Submitted by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2018-04-18T13:18:24Z No. of bitstreams: 1 Tese-15860.pdf: 879437 bytes, checksum: c869f5350ca0a0b0f13be8ba348f8fa5 (MD5) / Approved for entry into archive by Mariusa Loução (mariusa.loucao@unifesp.br) on 2018-04-18T13:20:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese-15860.pdf: 879437 bytes, checksum: c869f5350ca0a0b0f13be8ba348f8fa5 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-18T13:20:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese-15860.pdf: 879437 bytes, checksum: c869f5350ca0a0b0f13be8ba348f8fa5 (MD5) Previous issue date: 2016 / O uso da biologia molecular como ferramenta de diagnóstico microbiológico vem se expandindo no setor da medicina laboratorial. Novas plataformas aparecem com a prerrogativa de facilitar e acelerar o processo de análise. O uso de sistemas automatizados, que realizam extração, amplificação e detecção de ácidos nucleicos dentro da mesma plataforma, permite maior precisão e facilidade ao desenvolvimento de um novo teste por apresentarem todos os processos acoplados e reagentes disponíveis para o processo. Dentre as plataformas automatizadas, uma das que se destacam é o BD Max™ (Becton Dickinson Diagnostics). O sistema BD Max é uma plataforma automatizada aberta, que combina a extração de ácidos nucleicos, PCR (Reação de Polimerização em Cadeia) em tempo real e detecção dentro do mesmo instrumento, oferecendo a opção de usar os testes aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA) e também, testes desenvolvidos pelo usuário. Com o objetivo de testar os recursos que a modalidade aberta da plataforma BD Max oferece, foram desenvolvidos três estudos distintos para o diagnóstico molecular de agentes infecciosos direto de amostras clínicas. Estudo 1: O objetivo deste estudo foi validar um teste multiplex usando a tecnologia PCR em tempo real no sistema aberto BD MAX™, para detectar o complexo Mycobacterium tuberculosis (CMT), complexo Mycobacterium avium (CMA) e Mycobacterium spp. (PAN) diretamente de amostras clínicas. Quando os resultados do novo teste foram comparados com os resultados da cultura, a reação de PCR apresentou especificidade de 97,1%, 100% e 100% para CMT, CMA e PAN, respectivamente. Estudo 2: O objetivo deste estudo foi validar um teste multiplex usando a tecnologia PCR em tempo real no sistema aberto BD MAX™ para detectar o grupo Mycobacterium abscessus (GMA), complexo Mycobacterium fortuitum (CMF) e Mycobacterium chelonae (MC), diretamente de amostras clínicas. Quando os resultados do novo teste foram comparados com os resultados da cultura, uma concordância de 97%, 100% e 99% para GMA, CMF e MC, respectivamente foi observada. Estudo 3: O objetivo deste estudo foi validar um teste multiplex usando a tecnologia PCR em tempo real no sistema aberto BD MAX™ para detectar e identificar Achromobacter xylosoxidans (AX), Burkholderia cepacia (BC), Pseudomonas aeruginosa (PSA) e Stenotrophomonas maltophilia (SM) diretamente de amostras respiratórias de pacientes portadores de Fibrose Cística (FC). Quando os resultados do novo teste foram comparados com os resultados da cultura, uma alta concordância foi observada entre as duas metodologias. Conclusão: Os 3 testes desenvolvidos provaram ser específicos e sensíveis para detectar por PCR em tempo real microrganismos causadores de infeção direto da amostra clínica. A plataforma automatizada BD Max provou ser uma excelente ferramenta para a realização de testes moleculares automatizados. / The use of molecular biology as a tool for microbiology diagnostic has been expanding in the laboratory routine. Despite of the strong growth of the area, companies can not afford the demand about epidemiological changes around the world and for this reason laboratories opt to develop their own methods. New platforms appear with the prerogative to facilitate and accelerate the analysis process. The use of automated sample-in results-out platforms allows higher precision and facilitates the development of a new test by presenting all attached processes and reagents available for the test. Among platforms that best fits this profile, the BD Max™ (BD Diagnostics) is one of the most used ones. The BD Max system is an automated open platform that combines extraction and real time PCR in the same instrument, offering the option of using tests approved by the FDA or the open platform mode for userdeveloped test. In order to explore the BD Max open mode platform, three differents studies were developed to detect the microorganisms that causes infection directly from clinical samples. Study 1: A multiplex real time PCR was validated on the BD MAX™ open mode system to detect Mycobacterium tuberculosis complex (MTC), Mycobacterium avium complex (MAC) and Mycobacterium spp. (PAN) directly from clinical specimens. When compared to culture results, the new BD MAX PCR test presented specificities of 97.1%, 100% and 100% for MTC, MAC and PAN, respectively. Study 2: A multiplex real time PCR was validated on the BD MAX™ open mode system to detect Mycobacterium abscesses Group (MAG), Mycobacterium fortuitum complex (MFC) and Mycobacterium chelonae (MC) directly from clinical specimens. When compared to culture results, the new BD Max PCR test presented an overall agreement of 97%, 99% and 100% for the detection of MAG, MFC and MC, respectively. Study 3: A multiplex real time PCR was validated on the BD MAX™ open mode system to detect Achromobacter xylosoxidans (AX), Burkholderia cepacia (BC), Pseudomonas aeruginosa (PSA) and Stenotrophomonas maltophilia (SM) directly from clinical specimens collected from Cystic Fibrosis patients. When culture results were compared to the new BD Max PCR test results, a high overall agreement were observed between both methodologies. Conclusion: All 3 tests proved to be specific and sensitive to detect different microorganisms associated with infections, directly from clinical samples. The BD Max proved to be an excellent tool for automated molecular tests.

Submitted by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-02-04T16:18:28Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Viviane Lopes Rocha - 2014.pdf: 3025545 bytes, checksum: 8144fc57a9ecf1ebc51b1286fa161d44 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-02-05T10:07:09Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Viviane Lopes Rocha - 2014.pdf: 3025545 bytes, checksum: 8144fc57a9ecf1ebc51b1286fa161d44 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-05T10:07:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Viviane Lopes Rocha - 2014.pdf: 3025545 bytes, checksum: 8144fc57a9ecf1ebc51b1286fa161d44 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-05-21 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Mycobacterium massiliense (MM) has been associated as the causative agent of many nosocomial outbreaks related to laparoscopy, arthroscopic and wound infections. Several outbreaks have been reported in Brazil. The cities of Goiânia, Rio de Janeiro and Belem reported a high number of cases in 2006 and 2007. The iron ion (Fe) is extremely important for many biochemical processes in all organisms and, in the case of microorganisms, the success of the infection. Microorganisms synthesize molecules called siderophores (SD) to aid Fe uptake. Micobactin and carboximicobactin are the SDs that has been described in mycobacteria. One of the genes responsible for the assembly of these SD in M. tuberculosis is the mbtb. A MM strain, which belongs to the outbreak that happened in Goiânia (MM GO06) had its genome sequenced and the analysis revealed that the species has a putative gene with high similarity to M. tuberculosismbtb, which could be an indication that MM also synthesizes a siderophore molecule and that this can be helping this mycobacteria to install the infection in the host. It is known that in the absence of mbtb gene M. tuberculosis do not synthesize their SD. To estimate whether a gene similar to mbtb and with the same function is present in MM (smbtb) will assist in the understanding of the infection mechanisms of MM and discover new drug targets for treating infections with this microorganism. Total RNA was obtained from cultures grown at different concentrations of Fe. Real time PCR was performed targeting the smbtb to evaluate the expression of this gene during bacterial growth in each condition. The expression of smbtb was higher with the increase of the availability of iron. In vivo studies with mice supplemented with or chelated fromiron showed expression profile of smbtb different from those obtained in in vitro studies. In mice, M. massiliense smbtb expressed at higher levels when the animal were treated for iron depletion. Thus, we have evidence that smbtb is involved in iron uptake both for subsequent storage, when this ion is available, and for prompt use in the metabolism of the bacteria when it is not in an environment where there is availability of this ion. / Mycobacterium massiliense (MM) tem sido associado como agente causador de vários surtos nosocomiais relacionados à laparoscopia, artroscopia e infecções de feridas. Inúmeros surtos têm sido reportados no Brasil. As cidades de Goiânia, Rio de Janeiro e Belém apresentaram um alto número de casos em 2006 e 2007. O íon ferro é extremamente importante para vários processos bioquímicos em todos os organismos e, no caso dos microrganismos, para o sucesso da infecção. Para auxiliar a captação de Fe durante este processo, os microrganismos sintetizam moléculas chamadas sideróforos, que desempenham esta função. Micobactina e carboximicobactina são os sideróforos que já foram descritos em micobactérias. Um dos genes responsáveis pela síntese dos sideróforos em M. tuberculosis é o mbtb. Um isolado de MM, com origem no surto que aconteceu em Goiânia (MM GO06) teve seu genoma sequenciado e sua análise revelou que esta espécie possui um gene putativo com alta similaridade com o mbtb de M. tuberculosis, o que poderia indicar que MM também sintetiza sideróforos e que está molécula poderia estar auxiliando esta micobactéria a instalar a infecção no hospedeiro. Sabemos que a ausência do gene mbtb em M. uberculosis torna esta micobactéria incapaz de sintetizar sideróforos. Avaliar se um gene similar ao mbtb e com a mesma função está presente em MM (smbtb) irá auxiliar o entendimento dos mecanismos de infecção de MM e a descoberta de novos alvos para drogas para o tratamento de infecções causadas por MM. RNA total foi obtido de culturas onde MM foi crescido em diferentes concentrações de ferro. Realizou-se Real Time PCR para o gene smbtb a fim de avaliar a expressão deste gene durante o crescimento bacteriano em cada condição. A expressão do sbmtb aumentou com o aumento da disponibilidade de ferro. Estudos in vivo com camundongos suplementados ou privados do íon ferro apresentaram um perfil de expressão diferente daquele obtido nos estudos in vitro. Em camundongos, MM expressou smbtb em altos níveis nos animais que foram tratados com quelante para o íon ferro. Evidenciamos então, que smbtb pode estar envolvido na captação de ferro tanto para armazenamento deste íon, quando o mesmo está isponível, quanto para a utilização imediata no metabolismo da bactéria, quando há uma baixa disponibilidade de ferro no ambiente que MM se encontra.

CASTRO, Elcineide Soares de. Microbactérias não tuberculosas : aspectos clínicos e epidemiológicos e análise de espécies identificadas pela metodologia PRA. 2012. 199 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-07-10T11:54:06Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_escastro.pdf: 2955399 bytes, checksum: b18d621d9f650e57deb685f39430e41b (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-07-10T13:14:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_escastro.pdf: 2955399 bytes, checksum: b18d621d9f650e57deb685f39430e41b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-10T13:14:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_escastro.pdf: 2955399 bytes, checksum: b18d621d9f650e57deb685f39430e41b (MD5) Previous issue date: 2012 / Infections caused by nontuberculous mycobacteria (NTM) are becoming more frequent around the world and also in Brazil. The ability of produce disease is clearly documented in the literature and its importance has been increasing steadily. Although mycobacteria can affect any human organ, the most common form of involvement is the lung disease. This study aimed to evaluate clinical and epidemiological characteristics of patients with NTM lung disease and the diversity of species isolated. We studied retrospectively 59 patients enrolled for treatment at the outpatient clinic reference Messejana Hospital, from 1998 to 2008. The species of NTM isolated from sputum were identified using PRA method in the Microbiology Laboratory, Faculty of Medicine, Federal University of Ceará. The variables studied were: year of diagnosis, age, origin, gender, profession and biological risk of illness, education level, family income, clinical symptoms, comorbidity, previous history of tuberculosis (TB), radiological findings, anti-HIV serology, tuberculin test, history of smoking and alcoholism and outcome. The quantitative and categorical variables were analysed by calculating frequencies and proportions of the measures of central location and dispersion for each variable separately. The analyzes of associations were performed using the nonparametric Pearson’s test and parametric test of the likelihood ratio (based on product binomial distributions / multinomial) using CI = 95% and p < 0,05. The PRA method identified all 59 species, with predominance of the following: M. abscessus, 28.5% (17/59); M. lentiflavum 18.6% (11/59); M. avium, 16.6% (10/59); M. fortuitum and M. smegmatis, 10.2% (06/59) each; M. kansasii, 6.8% (4/59). The mean age ± SD of the group was 50.4 ± 16.1 years; 62.7% (37/59) were male and 62, 7% had at most basic education, 72.9% (43/59) with income below the poverty level, 49.2% (29/59) reported using alcohol and 40.6% (24/59) smoking, 59.3% (35/59) were involved with biological risk, 86% (51%) lived in Fortaleza. Cough was observed in 91.5% (54/59) and expectoration in 72.9% (43/59). Fibrosis and cavity were in 71.2% (42/59) and 45.8% (27/59) of the patients, respectively. HIV serology was positive in 7% (4/59), tuberculin skin test was performed in only 22% (13/59), of which 92.3% (12/13) were positive, 54% (32/59) had cured and 15.3% (9/59) had died. The associations between the variable profession with biological risk and gender (60% female), and between profession with biological risk and comorbidity (75% had associated disease), and profession with biological risk and family income proved to be significant. The association analysis of the groups of species of NTM isolated, if potentially pathogenic or rarely pathogenic with the others different study variables were not significant, thus did not discriminate to differentiate the groups. This study demonstrated the importance for the recognition of NTM lung disease whose species can be identified in sputum samples and for the epidemiological importance and the need for differential diagnosis in cases of tuberculosis. / As infecções por micobactérias não tuberculosas (MNT) estão se tornando mais frequentes em todo o mundo, inclusive no Brasil. A capacidade das MNT em produzir doença está claramente documentada na literatura e sua importância clínica vem aumentando progressivamente. Embora a micobactéria possa comprometer qualquer órgão ou sítio, a forma mais frequente de comprometimento é a doença pulmonar. Esse estudo se propôs a avaliar aspectos clínicos e epidemiológicos de pacientes com doença pulmonar por MNT e a diversidade das espécies isoladas. Foram estudados retrospectivamente, 59 pacientes inscritos para tratamento no ambulatório de referência do Hospital de Messejana, período de 1998 a 2008. As espécies de MNT isoladas em meio de cultura a partir de amostras de escarro foram identificadas através da metodologia PRA no Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Medicina, UFC e classificadas conforme a patogenicidade em potencialmente ou raramente patogênicas. As variáveis foram: ano diagnóstico, idade, procedência, sexo, profissão e risco biológico de adoecimento, grau de escolaridade, renda familiar, comorbidades, história prévia de tuberculose (TB), sorologia HIV, teste tuberculínico, história de tabagismo e etilismo, sintomas clínicos, achados radiológicos e desfecho. As variáveis categóricas e quantitativas foram analisadas através de proporções e frequências com cálculo das medidas de localização central e de dispersão para cada variável isoladamente. As análises de associações foram feitas utilizando o teste não-paramétrico de Pearson e o teste paramétrico da razão de verossimilhanças, com IC=95% e p = 0,05. Resultados: As espécies identificadas mais frequentes foram: M. abscessus, 28,5% (17/59); M. lentiflavum 18,6% (11/59); M. avium, 16,6% (10/59). A média de idade ± dp do grupo foi de 50,4 ± 16,1 anos; 62,7% (37/59) do sexo masculino e 62, 7% tinham no máximo o ensino fundamental; 72,9% (43/59) renda até um salário mínimo; 49,2% (29/59) uso de álcool e 40,6% (24/59) tabagismo; 62,7% (37/59) profissão com risco biológico; 86% (51/59) residiam em Fortaleza; A tosse foi observada em 91,5% (54/59) e expectoração em 72,9% (43/59); Fibrose e cavidade foram observadas em 71,2% (42/59) e 45,8 (27/59), respectivamente. Sorologia HIV foi positiva em 7% (4/59); teste tuberculínico realizado em 22% (13/59), desses, 92,3% (12/13) positivos; 54% (32/59) tiveram alta por cura e 15,3% (9/59) óbito. As associações entre profissão com risco biológico e sexo feminino, profissão com risco biológico e comorbidade, e profissão e renda familiar mostraram-se significantes. A análise de associação da patogenicidade da espécie de MNT isolada com as outras variáveis do estudo não mostrou significância, ou seja, nenhuma foi discriminativa. Este estudo demonstra a importância para o reconhecimento da doença pulmonar por MNT, cujas espécies podem ser identificadas em amostras de escarro.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-10-17Bitstream added on 2014-06-13T20:49:49Z : No. of bitstreams: 1 martins_dr_me_botfm.pdf: 1423175 bytes, checksum: c2ecf3527dbbca2e6ab24a1b745d5696 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Gap / A eficacia da vacina BCG (Mycobacterium bovis atenuado) contra tuberculose pulmonar apresenta grande variabilidade em diferentes populacoes. Dentre as hipoteses sugeridas, prevalece a que atribui esta variacao as interacoes entre a vacina e micobacterias presentes no meio ambiente. Estudos tem demonstrado que antigenos expressos pelo BCG estao conservados no M. avium, corroborando com a hipotese de que a exposicao as micobacterias ambientais gera resposta imune cruzada que interfere com a eficacia do BCG. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da exposicao previa de camundongos ao M. avium inativado na resposta imune e eficacia protetora induzidas pela vacina DNAhsp65 (pVAXhsp65) na tuberculose experimental murina. Na primeira etapa, grupos de camundongos BALB/c femeas foram injetados com diferentes doses (0,08x106, 4x106 e 200x106) de M. avium inativado termicamente, pela via subcutanea. Apos tres semanas, os animais foram imunizados com DNAhsp65 por via intramuscular. Os animais receberam tres doses de DNA (100ug/intervalos de 15 dias). Grupos controle receberam somente M. avium, vacina (pVAXhs65), vetor (pVAX) ou solucao salina esteril. A producao de citocinas e os niveis de anticorpos foram determinados por ELISA. Na segunda etapa, os animais foram inicialmente sensibilizados por via subcutanea com 200x106 Unidades Formadoras de Colonias (UFC) de M. avium inativado e depois imunizados com tres doses de pVAXhsp65 (100ug/intervalos de 15 dias) por via intramuscular. Os grupos controle foram injetados com salina, pVAX (4 doses), pVAXhsp65 (4 doses), M. avium, M. avium mais pVAX (3 doses) ou M. avium mais pVAXhsp65 (3 doses). Quinze dias apos a ultima dose de DNA os animais foram infectados com 1x104 UFC de M. tuberculosis, H37Rv, pela via intratraqueal. Trinta dias apos o desafio os animais foram sacrificados e a carga bacteriana determinada pelo numero de UFC nos pulmoes. Cortes histopatologicos dos pulmoes tambem foram analisados. / The efficacy of BCG vaccine (attenuated Mycobacterium bovis) against pulmonary tuberculosis varies enormously in different populations. The prevailing hypothesis attributes this variation to interactions between the vaccine and mycobacteria common in the environment. Studies have revealed that most protective antigens expressed by the antituberculous vaccine are conserved in M. avium, supporting the hypothesis that exposure to environmental mycobacteria generates a crossreactive immune response that interferes with BCG efficacy.The objective of this investigation was to evaluate the effect of a prior exposure to heat killed M. avium on both, the immune response and the protective efficacy induced by a DNAhsp65 vaccine (pVAXhsp65) in experimental murine tuberculosis. To evaluate the effect on the immune response, BALB/c female mice were, initially, injected with distinct doses (0,08x104, 4x106 and 200x106) of heat killed M. avium by subcutaneous route. Three weeks later the animals were immunized with 3 doses of DNAhsp65 by intramuscular route (100æg / 15 days apart). Control groups received only M. avium, vaccine (pVaxhsp65), vector (pVax) or saline solution. Cytokine production and antibody levels were determined by ELISA. To evaluate the effect on the protective efficacy, animals were initially, sensitized with 2x108 heat killed CFU of M. avium by subcutaneous route and then immunized with 3 doses of pVAXhsp65 (100æg/15 days apart) by intramuscular route. Control groups were injected with saline, pVAX (4 doses), pVAXhsp65 (4 doses), M. avium, M. avium plus pVAX (3 doses) or M. avium plus pVAXhsp65 (3 doses). Fifteen days after last DNA dose the animals were infected with 1x104 viable CFU of H37Rv M. tuberculosis by intratracheal route. Thirty days after challenge the animals were sacrificed and the bacterial burden was determined by the number of CFU in the lungs. Lung histological sections were also analysed.

Orientador: Alexandrina Sartori / Banca: Jussara Marcondes Machado / Banca: Vânia Luiza Deperon Bonato / Resumo: A eficacia da vacina BCG (Mycobacterium bovis atenuado) contra tuberculose pulmonar apresenta grande variabilidade em diferentes populacoes. Dentre as hipoteses sugeridas, prevalece a que atribui esta variacao as interacoes entre a vacina e micobacterias presentes no meio ambiente. Estudos tem demonstrado que antigenos expressos pelo BCG estao conservados no M. avium, corroborando com a hipotese de que a exposicao as micobacterias ambientais gera resposta imune cruzada que interfere com a eficacia do BCG. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da exposicao previa de camundongos ao M. avium inativado na resposta imune e eficacia protetora induzidas pela vacina DNAhsp65 (pVAXhsp65) na tuberculose experimental murina. Na primeira etapa, grupos de camundongos BALB/c femeas foram injetados com diferentes doses (0,08x106, 4x106 e 200x106) de M. avium inativado termicamente, pela via subcutanea. Apos tres semanas, os animais foram imunizados com DNAhsp65 por via intramuscular. Os animais receberam tres doses de DNA (100ug/intervalos de 15 dias). Grupos controle receberam somente M. avium, vacina (pVAXhs65), vetor (pVAX) ou solucao salina esteril. A producao de citocinas e os niveis de anticorpos foram determinados por ELISA. Na segunda etapa, os animais foram inicialmente sensibilizados por via subcutanea com 200x106 Unidades Formadoras de Colonias (UFC) de M. avium inativado e depois imunizados com tres doses de pVAXhsp65 (100ug/intervalos de 15 dias) por via intramuscular. Os grupos controle foram injetados com salina, pVAX (4 doses), pVAXhsp65 (4 doses), M. avium, M. avium mais pVAX (3 doses) ou M. avium mais pVAXhsp65 (3 doses). Quinze dias apos a ultima dose de DNA os animais foram infectados com 1x104 UFC de M. tuberculosis, H37Rv, pela via intratraqueal. Trinta dias apos o desafio os animais foram sacrificados e a carga bacteriana determinada pelo numero de UFC nos pulmoes. Cortes histopatologicos dos pulmoes tambem foram analisados. / Abstract: The efficacy of BCG vaccine (attenuated Mycobacterium bovis) against pulmonary tuberculosis varies enormously in different populations. The prevailing hypothesis attributes this variation to interactions between the vaccine and mycobacteria common in the environment. Studies have revealed that most protective antigens expressed by the antituberculous vaccine are conserved in M. avium, supporting the hypothesis that exposure to environmental mycobacteria generates a crossreactive immune response that interferes with BCG efficacy.The objective of this investigation was to evaluate the effect of a prior exposure to heat killed M. avium on both, the immune response and the protective efficacy induced by a DNAhsp65 vaccine (pVAXhsp65) in experimental murine tuberculosis. To evaluate the effect on the immune response, BALB/c female mice were, initially, injected with distinct doses (0,08x104, 4x106 and 200x106) of heat killed M. avium by subcutaneous route. Three weeks later the animals were immunized with 3 doses of DNAhsp65 by intramuscular route (100æg / 15 days apart). Control groups received only M. avium, vaccine (pVaxhsp65), vector (pVax) or saline solution. Cytokine production and antibody levels were determined by ELISA. To evaluate the effect on the protective efficacy, animals were initially, sensitized with 2x108 heat killed CFU of M. avium by subcutaneous route and then immunized with 3 doses of pVAXhsp65 (100æg/15 days apart) by intramuscular route. Control groups were injected with saline, pVAX (4 doses), pVAXhsp65 (4 doses), M. avium, M. avium plus pVAX (3 doses) or M. avium plus pVAXhsp65 (3 doses). Fifteen days after last DNA dose the animals were infected with 1x104 viable CFU of H37Rv M. tuberculosis by intratracheal route. Thirty days after challenge the animals were sacrificed and the bacterial burden was determined by the number of CFU in the lungs. Lung histological sections were also analysed. / Mestre

O ferro (Fe) é um dos metais mais importantes para a homeostase. Está envolvido em vários processos fisiológicos como, por exemplo, processo redox, síntese de DNA, metabolismo energético e transporte de biomoléculas. A regulação da concentração deste metal é bem controlada já que o seu excesso pode culminar na produção de espécies reativas de oxigênio que causam dano celular e sua escassez inibe o sistema imunológico. Um dos elementos chaves para o sucesso da cura de doenças infecciosas está na capacidade do hospedeiro em conter a proliferação do microrganismo e na ativação controlada da imunidade celular. Assim como os organismos eucariotos, grande parte dos organismos procariotos necessita de Fe para proliferação e manutenção das atividades biológicas. Deste modo, a interação entre esses dois organismos promove uma batalha para a captura deste metal que pode influenciar no curso de uma doença infecciosa tanto para o beneficio do hospedeiro quanto para o patógeno invasor. A Tuberculose (TB) é a maior causa de morte por doença infecciosa em adultos no mundo sendo responsável pela morte de 1 milhão de pessoas anualmente. Embora a doença tenha grande possibilidade de cura e tratamento disponível para a população, a reincidência de TB é alta e o surgimento de cepas resistentes à antibioticoterapia cresce gradativamente. Diante disso, é necessário compreender cada vez mais o processo fisiopatológico envolvido na TB para buscar novos alvos terapêuticos para cura e redução dos índices de mortalidade. O presente estudo tem como objetivo avaliar a expressão de genes envolvidos na homeostase do ferro em macrófagos humanos após a infecção com Mycobacterium tuberculosis H37Rv e o isolado clinico hipervirulento Mycobacterium tuberculosis Beijing 1471 com e sem suplementação de ferro. Para isso, macrófagos infectados foram lisados para obtenção e purificação de RNA total e o estudo de expressão gênica foi realizado utilizando a tecnologia de PCR em tempo real (RT-qPCR). Além disso, foi determinada a concentração de ferro no sobrenadante dessas culturas bem como o crescimento desses microrganismos no interior dos macrófagos. Genes envolvidos no controle da internalização do Fe em macrófagos foram diferentemente expressos nas culturas infectadas em relação ao controle não infectado. Também foi possível observar que a expressão desses genes varia com o tempo de infecção e com o tratamento com ferro, demostrando que existe um esforço da célula hospedeira em conter a infecção. Não foi observado variação significativa com relação à dosagem de ferro no sobrenadante das culturas infectadas em relação ao controle e o crescimento das micobactérias dentro dos macrófagos não variou de maneira significativa com relação aos tratamentos empregados. Dessa forma, este estudo contribuiu para o esclarecimento da resposta do macrófago frente à infecção com micobactérias que apresentam perfil de virulência distinto entre si e a interação do ferro neste processo patológico. / Iron (Fe) is one of the most important metals to homeostasis. It is involved in various physiological processes such as redox process, DNA synthesis, energy metabolism and transport of biomolecules. The concentration regulation of this metal is well-controlled since its excess can lead to the production of reactive oxygen species that cause cell damage and its scarcity inhibits the immune system. One of the key elements for the cure of infectious diseases is the host\'s ability to contain the spread of the organism and control activation of cellular immunity. Just as eukaryotes, most prokaryotes organisms require Fe for its proliferation and maintenance of biological activities. Thus, the interaction between these two organisms promotes a battle to capture this metal that can influence the course of an infectious disease either to the benefit of the host or to the invading pathogen. Tuberculosis (TB) is the leading cause of death from infectious disease among adults worldwide and is responsible for the death of 1 million people annually. Although the disease has high possibility of cure and treatment available to the population, the recurrence of TB is high and the emergence of resistant strains to antibiotics grows gradually. Therefore, it is necessary to understand more the pathophysiological process involved in TB to seek new therapeutic targets for healing and reduction in mortality. The present study aims to evaluate the expression of genes involved in iron homeostasis in human macrophages after infection with Mycobacterium tuberculosis H37Rv and the hypervirulent clinical isolate Mycobacterium tuberculosis Beijing in 1471 with and without iron supplementation. For this, macrophages were lysed and purificated to obtain total RNA, and the study of gene expression was performed using the technology of Real-time PCR (RT-qPCR). Furthermore, the iron concentration in the supernatant of these cultures was determined as well as growth of these microorganisms in macrophages. Genes involved in controlling internalization of Fe in macrophages were differently expressed in infected compared to uninfected control cultures. It was also observed that the expression of these genes varies with the time of infection and treatment with iron, showing that there is an effort of host cell to contain the infection. No significant variation was observed onto the iron dosage in the supernatant of infected compared to control cultures and the growth of mycobacteria inside macrophages did not vary significantly between treatments. Thus, this study contributed to the clarification of the macrophage response to infection with mycobacteria that have distinct virulence profile among themselves and the interaction of the iron in this disease process.

O ferro (Fe) é um dos metais mais importantes para a homeostase. Está envolvido em vários processos fisiológicos como, por exemplo, processo redox, síntese de DNA, metabolismo energético e transporte de biomoléculas. A regulação da concentração deste metal é bem controlada já que o seu excesso pode culminar na produção de espécies reativas de oxigênio que causam dano celular e sua escassez inibe o sistema imunológico. Um dos elementos chaves para o sucesso da cura de doenças infecciosas está na capacidade do hospedeiro em conter a proliferação do microrganismo e na ativação controlada da imunidade celular. Assim como os organismos eucariotos, grande parte dos organismos procariotos necessita de Fe para proliferação e manutenção das atividades biológicas. Deste modo, a interação entre esses dois organismos promove uma batalha para a captura deste metal que pode influenciar no curso de uma doença infecciosa tanto para o beneficio do hospedeiro quanto para o patógeno invasor. A Tuberculose (TB) é a maior causa de morte por doença infecciosa em adultos no mundo sendo responsável pela morte de 1 milhão de pessoas anualmente. Embora a doença tenha grande possibilidade de cura e tratamento disponível para a população, a reincidência de TB é alta e o surgimento de cepas resistentes à antibioticoterapia cresce gradativamente. Diante disso, é necessário compreender cada vez mais o processo fisiopatológico envolvido na TB para buscar novos alvos terapêuticos para cura e redução dos índices de mortalidade. O presente estudo tem como objetivo avaliar a expressão de genes envolvidos na homeostase do ferro em macrófagos humanos após a infecção com Mycobacterium tuberculosis H37Rv e o isolado clinico hipervirulento Mycobacterium tuberculosis Beijing 1471 com e sem suplementação de ferro. Para isso, macrófagos infectados foram lisados para obtenção e purificação de RNA total e o estudo de expressão gênica foi realizado utilizando a tecnologia de PCR em tempo real (RT-qPCR). Além disso, foi determinada a concentração de ferro no sobrenadante dessas culturas bem como o crescimento desses microrganismos no interior dos macrófagos. Genes envolvidos no controle da internalização do Fe em macrófagos foram diferentemente expressos nas culturas infectadas em relação ao controle não infectado. Também foi possível observar que a expressão desses genes varia com o tempo de infecção e com o tratamento com ferro, demostrando que existe um esforço da célula hospedeira em conter a infecção. Não foi observado variação significativa com relação à dosagem de ferro no sobrenadante das culturas infectadas em relação ao controle e o crescimento das micobactérias dentro dos macrófagos não variou de maneira significativa com relação aos tratamentos empregados. Dessa forma, este estudo contribuiu para o esclarecimento da resposta do macrófago frente à infecção com micobactérias que apresentam perfil de virulência distinto entre si e a interação do ferro neste processo patológico. / Iron (Fe) is one of the most important metals to homeostasis. It is involved in various physiological processes such as redox process, DNA synthesis, energy metabolism and transport of biomolecules. The concentration regulation of this metal is well-controlled since its excess can lead to the production of reactive oxygen species that cause cell damage and its scarcity inhibits the immune system. One of the key elements for the cure of infectious diseases is the host\'s ability to contain the spread of the organism and control activation of cellular immunity. Just as eukaryotes, most prokaryotes organisms require Fe for its proliferation and maintenance of biological activities. Thus, the interaction between these two organisms promotes a battle to capture this metal that can influence the course of an infectious disease either to the benefit of the host or to the invading pathogen. Tuberculosis (TB) is the leading cause of death from infectious disease among adults worldwide and is responsible for the death of 1 million people annually. Although the disease has high possibility of cure and treatment available to the population, the recurrence of TB is high and the emergence of resistant strains to antibiotics grows gradually. Therefore, it is necessary to understand more the pathophysiological process involved in TB to seek new therapeutic targets for healing and reduction in mortality. The present study aims to evaluate the expression of genes involved in iron homeostasis in human macrophages after infection with Mycobacterium tuberculosis H37Rv and the hypervirulent clinical isolate Mycobacterium tuberculosis Beijing in 1471 with and without iron supplementation. For this, macrophages were lysed and purificated to obtain total RNA, and the study of gene expression was performed using the technology of Real-time PCR (RT-qPCR). Furthermore, the iron concentration in the supernatant of these cultures was determined as well as growth of these microorganisms in macrophages. Genes involved in controlling internalization of Fe in macrophages were differently expressed in infected compared to uninfected control cultures. It was also observed that the expression of these genes varies with the time of infection and treatment with iron, showing that there is an effort of host cell to contain the infection. No significant variation was observed onto the iron dosage in the supernatant of infected compared to control cultures and the growth of mycobacteria inside macrophages did not vary significantly between treatments. Thus, this study contributed to the clarification of the macrophage response to infection with mycobacteria that have distinct virulence profile among themselves and the interaction of the iron in this disease process.

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:56:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao - Cynthia.pdf: 1641533 bytes, checksum: 56ac8be8ae2e1e0e55c011b99fe0d3aa (MD5) Previous issue date: 2009-03-20 / Rapidly growing mycobacteria (RGM) can cause a wide spectrum of disseminated or localized diseases, especially pulmonary, skin, or soft tissue infections. In last years infections due to contaminated materials and invasive procedures have been also increasingly reported. Recent outbreaks of infections affecting more than 1000 patients submitted to different invasive procedures in Brazil underscores this issue. Of the RGM, members of the M. chelonae - M. abscessus group are the most pathogenic and antimicrobial resistant. Even with multiple drug combinations, multiresistant RGM infections may be difficult to cure. In this study we describe the molecular identification, typing and in vitro susceptibilities to antimicrobial agents of RGM involved in recent infections in Brazil. The study was carried out in two groups of RGM isolates: one group recovered from different outbreaks (75 isolates) and a second group recovered from sporadic infections (10 isolates). hsp65 and rpoB gene sequencing was used for discrimination between species of M. chelonae - M. abscessus group and pulsed field gel electrophoresis (PFGE) was used to evaluate possible clonal relatedness and diversity among the isolates. Broth microdilution MICs of 15 antimicrobial agents were determined for these clinical isolates. Three species were identified in RGM outbreaks: M. massiliense from video assisted surgeries; M. bolletii from mesotherapy and M. abscessus from liposuction and mammaplasty. Molecular typing by PFGE demonstrated the clonal relatedness within M. massiliense isolates and within M. abscessus isolates. Mesotherapy and pulmonary isolates presented different PFGE patterns. Our results showed that the isolates drug resistance does not differed markedly by PFGE pattern. The resistance rates of these isolates to the currently available agents were high. The majority of M. massiliense isolates was susceptible to clarithromycin, amikacin and tigecyclin, whereas M. bolletii and M. abscessus isolates were susceptible only to amikacin and tigecyclin and moderately susceptible to cefoxitin. In conclusion, despite in vitro drug sensitivity tests limitations, the results provided may be sufficient to guide clinicians in selecting appropriate therapy for RGM infections. / Micobactérias de crescimento rápido (MCR) podem causar um amplo espectro de doenças, desde infecções cutâneas superficiais até doenças disseminadas graves. Relatos de infecções adquiridas devido ao uso de materiais contaminados e a procedimentos cirúrgicos invasivos têm aumentado nos últimos anos. Os surtos ocorridos recentemente no Brasil e que afetaram mais de 1000 pacientes comprovam este fato. Entre as espécies de MCR, aquelas pertencentes ao grupo M. chelonae - M. abscessus são as mais patogênicas e resistentes aos antimicrobianos. Mesmo em vigência de poliquimioterapia, pacientes portadores de infecções causadas por MCR podem não obter cura clínica. Neste estudo, identificamos espécies de MCR envolvidas em surtos e infecções esporádicas no Brasil no período de 2004 a 2008 e analisamos seus perfis genotípicos e de sensibilidade a antimicrobianos. Para isso, realizamos o estudo em dois grupos de MCR: o primeiro constituído por isolados relacionados a surtos (75 isolados) e o segundo por isolados não relacionados a surtos (10 isolados). O seqüenciamento dos genes hsp65 e rpoB foi utilizado para diferenciar entre as espécies do grupo M. chelonae - M. abscessus e a eletroforese em campo pulsátil (PFGE) para avaliar possíveis semelhanças entre os perfis genotípicos. A determinação das concentrações inibitórias mínimas (MIC) de 15 antimicrobianos frente aos isolados de MCR foi determinado pelo método de microdiluição em caldo. A partir dos testes realizados, foram identificadas 3 espécies de MCR relacionadas a surtos: M. massiliense, relacionado a videocirurgias; M. bolletii relacionado a mesoterapia; e M. abscessus, relacionado a cirurgias estéticas. A análise genotípica por PFGE desses isolados permitiu demonstrar ou comprovar a relação clonal entre os isolados de M. massiliense e entre os isolados de M. abscessus. Porém, os isolados provenientes de mesoterapia e infecções esporádicas apresentaram diferentes perfis genotípicos. As espécies analisadas, independentemente de sua origem (surto ou infecção esporádica) apresentaram uma ampla resistência in vitro aos antimicrobianos. Isolados de M. massiliense só apresentaram sensibilidade in vitro à claritromicina, amicacina e tigeciclina, enquanto os isolados de M. bolletii e M. abscessus foram sensíveis somente à amicacina e tigeciclina e moderadamente sensíveis à cefoxitina. Em conclusão, a análise ampla dos perfis genotípicos e, sobretudo de resistência, como efetuado neste trabalho, mesmo com as limitações próprias de um critério fenotípico in vitro, pode auxiliar o médico na fundamentação do esquema terapêutico.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:30:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao eduardo martins de sousa med trop.pdf: 881180 bytes, checksum: dec3e190185b786a8f3ab68beeafdecb (MD5) Previous issue date: 2009-02-11 / Atypical mycobacteria are microorganism s appart from the etiological agents responsible for tuberculosis and leprosy. They are currently considered as emerging pathogens associated with simple surgical procedures, and are resistant to conventional antibiotics. The atypical mycobacterial infections is responsible for three in every 10 thousand people per year, but the incidence has been increasing as the number of individuals infected with HIV also increases. The low virulence of atypical mycobacteria associates its pathogenicity to decreased resistance of the host, and consequently it is necessary to better understand the interaction between host and microorganism. The cellular and humoral immune response of BALB/c mice and C57BL/6 mice infected with M. massiliense isolated from an outbreak of hospitals in the city of Goiania was evaluated. The isolate of M. massiliense used in this study was able to infect immunocompetent mice, which completely controlled the bacterial load before the 30 days of infection. The mechanisms by which these animals cleared the mycobacteria were: production of NO by peritoneal macrophages, presence of specific IgG1 and induction of mRNA for inflammatory cytokines, as well as regulatory cytokines in inflammation. / Micobactérias atípicas são microrganismos distintos dos agentes etiológicos responsáveis pela tuberculose e pela lepra (Hanseníase). São considerados atualmente como patógenos emergentes associados a procedimentos cirúrgicos simples, e são resistentes aos antibióticos convencionais. As infecções por micobacterias atípicas atingem três em cada 10 mil pessoas por ano, porém a incidência vem aumentando à medida que cresce o número de indivíduos infectados por HIV. A baixa virulência das micobactérias atípicas condiciona a sua patogenicidade à diminuiçäo da resistência do hospedeiro, por isso faz-se necessário uma melhor investigação da interação do microrganismo com o hospedeiro. Nesta dissertação, a resposta imune celular e humoral de camundongos BALB/c e C57BL/6 frente à infecção por M. massiliense isolada de surto hospitalar na cidade de Goiânia foi avaliada. O isolado de M. massiliense utilizado neste estudo foi capaz de infectar camundongos imunocompetentes, que controlaram completamente a carga bacteriana antes dos 30 dias de infecção. Os mecanismos pelos quais estes animais eliminaram as micobactérias foram: produção de NO por macrófagos peritoneais, presença de IgG1 específica e indução de mRNA para citocinas inflamatórias, assim como de citocinas reguladoras da inflamação.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-05-20T11:06:25Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rogerio Coutinho das Neves - 2015.pdf: 6048850 bytes, checksum: 1bac6d1d4aa28a3cf0ebbb228b593986 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-05-20T11:12:51Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rogerio Coutinho das Neves - 2015.pdf: 6048850 bytes, checksum: 1bac6d1d4aa28a3cf0ebbb228b593986 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-20T11:12:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rogerio Coutinho das Neves - 2015.pdf: 6048850 bytes, checksum: 1bac6d1d4aa28a3cf0ebbb228b593986 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Outbreaks caused by atypical mycobacteria are considered as an emerging problem in Brazil and Goias, being frequently associated with invasive procedures, such as laparoscopy, arthroscopy, and aesthetic surgeries among others. Treatment of mycobacteriosis requires highly toxic drugs with doubtful sterilizing effects. Consequently, several studies aim to search for new drugs or molecules with anti-mycobacterial biological activities. The objective of this study was to prospect biomolecules from the venom of the social wasp Polybia paulista (Vespoidea, Vespidae, Polistinae) and from the Tityus sp scorpion with antimycobacteria activity against Mycobacterium abscessus subsp. bolletii (GO06). Peptides from the wasp and scorpion venoms were evaluated in broth microdilution assay and in macrophage infected cultures to determine minimum inhibitory concentration. Peptides with antimycobacterial activity were further evaluated by scanning electron microscopy of M. abscessus subsp. bolletii treated cultures. The peptide toxicities were evaluated on macrophage cultures. Peptides Agelaia-MP, Polybia-MPII, and AVA, derived from wasp and peptides AMP 1, 2, 4, 6, and 8 derived from scorpion presented antimycobacterial activities. AVA and AMP 4 peptides were not toxic for macrophages. In this work three peptides derived from the wasp venom and five peptides derived from the scorpion venom were identified as having antimycobacterial activity. / Surtos causados por micobactérias atípicas são considerados emergentes no Brasil e em Goiás e têm tem sido associados a procedimentos invasivos, como a laparoscopia, artroscopia e cirurgia estética dentre outros. O tratamento de micobacterioses envolve drogas altamente tóxicas que apresentam efeito esterilizante relativo. Portanto, vários estudos têm como alvo a busca de novas drogas ou moléculas biológicas com atividade micobactericida. O objetivo deste estudo foi prospectar biomoléculas do veneno de vespa social Polybia paulista (Vespoidea, Vespidae, Polistinae) e de escorpiões do gênero Tityus com atividade micobactericida in vitro contra Mycobacterium abscessus subsp. bolletii (GO06). Peptídeos derivados do veneno da vespa e do escorpião foram avaliados por microdiluição em caldo, e em culturas de macrófagos infectados determinando a concentração inibitória mínima. Para os peptídeos com atividade micobactericida, o potencial dano causado à parede celular da micobactéria foi analisado por microscopia eletrônica de varredura. A toxicidade de dois peptídeos com potencial uso farmacológico foram avaliados em culturas de macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c. Os peptídeos Agelaia-MP, Polybia-MPII e AVA derivados do veneno da vespa e os peptídeos AMP 1, 2, 4, 6 e 8 derivados do veneno de escorpião apresentaram atividade micobactericida. Os peptídeos micobactericidas agem desestruturando os envoltório das bacilos de M. abscessos subsp. bolletti. Os peptídeos AVA e o AMP 4 não apresentaram toxicidade para culturas de macrófagos, e reduziram a carga bacilar de culturas de macrófagos infectadas com M. abscessus subsp. bolletii. Neste trabalho identificou-se três peptídeos derivados da peçonha de vespa e cinco peptídeos derivados de veneno de escorpião com atividade micobactericida.