Advances in molecular methods for analyzing DNA, RNA and proteins in humans as well as in other animals, plants, fungi, bacteria or viruses have greatly increased the resolution with which we can study life’s complexity and dynamics on earth. While genomic, transcriptomic and proteomic laboratory tools for molecular diagnosis of disease are rapidly becoming more comprehensive, the access to such advanced yet often expensive and centralized procedures is limited. There is a great need for rapid and comprehensive diagnostic methods in low-resource settings or contexts where a person can not or will not go to a hospital or medical laboratory, yet where a clinical analysis is urgent. In this thesis, results from development and characterization of novel technologies for DNA and protein microarray analysis are presented. Emphasis is on methods that could provide rapid, cost-effective and portable analysis with convenient readout and retained diagnostic accuracy. The first study presents a magnetic bead-based approach for DNA microarray analysis for a rapid visual detection of single nucleotide polymorphisms. In the second work, magnetic beads were used as detection reagents for rapid differential detection of presence of pestiviral family members using a DNA oligonucleotide microarray with read-out by means of a tabletop scanner or a digital camera. In paper three, autoimmune responses from human sera were detected on a protein autoantigen microarray, again by means of magnetic bead analysis. Here, special emphasis was made in comprehensively comparing the performance of the magnetic bead detection to common fluorescence-based detection. In the fourth study, an immunochromatographic lateral flow protein microarray assay is presented for application in the classification of contagious pleuropneumonia from bovine serum samples. The analysis could be performed within 10 minutes using a table top scanner, and the performance of the assay was shown to be comparable to that of a cocktail ELISA. In the fifth paper, the lateral flow microarray framework is investigated in further detail by means of experiments and numerical simulation. It was found that downstream effects play an important role, and the results further suggest that the downstream binding profiles may find use in simple affinity evaluation. / QC 20100713

La nisine est un peptide antimicrobien produit par la souche de Lactococus lactis subsp. lactis, autorisée pour des applications alimentaires par le comité d'experts sur les additifs alimentaires et les aliments de l'Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l'Agriculture et de l’Organisation Mondiale de la Santé (FAO / OMS). La nisine peut être appliquée, par exemple, pour la conservation des aliments, la biopréservation, le contrôle de la flore de fermentation, et potentiellement comme agent antimicrobien clinique. Le piégeage de bactéries capables de produire de la nisine dans des billes d'alginate de calcium est ainsi une voie prometteuse pour immobiliser des cellules actives et prolonger la durée de conservation des aliments. Le travail de thèse visait à concevoir des emballages actifs en biopolymère renfermant des bactéries lactiques bioprotectrices (LAB) pour contrôler la croissance de micro-organismes indésirables dans les aliments, en particulier L. monocytogenes. La stabilité mécanique et chimique des billes d'alginate a d’abord été améliorée, et l'efficacité d'encapsulation a été accrue. Des capsules « alginate / pectine (A / P) » ont été préparés comme premières microsphères, par une technique d'extrusion. La production de nisine par Lactococcus lactis subsp. lactis encapsulé dans différents états physiologiques (phase exponentielle, phase stationnaire) a été étudiée. Les résultats ont montré que les billes composites (A/P) avaient de meilleurs propriétés que celles formulées avec de l'alginate ou de la pectine pure. L’association de l'alginate et de la pectine induit un effet synergique qui a amélioré les propriétés mécaniques des microbilles. La deuxième partie du travail a concerné la mise au point de microcapsules à cœur liquides avec une membrane d'hydrogel d'alginate et d'un noyau de gomme de xanthane. Les résultats ont montré que ces microcapsules contenant L. lactis encapsulé durant la phase exponentielle dans une matrice d’alginate et un noyau nutritif de gomme xanthane ont donné les meilleurs résultats et présentent une activité anti-listeria intéressante. Ces microbilles ont enfin été appliquées pour la conservation des aliments et en particulier dans des emballages alimentaires actifs. Des films (HPMC, amidon) ont été élaborés en piégeant des perles d'«alginate actifs/gomme xanthane» enrichies en L. lactis dans des films d’emballage et appliqués pour la conservation des aliments / Nisin is an antimicrobial peptide produced by strains of Lactococus lactis subsp. lactis, recognized as safe for food applications by the Joint Food and Agriculture Organization/World Health Organization (FAO/WHO). Nisin could be applied, for shelf-life extension, biopreservation, control of fermentation flora, and potentially as clinical antimicrobials. Entrapment of bacteria able to produce nisin in calcium alginate beads is promising way for cells immobilization in active films to extend food shelf-life. The present PhD work aimed to design biopolymeric active packaging entrapping bioprotective lactic acid bacteria (LAB) and control undesirable microorganisms growth in foods, particularly L. monocytogenes. First, the mechanical and chemical stability of the alginate beads were improved, and consequently the effectiveness of encapsulation was increased. Alginate/pectin (A/P) biopolymers were prepared, as first microspheres design, by extrusion technique to encapsulate nisin-producing Lactococcus lactis subsp. lactis in different physiological state (exponential phase, stationary phase). Results showed that A/P composite beads were more efficient to increase beads properties than those formulated with pure alginate or pectin. Association of alginate and pectin induced a synergistic effect which improved microbeads mechanical properties. As a second microspheres design, aqueous-core microcapsules were prepared with an alginate hydrogel membrane and a xanthan gum core. Results showed that microcapsules with L.lactis in exponential state encapsulated in alginate membrane and aqueous-core based on xanthan gum with nutrients gave the best results and exhibit interesting antilisterial activity. These microparticles were applied in food preservation and particularly in active food packaging. A novel bioactive films (HPMC, starch) was developed and tested, entrapping active beads of alginate/xanthan gum core-shell microcapsules and alginate/pectin hydrogel enriched with L.lactis

Las marcas viales constituyen la única guía óptica que en muchas ocasiones tienen los usuarios de la vía, su correcta aplicación y conservación nos puede llegar a determinar la gravedad de un accidente hasta el punto de poder llegar a evitarlo. Por tanto, el correcto mantenimiento y repintado de la señalización vial horizontal en las carreteras convencionales a nivel mundial y de la red viaria española en particular, la investigación en nuevas combinaciones de materiales y el estudio de su durabilidad dependiendo del posicionamiento que ocupa la marca vial en carretera, nos aportan, sin duda, un apoyo útil para progresar en la lucha contra la accidentalidad vial. Por ese motivo, se ha investigado, no sólo la evolución temporal de las características fundamentales de la señalización vial horizontal como son: la visibilidad diurna, la visibilidad nocturna y la resistencia al deslizamiento de nuevas combinaciones de materiales de post-mezclado y materiales base, como es la pintura fosforescente; sino que, al mismo tiempo, se ha elaborado una relación y un estudio de la vida útil de la marca vial atendiendo a sus características fundamentales según la zona de la calzada que ocupa esa marca vial, estableciendo las pautas de comportamiento de las mismas y cuándo reemplazarlas por no cumplir con los criterios mínimos de aceptación, relacionando la sección de desgaste a cada una de las marcas viales que podemos encontrar en las carreteras convencionales de la red viaria española. Para ello, hemos elaborado un testing ground (TG1), en la carretera CV-904, con un total de 36 samples, teniendo para cada sentido de circulación 18 combinaciones de materiales atendiendo a material base y material de post-mezclado (microesferas de vidrio, cargas antideslizantes no transparentes y grano de vidrio transparente), y a su sistema de aplicación (monolayer o bilayer). Además, hemos ejecutado un segundo testing ground (TG2), en la ronda interna de la propia Universidad de Alicante, donde, partiendo de los conocimientos obtenidos en el primer estudio, se han fabricado nuevas combinaciones de materiales incluyendo el material base, diferentes tipos de microesferas de vidrio y cargas antideslizantes como parte del material de post-mezclado, se ha añadido pintura con pigmentos fosforescentes para mejorar la visibilidad nocturna y barniz de recubrimiento premezclado con agregados antideslizantes para prolongar la vida útil de la marca vial, fabricando un total de 40 samples analizadas en laboratorio. No sólo se han estudiado los resultados de los parámetros fundamentales de cada sample, sino que nos hemos apoyado en la toma de fotografías in situ analizándolas cualitativamente, lo que nos ha ayudado a comprender su evolución y los resultados. Al mismo tiempo hemos tomado muestras de todas ellas para su observación en laboratorio. Tras la comparativa entre la evolución de cada característica principal de las probetas y su análisis, hemos establecido los períodos de la vida útil de cada una de ellas según la zona de afección en la que están ubicadas atendiendo a la Norma 8.2-IC. Cabe destacar que se ha dejado la línea de investigación relacionada con la interconexión entre el vehículo autónomo, la infraestructura viaria y la señalización vial horizontal abierta como principal futura línea de investigación.

Microorganisms grow in planktonic form, but more often they adhere to a number of surfaces and create three-dimensional structures called biofilms. Floating biofilms, which are formed at the water-air interface, are one of the life strategies, which the bacteria can take. Non-pathogenic Mycobacterium smegmatis was used as a laboratory model for the study of this kind of biofilm. The understanding of mechanisms of their formation of this species may be applicable to the pathogenic species of the genus Mycobacterium, study of which in the laboratory brings a number of disadvantages. This diploma thesis focuses on the morphological and proteome analysis of the M. smegmatis floating biofilm. Using a stereo microscope and scanning electron microscopy was observed that bacteria clump and create the "nucleation centres" at the beginning of the biofilm development. This centers grow to the surroundings and connect afterwards. In the later stages of the development the centers fuse in compact layer, which then grows into the compact and multilayer biofilm. The key method in this study was two-dimensional electrophoresis of proteins. The proteome analysis of floating biofilm was performed with this method. The preparation of protein samples and the method for protein concentration measurement was optimized....

La connaissance et la maîtrise de la présence d’un biofilm représentent aujourd’hui un challenge important. Dans le contexte d’étude des capacités de développement des biofilms, BioFilm Control fait figure de pionnier grâce à leur test nommé Biofilm Ring Test. Basé sur une sollicitation du biofilm via l’attraction, par un aimant, de microbilles magnétiques au centre du puits, le test évalue la présence de biofilm par l’absence de regroupement des billes au centre du puits à un instant donné. L’enjeu de ce travail est de décliner le BioFilm Ring Test® en un examen dynamique, non destructif et à l’échelle microscopique. Dans le biofilm, la matrice polymérique assure la cohésion entre cellules et confère une protection aux bactéries qui vivent au sein du biofilm. Les propriétés mécaniques de la matrice sont donc un indicateur de l’état local du biofilm. La recherche de ces paramètres permet de pouvoir prédire et contrôler la formation, l’accumulation et la dissémination de bactéries propageant les infections et/ou l’encrassement. Néanmoins, la détermination des propriétés mécaniques des biofilms nécessite des précautions et l’usage d’un vocabulaire homogénéisé et de méthodes unifiées au sein de la communauté. Pour cela, une première partie de ce travail de thèse consiste en la proposition d’un guide de bonnes pratiques quant à la caractérisation mécanique du matériau biofilm. Dans la deuxième partie de ce travail de thèse, une méthodologie pour le suivi de particules micrométriques au sein d’un matériau vivant est développée. Le recours à des techniques d’imagerie telle que la corrélation d’images numériques permet de remonter à la cinématique du mouvement de chacune des microbilles, qui servent de marqueurs au sein des images traitées, par une mesure sans contact. Cette méthode est ensuite appliquée à l’étude de la formation de biofilm. L’originalité de ce travail repose sur la caractérisation de l’évolution de la typologie du mouvement des microbilles métalliques lors de la formation des biofilms. Il s’agit là de discriminer des comportements de billes révélateurs de la genèse d’un biofilm. En tirant parti de l’observation du mouvement de microbilles inertes introduites dans le milieu bactérien, on détecte des changements de typologies de trajectoires qui semblent être reliés à l’activité de bactéries sessiles, adhésion ou formation de matériel extracellulaire. Les résultats montrent que les diverses étapes de la formation de biofilms sont caractérisées, ce qui permet notamment de discriminer la présence ou non d’antibiotiques mélangés avec les bactéries et d’apprécier leur efficacité. Dans une dernière partie, des recherches encore en phase de développement sont exposées. Elles s’intéressent au comportement du biofilm sous sollicitation volumique. Il s’agit dans ce cas d’observer le biofilm en champ lointain et de suivre le déplacement ou la déformation d’un marquage constitué d’un agglomérat de microbilles, plongées dans un champ magnétique. Ces premiers travaux pourront servir d’ébauche à des travaux futurs dans le but de caractériser quantitativement le matériau biofilm. / The control of biofilm formation constitutes an important challenge in many industrial and biomedical applications. In this context, BioFilm Control is a pioneer thanks to its test named BioFilm Ring Test. Based on the immobilisation of magnetic microbeads by adherent cells, the assay allows to detect the presence of biofilm at a given time. The aim of this phD project is to translate the BioFilm Ring Test® into a dynamic, non-destructive and microscopic examination of the biofilm state. Whithin the biofilm, the matrix provides a strong cohesion between cells and therefore increases their resistance against chemical or mechanical stress in comparison to their planktonic counterparts. The mechanical properties of the matrix are therefore an indicator of the local state of the biofilm. The search for these parameters makes it possible to predict and control the formation, accumulation and spread of bacteria that propagate infections and/or biofouling. Nevertheless, the determination of the mechanical properties of biofilms requires precautions and the use of an homogenized vocabulary and methods that are unified within the community. To this end, a first part of this thesis work consists in proposing a guide of good practices for the mechanical characterization of biofilm material. In the second part of this work, a methodology for tracking of micrometric particles within a living material is developed. The use of full field measurement method such as digital image correlation makes it possible to trace the kinematics of the motion of each particle, which is a probe of the local environment. This method is then applied to the study of the biofilm formation, by non-contact measurement. The originality of this work is based on the characterization of the change in the microbeads movement during the biofilm formation steps. The aim is to discriminate bead behaviours that reveal the genesis of a biofilm. By taking advantage of the observation of the movement of inert microbeads embedded into the bacterial environment, we detect changes of type of trajectories which seem to be correlated to the activity of sessiles bacteria, adhesion or formation of extracellular material. The results show that the various stages of the biofilm formation are characterized by a non-destructive test. Especially, It allows to appreciate the efficiency of an antibiotic. In the last part, research still in a development phase is presented. It concerns the behaviour of biofilm under mechanical solicitation. This involves observing the biofilm in the far field and following the displacement or deformation of a pattern consisting of an agglomerate of microbeads immersed in a magnetic field. This initial work can be used as a draft for future work to quantitatively characterize the biofilm material.

L’imbibition est d’une importance fondamentale dans de nombreuses applications technologiques et intervient par ailleurs dans de nombreux phénomènes naturels (industrie textile, industrie pharmaceutique, érosion des sols ….). Malgré l’importance de ce phénomène, la description et la modélisation des mécanismes d’imbibition sont encore sujettes à discussion dans la littérature, en particulier, la prédiction des cinétiques d’imbibition à partir de la connaissance de la topographie du milieu poreux. L’objectif de ce travail de thèse a été de relier les cinétiques d’imbibition à la structure du milieu poreux imbibé. Pour cela, nous avons étudié l’imbibition capillaire (ou spontanée) en suivant une démarche expérimentale dans laquelle nous avons utilisé des substrats poreux modèles dont nous contrôlons le volume et la structure de pores. La configuration d’imbibition choisie dans ce travail est celle d’une goutte sessile (ou posée).Ces travaux ont permis de mettre en œuvre une technique de construction de pastilles macroscopiques, autosupportées et cohésives, par assemblage de microbilles de polymère. Ces systèmes modèles ont été utilisés pour étudier les cinétiques d’imbibition capillaire de liquides dans des supports tridimensionnels à structure de pores complexe en fonction de la taille des microbilles constituant la pastille poreuse, de la reconstruction thermique, de la perméabilité pour une structure poreuse bicouches et de la force capillaire. Ces études ont permis entre autres de mettre en évidence des régimes cinétiques et des transitions d’imbibition inattendues dans ces systèmes (régimes visqueux et inertiel). / Imbibition is of fundamental importance in many technological applications, and is also involved in many natural phenomena (textile industry, pharmaceutical industry, soil erosion ....). Despite the importance of this phenomenon, the description and modelling of imbibition mechanisms are still subject to discussion in the literature, in particular, the prediction of the kinetics of imbibition from the knowledge of the morphology of the porous medium.The aim of this thesis was to relate the imbibition kinetics with the structure of a model porous medium. For this, we studied the capillary imbibition (or spontaneous) following an experimental approach in which we used a model porous substrate with both a controlled porous volume and pore structure. The experimental configuration for studying this imbibition was that of a sessile drop. In this work we developed a technique for the fabrication of self-supported and cohesive macroscopic pellets of polymer microbeads. These model porous systems have been characterized for their internal structure and used to study the capillary imbibition kinetics as a function of i) the size of the microbeads, ii) the temperature of the thermal annealing, iii) the permeability in the case of bilayered porous structures and iv) the capillary force (concentration of ethanol in water, nature of the liquid). This approach allowed observing and discussing unexpected imbibition regimes and transitions (inertial and viscous regimes).

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Les caractéristiques et les propriétés de libération de microparticules chargées de médicament dépendent de la nature des matériaux employés, des propriétés physicochimiques des microparticules, du choix de la méthode de production, et enfin des propriétés des molécules encapsulées. A l'inverse de la plupart des méthodes conventionnelles, les méthodes microfluidiques présentent l’avantage de bien mieux contrôler la génération de gouttelettes, leur taille et leur distribution de tailles. Ainsi des dispositifs microfluidiques à base de capillaires ont été développés pour obtenir des microbilles de polymère mais également des microparticules de type janus, coeur-écorce ou troyenne, toutes monodisperses en taille et chargées de médicament(s). Ces particules ont été produites à partir de solutions de monomère qui furent polymérisées par irradiations UV de telle sorte à garder intacte l'activité des molécules chargées. Ces dispositifs peuvent être assemblés dans un court laps de temps et un simple changement dans leur conception permet d’obtenir des morphologies de particules très différentes. Ces particules ont été développées dans le but de résoudre les problèmes rencontrés dans l’administration orale de médicaments. Par exemple les microbilles peuvent être utilisées pour délivrer des anti-inflammatoires non stéroïdiens de manière continue tandis que les particules Janus peuvent libérer, simultanément et sur le même site, deux principes actifs possédant des propriétés complètement différentes (solubilité, compatibilité) également de manière prolongée. Quant aux particules coeur-écorce, elles ont été conçues pour cibler la région du côlon de l'intestin humain, et y libérer simultanément deux médicaments. Les particules troyennes furent synthétisées à l’aide d’un procédé microfluidique semi-continu qui a permis une manipulation plus sécurisée des nanoparticules vectrices ainsi que la libération continue d’un médicament dans un liquide gastrique simulé. Chaque système a été entièrement caractérisé pour assurer l’invariance entre lots et la reproductibilité. En général, la libération des ingrédients actifs a pu être facilement contrôlée/ajustée par le réglage des paramètres opératoires et de matériaux tels que les débits des différentes phases, la nature et la concentration du médicament, des (co)monomères, des agents tensioactif et de réticulation, le pH du milieu de libération. Ces différents paramètres influencent les propriétés des microparticules telles que leur morphologie, forme, taille et densité de réticulation du réseau polymère. / Characteristics and release properties of drug loaded microparticles depend upon material used and choice of production method. Conversely to most of the conventional ones, microfluidic methods give an edge by improving the control over droplet generation, size and size distribution. Capillary-based microfluidic devices were successfully used to obtain monodisperse drug(s) loaded microbeads, janus, core-shell and trojan particles using UV initiated free radical polymerization while keeping activity of active loaded molecules. These devices can be assembled in a short period of time and a slight change in design gives completely different microparticles morphologies. These particles were developed with the aim to address different issues experienced in oral drug delivery. For instance microbeads can be used to deliver NASIDs in a sustained release manner while janus particles can release two APIs with completely different properties (solubility, compatibility) also in a sustained release manner. Core-shell particles were designed to target colonic region of human intestine for dual drug delivery. Trojan particles were synthesized in a new semi-continuous microfluidic process, thus improving nanoparticles safety handling and release in simulated gastric fluid. Each system was fully characterized to insure batch to batch consistency and reproducibility. In general, the release of active ingredients was controlled by tuning the operating and material parameters like phases flow rates, nature and concentration of drug, (co)monomers, surfactant and crosslinker, pH of release media with the result of different particle morphologies, sizes and shapes or matrix crosslinking density.