Neste trabalho, propõe-se o desenvolvimento de procedimento analítico automático para determinação espectrofotométrica de microcistinas em águas empregando o processo de multicomutação em fluxo. O módulo de análise para implementar o procedimento analítico empregou um bomba de seringa para propulsão de fluído e válvulas solenóide para controlar a amostragem. A bomba de seringa foi construída no laboratório de Química Analítica, CENA/USP, onde foi empregado um motor de passo para fazer o deslocamento do êmbolo da seringa. Como detectores foram empregados, um fotômetro da Oriel Instrument e um fotômetro desenvolvido no laboratório de Química Analítica, CENA/USP, baseado em um fotodiodo da BURR-BRAWN e projetado para este procedimento. Uma cela de fluxo com caminho óptico de 40 mm e volume interno de 32 \'mü\'L, foi construída sob medida para permitir fácil acoplamento da fonte de radiação (LED) e dos fotodetectores, formando uma unidade compacta. O controle do sistema de fluxo, incluindo o motor de passo, foi executado por um microcomputador usando um software escrito em linguagem Quick Basic 4.5. Os sinais gerados pelos fotômetros em diferença de potencial eram convertidos para digital por um multímetro e enviados para o computador através da interface serial 232. O sistema proposto foi empregado para determinação de microcistinas em águas de rios e lagoas. A exatidão foi averiguada comparando com os dados obtidos empregando um equipamento ELISA. A faixa de concentração situada entre (0,1 e 0,8 \'mü\'gL-1) de microcistina indica que o sistema proposto pode ser usado em serviços de tratamento de águas onde o requerimento da ANVISA (Portaria n°518, 2004) deve ser alcançado / In this work, it was proposed the development of an automated analytical procedure based on multicommutation for the photometric determination of microcystins water. The flow module to implement the analytical procedure employed a syringe pump for solution propelling and solenoid valves for sampling control. The syringe pump was constructed in the laboratory CENA/USP, employed a step-motor to carry out the displacement of the syringe piston. As photodetectors was employed an Oriel Instrument photometer and a photometer developed in the laboratory CENA/USP based on a BURR-BRAWN photodiode and designed to be used in this procedure. A flow cell with optical pathlength of 40 mm and inner volume of 32 \'mü\'L was tailored to allow easily coupling of radiation source (LED) and photodetector, forming a compact unit. The control of the flow system, including the step-motor was performed by a microcomputer using a software wrote in Quick BASIC 4.5. The signals generated by the photometers in difference of potential were converted to digital by a digital multimeter and sent to the microcomputer through the serial interface 232. The proposed system was employed for the photometric determination of microcystins in water. Accuracy was assessed comparing the results with those obtained using a ELISA instrument. The concentration response (0,1 e 0,8 \'mü\'gL-1 microcystins) and limit of detection lower than 0.01 \'mü\'gL-1 microcystins, indicated that the proposed system can be used in plants of water treatment where the ANVISA requirement must be maintained

Microcistinas (MCs) são heptapeptídeos cíclicos produzidos por cianobactérias e possuem potente hepatotoxicidade e atividade promotora de tumor. Em intoxicações agudas induzidas por MCs ocorre infiltração leucocitária no foco inflamatório. Embora os mecanismos de hepatotoxicidade não são claros, o recrutamento de neutrófilos no fígado pode contribuir ao dano tecidual e desenvolvimento tumoral causados por xenobióticos. O objetivo dessa tese foi investigar os efeitos de três estruturalmente distintas MCs (MC-LA, MC-YR e MC-LR) nas seguintes funções de neutrófilos: síntese e expressão de moléculas de adesão, rolamento, adesão, migração e liberação de citocinas e de ROS. Nos ensaios de migração em bolsa de ar, as três MCs induziram similarmente a migração de leucócitos in vivo em tecido subcutâneo de ratos e diferencialmente a secreção de citocinas pró-inflamatórias (CINC, IL-1β, TNF-α, VEGF-α e MIP) no exsudato. Concentrações elevadas de CINC-2αβ foram encontradas nos exsudatos inflamatórios de animais após injeção de MC-LA, MC-LR ou MC-YR. MIP-2 elevou-se apenas em exsudatos de animais expostos a MC-LR. Não foram observadas alterações em secreção de IL-1β, TNF-α e VEGF-α. Estudos de microscopia intravital mostraram que apenas a aplicação tópica de MC-LR reforçou o rolamento e a adesão de leucócitos no endotélio de vênulas mesentéricas pós-capilares. Esses últimos resultados podem ser dependentes de aumento e expressão da síntese da L-selectina e β2-integrina nos neutrófilos, tal como avaliado por FACS e PCR-RT, respectivamente. Adicionalmente, em ensaios em câmara de Boyden in vitro, as três MCs promoveram locomoção direta de neutrófilos e aumentaram a migração dessas células em resposta ao fMLP, além do aumento de cálcio intracelular observado por microscopia confocal. Os efeitos das MC-LA, MC-YR e MC-LR em neutrófilos humanos e de ratos tiveram o mesmo padrão de resposta. A análise de viabilidade celular, fragmentação de DNA, despolarização de membrana mitocondrial e liberação de ROS intracelulares foram avaliadas pela técnica de FACS. A concentração de ROS extracelular foi medida por quimiluminescência amplificada por lucigenina. A produção de citocinas em células tratadas foram determinadas por ELISA. Observamos aumento da liberação de IL-8, CINC-2α β e da concentração de ROS extracelular por neutrófilos humanos e de ratos pela exposição dessas células com as MCs. Os resultados aqui obtidos mostram o efeito pró-inflamatório direto das MC-LA, MC-YR e MC-LR. A possibilidade de os neutrófilos migrarem e responderem localmente a MCs contribui para a toxicidade destas toxinas. / Microcystins (MCs) are a family of heptapeptide toxins produced by some genera of Cyanobacteria. MCs have potent hepatotoxicity and tumor-promoting activity. Leukocyte infiltration in the liver was observed in MC-induced acute intoxication. Although the mechanisms of hepatotoxicity induced by MCs are still unclear, neutrophil infiltration in the liver may play an important role in triggering toxic injury and tumor development. The purpose of this thesis was to investigate the effects of three structurally distinct MCs (MC-LA, MC-YR and MC-LR) in the neutrophil functions: synthesis and expression of adhesion molecules, rolling, adhesion, migration and release of cytokines and ROS. In migration assays of the air pouch, the three MCs similarly induced the migration of leukocytes in vivo in subcutaneous tissue of rats and differentially the secretion of pro-inflammatory cytokines (CINC-2αβ, IL-1-β, TNF--α, VEGF- α and MIP-2) in exudates. Elevated concentrations of CINC-2αβ were found in the inflamed exudates from animals injected with MC-LA, MC-LR or MC-YR, although MIP-2 was only detected in the exudates from animals injected with MC-LR. There were no changes in the secretion of IL-1-β, TNF-α and VEGF--α. Intravital microscopic studies showed that topical application of MC-LR enhanced the numbers of rolling and adhered leukocytes in the endothelium of postcapillary mesenteric venules. The latter effects may be dependent upon induction of the synthesis and expression of L-selectin and -α2-integrin in neutrophils, as assessed by flow cytometry and RT-PCR, respectively. Conversely, the three toxins promoted direct locomotion of neutrophils and enhanced their migration in response to fMLP, as measured by Boyden chamber assays, and increased intracellular calcium, a messenger in the chemotaxic process. The effects of MC-LA, MC-YR and MC-LR in human neutrophils and mice had the same pattern of response. The analyses of cell viability, DNA fragmentation, mitochondrial membrane depolarization of and release of intracellular ROS were evaluated by the technique of FACS. Extracellular ROS content was measured by lucigenin-amplified chemiluminescence, and cytokines were determined by ELISA. We found that these MCs increased interleukin-8 (IL-8), cytokine-induced neutrophil chemoattractant-2αβ (CINC-2αβ) and extracellular ROS levels in human and rat neutrophils. In conclusion, our results showed that MCs act on specific pathways of neutrophil recruitment, indicating their potential effect on neutrophils activation. This process can significantly contribute to the pathogenesis of hepatic damage due to generation of ROS by neutrophils as well as act on hepatocytes under such conditions and potentially increase injury processes induced by MCs.

Neste trabalho, propõe-se o desenvolvimento de procedimento analítico automático para determinação espectrofotométrica de microcistinas em águas empregando o processo de multicomutação em fluxo. O módulo de análise para implementar o procedimento analítico empregou um bomba de seringa para propulsão de fluído e válvulas solenóide para controlar a amostragem. A bomba de seringa foi construída no laboratório de Química Analítica, CENA/USP, onde foi empregado um motor de passo para fazer o deslocamento do êmbolo da seringa. Como detectores foram empregados, um fotômetro da Oriel Instrument e um fotômetro desenvolvido no laboratório de Química Analítica, CENA/USP, baseado em um fotodiodo da BURR-BRAWN e projetado para este procedimento. Uma cela de fluxo com caminho óptico de 40 mm e volume interno de 32 \'mü\'L, foi construída sob medida para permitir fácil acoplamento da fonte de radiação (LED) e dos fotodetectores, formando uma unidade compacta. O controle do sistema de fluxo, incluindo o motor de passo, foi executado por um microcomputador usando um software escrito em linguagem Quick Basic 4.5. Os sinais gerados pelos fotômetros em diferença de potencial eram convertidos para digital por um multímetro e enviados para o computador através da interface serial 232. O sistema proposto foi empregado para determinação de microcistinas em águas de rios e lagoas. A exatidão foi averiguada comparando com os dados obtidos empregando um equipamento ELISA. A faixa de concentração situada entre (0,1 e 0,8 \'mü\'gL-1) de microcistina indica que o sistema proposto pode ser usado em serviços de tratamento de águas onde o requerimento da ANVISA (Portaria n°518, 2004) deve ser alcançado / In this work, it was proposed the development of an automated analytical procedure based on multicommutation for the photometric determination of microcystins water. The flow module to implement the analytical procedure employed a syringe pump for solution propelling and solenoid valves for sampling control. The syringe pump was constructed in the laboratory CENA/USP, employed a step-motor to carry out the displacement of the syringe piston. As photodetectors was employed an Oriel Instrument photometer and a photometer developed in the laboratory CENA/USP based on a BURR-BRAWN photodiode and designed to be used in this procedure. A flow cell with optical pathlength of 40 mm and inner volume of 32 \'mü\'L was tailored to allow easily coupling of radiation source (LED) and photodetector, forming a compact unit. The control of the flow system, including the step-motor was performed by a microcomputer using a software wrote in Quick BASIC 4.5. The signals generated by the photometers in difference of potential were converted to digital by a digital multimeter and sent to the microcomputer through the serial interface 232. The proposed system was employed for the photometric determination of microcystins in water. Accuracy was assessed comparing the results with those obtained using a ELISA instrument. The concentration response (0,1 e 0,8 \'mü\'gL-1 microcystins) and limit of detection lower than 0.01 \'mü\'gL-1 microcystins, indicated that the proposed system can be used in plants of water treatment where the ANVISA requirement must be maintained

O aumento da incidência de florações de cianobactérias potencialmente tóxicas nos mananciais de abastecimento, favorecidas pelo elevado aporte de nutrientes nos corpos d\'água, compromete a qualidade da água de consumo e põe em risco a saúde humana e animal, além de elevar os custos do tratamento de água. A pré-cloração, tem se mostrado uma ótima opção tanto na inativação de cianobactérias como na remoção de cianotoxinas dissolvidas. No entanto, sob certas condições, pode causar lise celular e promover a liberação das toxinas no meio. O objetivo deste trabalho foi avaliar em escala laboratorial, o efeito da pré-cloração, utilizando como agente oxidante o hipoclorito de sódio, sobre a integridade celular de uma linhagem tóxica de Microcystis aeruginosa (LTPNA 08), por citometria de fluxo, e sobre a subsequente liberação e degradação das microcistinas (LR e RR) por LC-MS/ MS. Diferentes dosagens de cloro (0,05, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4 e 8 mg.L-1), tempos de contato (0, 15, 30 e 60 minutos) e densidade celular (1x106 células.mL-1 para os ensaios de jarros e 3,5 x106 células.mL-1 para o ensaio de viabilidade celular) foram utilizadas neste estudo. Os resultados obtidos nos ensaios de jarros mostraram remoções de microcistinas acima de 70% após 60 minutos de exposição ao oxidante, com 100% de remoção em doses de 2,5 e 3 mg Cl2.L-1. Valores de CT (concentração x tempo) acima de 40,66 mg.min.L-1 foram necessários para degradar as microcistinas a concentrações abaixo de 1,0 µg.L-1, exigidos pela organização mundial de saúde (WHO) e pela legislação brasileira de potabilidade da água (Portaria MS nº 2914/2011). Não foi possível verificar a lise celular por microscopia óptica, no entanto, na análise por HPLC-DAD verificou-se degradação de mais de 70% da clorofila-a em todas as dosagens testadas, após 60 minutos de exposição, com a completa degradação nas concentrações de 2,5 e 3 mg.L-1 Cl2, indicando dano celular. Nos ensaios por citometria de fluxo, foi verificada a perda da integridade celular com o aumento da dosagem de cloro aplicada, observando-se a permeabilidade celular máxima, sem a desintegração da célula, na concentração de 2,5 mg.L-1 Cl2. Concentrações de 4 e 8 mg.L1 Cl2 promoveram a lise total das células, impossibilitando a permanência do marcador na célula. A perda dos pigmentos clorofila a e ficocianina ocorreram em concentrações de acima de 2,5 e acima de 1,5 mg.L-1 Cl2, respectivamente. O presente trabalho reforçou a eficiência da cloração na degradação das toxinas e os resultados obtidos podem ajudar as autoridades competentes a otimizar as práticas de cloração utilizadas no pré-tratamento da água. / The increased incidence of blooms of potentially toxic cyanobacteria in supply sources, favored by high input of nutrients in water bodies, compromises the quality of drinking water and affect human and animal health, besides increasing water treatment costs. The pre-chlorination, has proved a great choice both in the inactivation of cyanobacterial cells as in removing dissolved cyanotoxins. However, under certain conditions, can cause cell lysis and release toxins. The objective of this study was to evaluate in laboratory scale, the effect of pre-chlorination, using sodium hypochlorite, on cell integrity of toxic Microcystis aeruginosa (LTPNA 08) using flow cytometry, and the subsequent release and degradation of microcystins (LR and RR) by LC-MS / MS. Different chlorine doses (0.05, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4 and 8 mg.L-1), contact times (0, 15, 30 and 60 minutes) and cell density (1x106 células.mL-1 for jar-test and 3.5 x106 células.mL-1 for cell viability assay) were used in this study. The results obtained in the jar- test showed degradations up to 70% after 60 minutes of exposure, with complete degradation at chlorine doses of 2,5 e 3 mg.L-1. Chlorine exposure (CT) values over 40,66 mg.min.L-1 were required for oxidation of microcystin LR and RR to concentrations below the World Health Organization (WHO) and Brazilian legislation for water potability (Portaria MS nº 2914/2011) guideline value of 1µg.L-1. No differences in cell number was observed by microscopy, however, analysis by HPLC-DAD found chlorophyll-a reductions of more than 70% in all dosages tested after 60 minutes exposure, with values below the limit of quantification for concentrations of 2.5 and 3 mg.L-1 Cl2, indicating cell damage. In assays using flow cytometry, loss of cell integrity was observed with increasing chlorine concentration. The maximum cell permeability without cell disintegration was observed at a concentration of 2.5 mg.L-1 Cl2. Concentrations of 4 and 8 mg.L-1 Cl2 lead to complete cell lysis, making impossible the permanence of SYTOX Green in the cell. The loss of pigment chlorophyll a and phycocyanin occurred in concentrations above 2.5 and 1.5 mg.L-1 Cl2, respectively. This study reinforced the efficiency of chlorination in the toxins degradation and the results can help the water authorities to optimize the chlorination practices used in the pretreatment of water.

Made available in DSpace on 2015-06-08T13:58:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 503.pdf: 2698610 bytes, checksum: ab7163b5007de13f1b2b30070ea98cd9 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Este trabalho objetiva estudar o que em 1996 a imprensa local denominou como a Tragédia da Hemodiálise. Um surto de intoxicação em pacientes renais crônicos de uma clínica de Hemodiálise localizada no município de Caruaru, situado na região semi-árida do agreste pernambucano. Para tanto, foram analisadas as condições sócio-ambientais no período do episódio, os sistemas de abastecimento da cidade e de duas clínicas de hemodiálise desse município. Trata-se de um estudo de caso empregando como triangulação metodológica um sistema de matrizes de dados (SAMAJA, 2000). A utilização desse método se deu em função da grande quantidade de variáveis de níveis diferentes. Como fonte de informação foi utilizada o processo de ação civil pública movido pelo Ministério Público de Pernambuco e os relatórios da CPI da Hemodiálise realizado pela Assembléia Legislativa do Estado de Pernambuco e anexado aos autos do processo. Contou também com informações pluviométricas e de clima para caracterização ambiental no período do evento. Os resultados do estudo apontaram que para além da Microcistina LR, como causa direta o fornecimento de água não potável a clínica através de caminhões pipa, de responsabilidade concessionária pelo abastecimento estadual, e como o contexto de vulnerabilidades, formado pela composição de condicionantes, tais como: que passam pela ausência de na gestão integrada do meio ambiente e do recursos hídricos e de Vigilância da Saúde

Microcistinas (MCs) são heptapeptídeos cíclicos produzidos por cianobactérias e possuem potente hepatotoxicidade e atividade promotora de tumor. Em intoxicações agudas induzidas por MCs ocorre infiltração leucocitária no foco inflamatório. Embora os mecanismos de hepatotoxicidade não são claros, o recrutamento de neutrófilos no fígado pode contribuir ao dano tecidual e desenvolvimento tumoral causados por xenobióticos. O objetivo dessa tese foi investigar os efeitos de três estruturalmente distintas MCs (MC-LA, MC-YR e MC-LR) nas seguintes funções de neutrófilos: síntese e expressão de moléculas de adesão, rolamento, adesão, migração e liberação de citocinas e de ROS. Nos ensaios de migração em bolsa de ar, as três MCs induziram similarmente a migração de leucócitos in vivo em tecido subcutâneo de ratos e diferencialmente a secreção de citocinas pró-inflamatórias (CINC, IL-1β, TNF-α, VEGF-α e MIP) no exsudato. Concentrações elevadas de CINC-2αβ foram encontradas nos exsudatos inflamatórios de animais após injeção de MC-LA, MC-LR ou MC-YR. MIP-2 elevou-se apenas em exsudatos de animais expostos a MC-LR. Não foram observadas alterações em secreção de IL-1β, TNF-α e VEGF-α. Estudos de microscopia intravital mostraram que apenas a aplicação tópica de MC-LR reforçou o rolamento e a adesão de leucócitos no endotélio de vênulas mesentéricas pós-capilares. Esses últimos resultados podem ser dependentes de aumento e expressão da síntese da L-selectina e β2-integrina nos neutrófilos, tal como avaliado por FACS e PCR-RT, respectivamente. Adicionalmente, em ensaios em câmara de Boyden in vitro, as três MCs promoveram locomoção direta de neutrófilos e aumentaram a migração dessas células em resposta ao fMLP, além do aumento de cálcio intracelular observado por microscopia confocal. Os efeitos das MC-LA, MC-YR e MC-LR em neutrófilos humanos e de ratos tiveram o mesmo padrão de resposta. A análise de viabilidade celular, fragmentação de DNA, despolarização de membrana mitocondrial e liberação de ROS intracelulares foram avaliadas pela técnica de FACS. A concentração de ROS extracelular foi medida por quimiluminescência amplificada por lucigenina. A produção de citocinas em células tratadas foram determinadas por ELISA. Observamos aumento da liberação de IL-8, CINC-2α β e da concentração de ROS extracelular por neutrófilos humanos e de ratos pela exposição dessas células com as MCs. Os resultados aqui obtidos mostram o efeito pró-inflamatório direto das MC-LA, MC-YR e MC-LR. A possibilidade de os neutrófilos migrarem e responderem localmente a MCs contribui para a toxicidade destas toxinas. / Microcystins (MCs) are a family of heptapeptide toxins produced by some genera of Cyanobacteria. MCs have potent hepatotoxicity and tumor-promoting activity. Leukocyte infiltration in the liver was observed in MC-induced acute intoxication. Although the mechanisms of hepatotoxicity induced by MCs are still unclear, neutrophil infiltration in the liver may play an important role in triggering toxic injury and tumor development. The purpose of this thesis was to investigate the effects of three structurally distinct MCs (MC-LA, MC-YR and MC-LR) in the neutrophil functions: synthesis and expression of adhesion molecules, rolling, adhesion, migration and release of cytokines and ROS. In migration assays of the air pouch, the three MCs similarly induced the migration of leukocytes in vivo in subcutaneous tissue of rats and differentially the secretion of pro-inflammatory cytokines (CINC-2αβ, IL-1-β, TNF--α, VEGF- α and MIP-2) in exudates. Elevated concentrations of CINC-2αβ were found in the inflamed exudates from animals injected with MC-LA, MC-LR or MC-YR, although MIP-2 was only detected in the exudates from animals injected with MC-LR. There were no changes in the secretion of IL-1-β, TNF-α and VEGF--α. Intravital microscopic studies showed that topical application of MC-LR enhanced the numbers of rolling and adhered leukocytes in the endothelium of postcapillary mesenteric venules. The latter effects may be dependent upon induction of the synthesis and expression of L-selectin and -α2-integrin in neutrophils, as assessed by flow cytometry and RT-PCR, respectively. Conversely, the three toxins promoted direct locomotion of neutrophils and enhanced their migration in response to fMLP, as measured by Boyden chamber assays, and increased intracellular calcium, a messenger in the chemotaxic process. The effects of MC-LA, MC-YR and MC-LR in human neutrophils and mice had the same pattern of response. The analyses of cell viability, DNA fragmentation, mitochondrial membrane depolarization of and release of intracellular ROS were evaluated by the technique of FACS. Extracellular ROS content was measured by lucigenin-amplified chemiluminescence, and cytokines were determined by ELISA. We found that these MCs increased interleukin-8 (IL-8), cytokine-induced neutrophil chemoattractant-2αβ (CINC-2αβ) and extracellular ROS levels in human and rat neutrophils. In conclusion, our results showed that MCs act on specific pathways of neutrophil recruitment, indicating their potential effect on neutrophils activation. This process can significantly contribute to the pathogenesis of hepatic damage due to generation of ROS by neutrophils as well as act on hepatocytes under such conditions and potentially increase injury processes induced by MCs.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-05-25Bitstream added on 2014-06-13T19:28:49Z : No. of bitstreams: 1 silva_im_me_rcla.pdf: 340011 bytes, checksum: 05cf698f37e837803ba622b1fe6bf9e7 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / As cianotoxinas são produzidas por diversos gêneros de cianobactérias, possuem ação hepatotóxica e foram as responsáveis por vários casos de intoxicação em mamíferos. Estudos com hortaliças têm demonstrado os efeitos das microcistinas (MCs) sobre a germinação de sementes, o desenvolvimento das plântulas e o metabolismo, além do acúmulo nos tecidos foliares. O que caracteriza uma importante via de contaminação para o homem através da irrigação com água contendo cianotoxinas. Esse trabalho teve como objetivo investigar os efeitos da aplicação de extrato bruto de Microcystis aeruginosa (Kützing) Kützing, com linhagem produtora e não produtora de MCs, para a germinação de sementes, e o desenvolvimento de plântulas e plantas de rúcula, variedade Folha larga. Sementes germinadas em papel mata-borrão foram expostas a concentrações entre 0,5 a 100 μg.L-1 de MC-LR equivalente durante sete dias. Plantas cultivadas em vasos contendo substrato comercial para hortaliça foram irrigadas com solução aquosa contendo 0,5 a 10 μg.L-1 de MC-totais, ou seja, considerando todas as variantes presentes no extrato com MC. Valores de massa seca correspondentes foram empregados para o tratamento com extrato bruto sem microcistina, além de controle com água. Os resultados mostraram que MC-LR equivalente causou inibição de 30% no comprimento da parte aérea das plântulas e aumento na atividade da enzima peroxidase (POD). As concentrações aplicadas de MC-totais causaram o aumento na atividade da POD apenas para a planta jovem (folhas e raízes). Com isso, os resultados indicaram que não houve efeitos alelopáticos na germinação de sementes e na formação das plântulas, cujas sementes não foram susceptíveis aos tratamentos. O mesmo ocorreu com as plantas jovens e adultas expostas aos extratos brutos, nas concentrações testadas de MC-totais. Houve diferença no estresse... / Cyanotoxins are produced by several cyanobacteria genera. They have hepatotoxic action and have been responsible for several cases of intoxication. Studies on vegetables have shown the effects of microcystins (MCs) in seed germination, seedling development and metabolism. Another concern is the crop irrigation with water containing cyanotoxins due to the possibility of toxin accumulation in leaf tissues. This characterizes an important route of contamination to humans. The aim of this study was to investigate the effects of non-purified extracts of Microcystis aeruginosa (Kützing) Kützing in the germination of seeds, development of seedlings and plants of rocket (large-leaf variety). Effects of both, toxic and non-toxic strains, were evaluated. Seeds were germinated on filter paper and than exposed to MC solution (concentrations ranging from 0,5 to 100,0 μg.L-1 of MC-LR equivalent) during seven days. Plants growing in commercial substrate for vegetable were irrigated with MC solution (concentrations ranging from 0,5 to 10,0 μg.L-1 de MC-total). Treatments containing the non-toxic strain extract (dry mass equivalent of the toxic treatment) and water (negative control) were carried out together with the toxic ones. MC-LR equivalent treatment caused inhibition of 30% in shoot length and increased activity of peroxidase (POD) in seedlings. The applied concentrations of MC-total caused increase in POD activity in young plant (leaves and roots). On the other hand, allelopathic effects were not found either on seeds germination or seedling development. Also, no allelopathic effects were found in the juvenile and adult plants exposed to extracts with any of the MC-total concentrations. Young and adult plants had different oxidative stress responses when exposed to extracts of the MCs-producing strain. Therefore, future studies should be conducted with individuals at the young stages of ... (Complete abstract click electronic access below)

A demanda crescente de água doce de boa qualidade são problemas atuais e mundiais, além do descaso com os dejetos lançados nos ambientes aquáticos que comprometem a qualidade dos recursos hídricos. Um dos parâmetros que atesta a potabilidade da água é a presença de cianobactérias e cianotoxinas. Cianobactérias são microrganismos procariontes aeróbicos fotoautróficos que sintetizam as cianotoxinas. Estes compostos podem ser classificados de acordo com seus mecanismos de ação em hepatotóxicos, neurotóxicos e dermatotóxicos. Por sua diversidade, representam diferentes riscos não só ao ecossistema e a outros organismos dos ambientes aquáticos, como também aos seres humanos. Esse projeto visou o isolamento e cultivo de cepas de cianobactérias produtoras de toxinas para a investigação da biossíntese desses compostos. Com este intuito, foram realizadas coletas de água em três reservatórios no estado de São Paulo e um no Paraná. Cepas de cianobactérais foram isoladas, identificadas e analisadas quanto à produção de toxinas. Uma cepa de Microcystis aeruginosa (LTPNA 02) produtora de microcistinas (MC-LR, MC-RR, MC-YR, MC-LF, MC-LW e desm-MC-LR e desm- MC-RR) foi escolhida para ser estudada frente diferentes condições de cultivo e ter o seu crescimento, produção de toxinas e expressão gênica estudados. Foram utilizados os meios de cultura já referidos na literatura: ASM-1 (N:P=1, 10 e 20), MLA (N:P=10), Bold 3N (N:P=16) e BG-11 (N:P=10 e 100). Para acompanhar o crescimento, dois métodos foram utilizados: contagem de células e espectrofotometria. As toxinas foram quantificadas por LC-MS - QTrap. A análise da expressão gênica foi realizada por reação de PCR em tempo real pelo método de quantificação relativa &#916;&#916;Ct. Foi observada diferença no crescimento da cepa estudada nos diferentes meios de cultivo empregados. A contagem das células permitiu a identificação das fases logarítmica e total de crescimento. Durante a fase logarítmica, três experimentos demonstraram diferenças estatísticas quando comparadas ao controle (p<0,05). Ao se avaliar o crescimento total, quatro experimentos foram menores (p<0,01). As leituras das absorvâncias e a contagem de células demonstraram alta correlação Para ambas as leituras em 680 nm e 750 nm o coeficiente de correlação (r) esteve entre 0,93 e 0,99. A quantificação das microcistinas (MC) foi realizada por LC-MS - QTrap. Foram quantificadas as variantes MC-LR, MR-RR e MC-YR. Apesar da relação toxina/célula ser distinto para cada experimento, não representou grande variação naqueles realizados com meio ASM-1 (N:P 1; 10 e 20), meio MLA (N:P=10) e BG11(N:P=10). O experimento realizado em Bold3N (N:P=16,6) apresentou menor concentração de toxina/célula e as variantes MC-LR e MC-YR não foram detectadas. Por outro lado, o experimento realizado em BG-11 (N:P=100) apresentou a maior relação toxina por célula. Estes resultados sugerem que o excesso de nitrato seja um fator estressante para o desenvolvimento e crescimento da cepa de M. aeruginosa avaliada e ao mesmo tempo um fator estimulante para a produção das toxinas analisadas. Os experimentos que avaliaram a expressão dos genes 16S e mcyB em relação ao gene da ficocianina (controle endógeno) foram realizados em meio ASM-1 (N:P=10 e 100) e BG 11 (N:P= 10 e 100). Os parâmetros anteriores, como crescimento e produção de toxinas também foram avaliados. Novamente foram encontradas diferenças entre as fases de crescimento e produção de toxina, porém a expressão dos genes avaliados não demonstrou variação significativa entre os experimentos. Porém ambos os genes avaliados demonstraram menor expressão nos experimentos condizidos em (N:P=100). / There is a great concern these days about potable and good quality water due to the increase of the population needs and also to the arising problems with contamination caused by anthropogenic sources. The presence of cyanobacteria and cyanotoxins are some parameters that attest water potability. Cyanobacteria are prokaryotic aerobic photoautotrophic microorganisms that may synthesize cyanotoxins. These compounds can be classified as hepatotoxic, neurotoxic and dermatotoxic according to their action mechanisms. Because of their diversity, they may represent different risks, not only to their ecosystem and other aquatic living organisms, but also to human beings. The aim of this project was the isolation and cultivation of cyanotoxin-producing cyanobacteria for further investigation on the biosynthesis of these compounds. Water samples from three different reservoirs in São Paulo state and one in Paraná state were collected in order to isolate cyanobacteria strains and accomplish their identification and to evaluate the toxin production. The Microcystis aeruginosa (LTPNA 02) microcystin producer strain (MCLR, MC-RR, MC-YR, MC-LF, MC-LW, desm-MC-LR and desm-MC-RR) was chosen to be grown in different cultivation conditions and later analyzed for its growth rate, toxin production and gene expression. All culture media used in this research were chosen according to the literature: ASM-1 (N:P=1, 10 and 20), MLA (N:P=10), Bold 3N (N:P=16) and BG-11 (N:P=10 and 100). To evaluate growth rate, two techniques were used: cell counting and absorbance determination in two different wavelengths (680 nm and 750 nm). Toxins were quantified by LC-MS in a hybrid triple-quadrupole instrument (Qtrap). Gene expression was assessed by real time PCR, using the &#916;&#916;Ct relative quantification method. Cell counting allowed total growth and logarithmic phase identification. During the last, three experiments showed statistical difference from control group (p<0,05). Four experiments resulted in a lower total growth rate (p<0,05). A high correlation between cell counting and absorbance levels was found for both wavelengths tested. Correlation coefficients (r) were from 0,93 to 0,99. Three microcystin variants (MC-LR, MR-RR e MC-YR) were quantified by LC-MS. The toxin content per cell was calculated and showed no statistc variation among those experiments performed on ASM-1 (N:P 1; 10 and 20), MLA (N:P=10) and BG-11 (N:P=10). The lowest toxin/cell concentration was found for Bold3N (N:P=16,6) medium, where MC-LR and MC-YR production was not detected. On the other hand, the experiment with BG-11 (N:P=100) medium showed the highest toxin/cell content. These results suggest that high levels of nitrate in the culture medium may be a stressing factor for the development and growth of the M. aeruginosa tested strain, as well as a disturbing factor for microcystin production. Gene expression experiments regarding 16S and mycB genes using the phycocyanin gene as endogen control were performed on ASM-1 (N:P=10 and 100) and BG 11 (N:P= 10 and 100) media, along with the evaluation of growth rate and toxin production. Differences between growth rates and toxin production were once more observed, however gene expression did not show a significant variation among experiments.

Os efeitos de cianobactérias sobre organismos aquáticos planctônicos foram avaliados, visando caracterizar e quantificar as cianotoxinas e determinar a toxicidade de uma linhagem em cultura monoespecífica e de florações naturais de reservatórios do rio Tietê, SP. Assim, cultivou-se uma linhagem (NPLJ-4) de Microcystis aeruginosa, reconhecidamente tóxica, em meio ASM-1 a 25°C e fotoperíodo de 12h luz/12h escuro em câmara incubadora, avaliando-se sua toxicidade em diferentes estágios do crescimento populacional (meio e final da fase exponencial, fase estacionária e fase senescente), por meio de testes ecotoxicológicos com os organismos-teste Ceriodaphnia dubia e C. silvestrii. Esses testes foram realizados de acordo com normas padronizadas pela ABNT, sendo utilizados também para avaliar a toxicidade das florações naturais e a eficiência de diferentes processos de tratamento de água na remoção de células, microcistinas e subprodutos de cianobactérias. Os resultados indicaram aumento na concentração de microcistinas com o crescimento populacional da cianobactéria. Os extratos na fase estacionária tiveram menor toxicidade, enquanto nas demais fases causaram efeito tóxico agudo, resultando em valores de CE50; 48h de: 1,4 - 4,7 × \'10 POT.6\' cel/mL (meio fase exponencial), 1,6 - 8,7 × \'10 POT.6\' cel/mL (final fase exponencial), 7,5 - 14,1 × \'10 POT.6\' cel/mL (fase estacionária) e 1,9 - 4,6 × \'10 POT.6\' cel/mL (fase senescente) para C. dubia; e 1,9 - 5,4 × \'10 POT.6\' cel/mL (meio fase exponencial), 1,6 - 10,9 × \'10 POT.6\' cel/mL (final fase exponencial), 10,2 - 15,4 × \'10 POT.6\' cel/mL (fase estacionária) e 2,0 - 4,2 × \'10 POT.6\' cel/mL (fase senescente) para C. silvestrii. Células livres de Microcystis (M. aeruginosa, M. panniformis e M. protocystis) e Pseudanabaena mucicola foram as cianobactérias dominantes nas florações dos reservatórios de Barra Bonita e células livres de Microcystis (M. aeruginosa e M. panniformis), no de Promissão. A dominância das cianobactérias em ambos os reservatórios pode estar relacionada a períodos de estabilidade da coluna de água, razões N/P de 8 - 13 (Barra Bonita) e 19 - 20 (Promissão) na superfície, temperatura da água de 19 - 30°C (Barra Bonita) e 26 - 28°C (Promissão) e disponibilidade de nutrientes (0,05 - 0,26 mg/L de fósforo total para Barra Bonita e 0,01 - 0,05 mg/L P-total para Promissão), devido ao grau de trofia dos reservatórios. A água de ambos os reservatórios, coletada durante as florações, apresentou toxicidade aos dafinídeos, sendo que a água de Barra Bonita foi mais tóxica do que a de Promissão. Todos os extratos brutos de material oriundo das florações naturais apresentaram microcistinas (239 - 1647 µg/L para Barra Bonita e 192 - 1295 µg/L para Promissão) e causaram toxicidade aguda aos dafinídeos, com valores de CE50; 48h de: 87 - 282 mg/L (Barra Bonita) e 146 - 428 mg/L (Promissão) para C. dubia, e 98 - 546 mg/L (Barra Bonita) e 110 - 391 mg/L (Promissão) para C. silvestrii. Concentrações dos extratos a partir de 80 mg/L (Barra Bonita) e 100 mg/L (Promissão) afetaram adversamente a sobrevivência e a reprodução dos dafinídeos. Os resultados mostram riscos à biota natural e à saúde humana, bem como comprometimento dos usos múltiplos dos reservatórios, exigindo ações remediadoras e, sobretudo, preventivas para conter o processo de eutrofização. / The effects of cyanobacteria upon aquatic organisms were evaluated, aiming to characterize and quantify the toxins of both, a monospecific cyanobacterial culture and material from natural blooms occurring in the reservoirs of Tietê river, SP. The already known toxic strain NPLJ-4 of Microcystis aeruginosa was cultured in ASM-1 medium at 25 Celsius degrees and 12h light/12h dark in the incubator, in order to evaluate its toxicity at different stages of the culture growth by ecotoxicological tests using the cladocerans Ceriodaphnia dubia and C. silvestrii as test-organisms. These tests were carried out according to the procedures standardized by ABNT, in order to evaluate also the toxicity of natural blooms and the efficiency of different water treatment processes in removing cells, microcystins and by-products of cyanobacteria. The results obtained indicated an increase in the concentration of microcystins along the cyanobacterial culture growth. Extracts from the stationary phase of the culture were less toxic compared with those from the other phases which had acute toxicity and adversely affected cladoceran survival, resulting in EC50; 48h values of 1,4 - 4,7 × \'10 POT.6\' cells/mL (middle exponential phase), 1,6 - 8,7 × \'10 POT.6\' cells/mL (final exponential phase), 7,5 - 14,1 × \'10 POT.6\' cells/mL (stationary phase) and 1,9 - 4,6 × \'10 POT.6\' cells/mL (senescent phase) for C. dubia; and 1,9 - 5,4 × \'10 POT.6\' cells/mL (middle exponential phase), 1,6 - 10,9 × \'10 POT.6\' cells/mL (final exponential phase), 10,2 - 15,4 × \'10 POT.6\' cells/mL (stationary phase) and 2,0 - 4,2 × \'10 POT.6\' cells/mL (senescent phase) for C. silvestrii. Cells of Microcystis (Microcystis aeruginosa, M. panniformis and M. protocystis) and Pseudanabaena mucicola were cyanobacteria species dominant in the Barra Bonita reservoir and cells of Microcystis (M. aeruginosa and M. panniformis), in the Promissão reservoir. The dominance of cyanobacteria in both studied reservoirs was related to the stability of the water column, N/P ratios of 8 to 13 (Barra Bonita) and 19 to 20 (Promissão), high water temperatures (19 - 30°C for Barra Bonita and 26 - 28°C for Promissão) and high nutrient availability (0,05 - 0,26 mg/L total phosphorus for Barra Bonita, and 0,01 - 0,05 mg/L total P for Promissão) as a consequence of the trophic state of the reservoirs. The water from Barra Bonita reservoir during the cyanobacterial blooms was more toxic to daphnids than that from Promissão reservoir. Crude extracts from all cyanobacteria blooms tested presented microcystins (239 - 1647 µg/L for Barra Bonita and 192 - 1295 µg/L for Promissão) and caused acute toxicity to daphnids, resulting in EC50; 48h values of 87 - 282 mg/L (Barra Bonita) and 146 - 428 mg/L (Promissão) for C. dubia, and 98 - 546 mg/L (Barra Bonita) and 110 - 391 mg/L (Promissão) for C. silvestrii. Crude extracts concentrations above 80 mg/L to Barra Bonita and 100 mg/L to Promissão adversely affected the survival and reproduction of daphnids. The results obtained evidenced the risks to the natural biota and possibly to the human health, and can therefore jeopardize the multiple uses of the reservoirs. They reveal the urgent necessity for remedial action, particularly to slow down and to prevent eutrophication.

A crescente degradação da qualidade dos mananciais que servem os sistemas públicos de abastecimento de água potável faz com que se busquem novas técnicas para remoção de compostos indesejáveis. Os fatores climáticos que predominam no Brasil favorecem o desenvolvimento, em ambientes eutrofizados, de microrganismos conhecidos como cianobactérias que podem ser potencialmente produtores de toxinas. Este trabalho estudou a eficiência de remoção de microcistinas em um sistema que associa coagulação, floculação, flotação por ar dissolvido, adsorção em carvão ativado e filtração, com o intuito de remover a maior quantidade possível de microcistina para minimizar as dosagens de carvão ativado necessárias à remoção de concentrações de microcistinas - hepatotoxinas produzidas por cianobactérias - uma vez que, em uma estação real, uma menor dosagem de carvão ativado representa menores custos. Até o momento, o estado da arte permite afirmar que a aplicação de carvão ativado constitui a etapa final de um sistema de tratamento usualmente utilizado para a eficiente remoção de toxinas. Em escala de laboratório, foram feitos ensaios em equipamentos com alimentação por batelada: jarteste e flotateste. Após a preparação da água de estudo, uma amostra foi submetida à mistura rápida em um equipamento de jarteste, com aplicação de produtos químicos para atingir valores desejados de pH e, em outros ensaios, também foi adicionado o carvão ativado em pó - CAP. Após a coagulação, a amostra ensaiada era transferida para o equipamento de flotateste para a floculação e posterior flotação por ar dissolvido e, em alguns casos, submetido à filtração em papel Whatman 40. Observou-se que o uso dos parâmetros de cor e turbidez não foram suficientes para garantir a também remoção de microcistina. No sistema proposto, a aplicação de CAP antes da mistura rápida apresentou melhor desempenho na remoção de microcistina do que quando aplicado posteriormente a esta etapa; foi necessário dosagem de 60 mg/L de CAP, aplicado a 1,5 hora antes da mistura rápida para que a concentração de microcistina ficasse inferior a 1 &#956g/L. O sistema que associa coagulação, floculação, flotação por ar dissolvido, adsorção em carvão ativado e filtração mostrou ser capaz de remover microcistina a níveis inferiores a 1 &#956g/L, conforme estabelecido na Portaria 518/04 do Ministério da Saúde. / The growing quality degradation of the water sources serving the public distribution of drinking water results in the search of new techniques for the removal of undesirable compounds. The brazilian climate factors are in favor of the development of eutrophic environments, and of microorganisms known as cyanobacteria that are potential sources of toxins. This work studied the microcystin removal efficiency in a system that associates, coagulation, flocculation, dissolved air flotation, adsorption in activated carbon and filtration, with the scope to remote the maximum possible quantity of toxins in order to minimize the activated carbon dosage need to the removal of microcystin concentration - hepatotoxins produced by cyanobacteria - taking into accounts that in a real plant, the less the activated carbon, the less the operation costs. So far, the state of art permits the affirmation that the activated carbon characterizes the final step of a treatment system usually used for the efficient removal of toxins. In the laboratory scale tests were done in batch equipments: jartest and flotatest. After the preparation of the water in study one sample was submitted to a quick mixture in a jartest, with the application of chemical products to reach the desired pH levels, and in other assays powder activated carbon PAC was also added. After the coagulation, the tried sample was transferred to the flotatest equipment to achieve flotation and posterior dissolved air flotation, and in some cases, submitted to filtration in Whatman 40. It could be observed that the use of color and turbidity parameters were not sufficient to guarantee the microcystin removal. In the proposed system, the PAC application before the quick mixture presented better performance in the removal of microcystins than the posterior application to this step; a dosage of 60 mg/L of PAC was necessary when applied 1,5 hour before the quick mixture for the microcystin concentration be as low as 1 &#956g/L. The system which associates coagulation, flocculation, dissolved air flotation, activated carbon adsorption and filtration, exhibits the ability of microcystin removal to levels below 1 &#956g/L as is established in Portaria 518 - 23/03/05 - Ministério da Saúde - Brazil.