a cluster among isolates, which was related to clone New York / Japan. Furthermore Brazilian Endemic Clone (BEC) was also related to 4 post transplantation isolates. 98% of DNA samples amplified 16S gene; M-PCR identified the presence of MRSA in 71% of DNA samples and 61% of the samples had the characterization of SCCmec. SCCmec type II was predominant in the two study groups. Conclusion: a high proportion of patients with liver disease are colonized with MRSA. Liver transplant patients are more colonized that cirrhotic patients by culture method. M-PCR CoA / mecA directly from swabs was more sensitive than microbiological culture to identify MRSA. Moreover, the PFGE shown to have a higher discriminatory power than spa typing and there was no good concordance between PFGE patterns and spa types. This study also demonstrated that there is a change of MRSA clones in our hospital, due to the replacement of the clone BEC by NY/Japan clone in the last decade