O objetivo do presente trabalho foi desenvolver e validar um método analítico empregando microextração em fase sólida (SPME) para detecção e quantificação de isoflurano (ISO) na forma volátil e incluso em nanoemulsões intravenosas e, ainda, avaliar o efeito biológico destas. A detecção do ISO foi realizada através de cromatografia em fase gasosa com detector de ionização de chama (CG/DIC). As condições ideais para realização da pré-concentração e extração de ISO através da técnica de SPME foram temperatura ambiente, agitação constante, 30 min de extração e 2 min de dessorção no injetor do CG. O método desenvolvido foi validado avaliando os parâmetros de especificidade, linearidade, limites de detecção e quantificação, precisão, exatidão e robustez. As nanoemulsões contendo ISO foram desenvolvidas através da homogeneização à alta pressão, e apresentaram diâmetro médio, índice de polidispersão, potencial zeta e pH de 150 ± 0,78 nm, 0,08 ± 0,01, - 18 ± 2,4 mV e 6,03 ± 0,04, respectivamente. O pH foi ajustado para 7,4 (valor fisiológico). O teor de ISO nas formulações foi de 98,4 %. Não houve modificação das características físico-químicas das nanoemulsões após 30 dias de armazenamento a 8 ºC. Análises de espalhamento de luz múltiplo não demonstraram tendência a fenômenos de instabilidade física para as formulações. Os estudos do efeito anestésico das nanoemulsões intravenosas contendo ISO em cães evidenciaram uma redução significativa (p < 0,05) na dose comparada com a administração de ISO volátil. Não houve alterações no débito cardíaco, saturação de oxigênio na hemoglobina e nos biomarcadores das funções renal, hepática e muscular. Uma queda na pressão arterial dos cães foi observada em todos os tratamentos devido ao efeito hipotensor do ISO. Após administração das nanoemulsões contendo ISO e branca, observou-se taquipnéia, edema, eritema, e baixas concentrações de dióxido de carbono expiradas. Assim, a nanoemulsificação do ISO foi realizada com sucesso e a aplicação na anestesia geral intravenosa foi demonstrada. / The aims of this work were to develop and validate an analytical method using solidphase microextraction (SPME) to detect and quantify isoflurane (ISO) inhalation liquid and loaded in intravenous nanoemulsions, and also evaluate the biological effect of the formulations. ISO detection was made by gas chromatography with flame ionization detector (GC/FID). The ideal conditions setting for the pre concentration and extraction of ISO through SPME were environmental temperature, constant stirring, 30 min for extraction and 2 min for analyte desorption in the GC inlet port. The developed method was validated by means of specificity, linearity, detection and quantification limits, precision, accuracy and robustness. The ISOloaded nanoemulsions were formulated by high-pressure homogenization, and presented average diameter, polydispersity index, zeta potential and pH of 150 ± 0.78 nm, 0.08 ± 0.01, -18 ± 2.4 mV and 6.03 ± 0.04, respectively. The pH was adjusted to 7.4 (physiological value). The drug content on the formulations was 98.4 %. After 30 days of storage at 8 ºC no changes on nanoemulsion’s physicalchemical characteristics were observed. Multiple light scattering analysis did not demonstrate any physical destabilization phenomena for the formulations. The anesthetic effect study for the intravenous ISO-loaded nanoemulsions in dogs highlighted a significant reduction (p < 0.05) in dosage regimen when compared to the volatile ISO administration. There were no alterations on cardiac rate, oxygen hemoglobin saturation and on biomarkers of the renal, hepatic and muscle functionalities. A decrease in dog’s arterial blood pressure in all treatments due the hypotensive effect caused by ISO was observed. After the administration of the nanomulsions, ISO-loaded and unloaded, occurred tachypnea, edema, erythema and low end tidal concentrations of carbon dioxide. Taking all above into account, the method was considered easy on execution and suitable for laboratory routines, the ISO nanoemulsification was made successfully and its application on general anesthesia was demonstrated.

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), a esquizofrenia é reconhecida como um transtorno neuropsiquiátrico grave que afeta mais de 21 milhões de pessoas em todo o mundo. Para diminuir os sintomas associados a esta doença, a maioria dos pacientes esquizofrênicos fazem uso concomitantemente de antipsicóticos, antidepressivos, ansiolíticos e anticonvulsivantes. O desenvolvimento de métodos analíticos para a determinação desses fármacos em fluidos biológicos é importante para ajustar as doses administradas, minimizar os efeitos adversos e verificar a anuência do paciente à terapia. A química analítica moderna tem se direcionado para a simplificação, através da miniaturização dos sistemas analíticos. Neste contexto, pode-se destacar a técnica de microextração em sorvente empacotado (MEPS). O desenvolvimento de novas fases extratoras para MEPS, como, os monolitos de sílica híbrida permitem pré-concentração seletiva dos analitos. Neste projeto monolitos de sílica híbrida funcionalizados com grupos aminopropil ou cianopropil foram sintetizados pelo processo sol-gel. Estes monolitos apresentaram estrutura contínua, uniforme e porosa, como evidenciado pelas imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV). As análises de espectroscopia vibracional na região do infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) dos monolitos de sílica híbrida exibiram picos facilmente identificáveis, característicos dos grupos cianopropil e aminopropil. Estes monolitos foram avaliados como fase estacionária para a MEPS para a determinação de fármacos em amostras de plasma por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa em Tandem (LC-MS/MS). As variáveis MEPS (influência do pH na sorção dos analitos, número de ciclos aspirar/dispensar, etapa de limpeza do sorvente e solvente de eluição) foram otimizadas para aumentar a eficiência da extração. Em comparação com a fase de sílica híbrida aminopropil, a fase de sílica híbrida cianopropil apresentou maior capacidade de sorção para os fármacos em estudo. O método desenvolvido, MEPS/LC-MS/MS, empregando a fase extratora de sílica híbrida cianopropil, apresentou linearidade adequada com concentrações que variaram desde o limite inferior de quantificação (0,05-1,00 ng.mL-1) até o limite superior de quantificação (40-10.500 ng.mL-1) com coeficientes de determinação (R2) maiores do que 0,9955. Este método apresentou precisão com coeficientes de variação (CV) inferiores a 14% e exatidão com erro padrão relativo (EPR) de -12 a 14%. O método MEPS/LC-MS/MS foi aplicado com êxito para análise simultânea de cinco antipsicóticos (olanzapina, quetiapina, clozapina, haloperidol e clorpromazina), em combinação com sete antidepressivos (mirtazapina, paroxetina, citalopram, sertralina, imipramina, clomipramina e fluoxetina), dois anticonvulsivantes (carbamazepina e lamotrigina) e dois ansiolíticos (diazepam e clonazepam) em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos para fins de monitorização terapêutica. / According to World Health Organization (WHO), schizophrenia is recognizably a devastating neuropsychiatric disorder that affects more than 21 million people worldwide. To lessen the symptoms associated with the disease, most schizophrenic patients use other classes of drugs such as antidepressants, anxiolytics, and anticonvulsants concomitantly with antipsychotics. Developing analytical methods to quantify these drugs in biological fluids is important in therapeutic drug monitoring (TDM) to adjust doses, minimize adverse effects, and check patient adherence to the therapy. Regarding miniaturization and automation, microextraction by packed sorbent (MEPS) is a promising sample preparation technique. Sample preparation of biological matrixes is an important step in analytical processes: it removes endogenous components from the sample and pre-concentrates trace-level analytes. The development of new phases for MEPS such as the hybrid silica monoliths allows selective pre-concentration of the analytes. The present study reports on the synthesis of two hybrid silica monoliths functionalized with aminopropyl or cyanopropyl groups by the solgel process; evaluates these monoliths as selective stationary phase for MEPS to determine drugs in plasma samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); and discusses important factors (influence of pH on the sorption of analytes, number of draw/eject cycles, washing step, and elution solvent) related to the optimization of MEPS efficiency. The prepared hybrid silica monoliths consisted of a uniform, porous, and continuous silica monolithic network, as shown by scanning electron microscopy (MEV) images. The Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) spectra of the hybrid silica monoliths displayed readily identifiable peaks, characteristic of the cyanopropyl and aminopropyl groups. Compared with the aminopropyl hybrid silica phase, the cyanopropyl hybrid silica phase exhibited higher binding capacity for most of the target drugs. The developed method, MEPS/LC-MS/MS, afforded adequate linearity at concentrations ranging from the lower limit of quantification (0.05 to 1.00 ng.mL-1) to the upper limit of quantification (40 to 10500 ng.mL-1); the coefficients of determination (R2) were higher than 0.9955. The precision of the method presented coefficients of variation (CV) lower than 14%; the relative standard error (RSE) of the accuracy ranged from -12 to 14%. The developed MEPS/LC-MS/MS method allowed for simultaneous analysis of five antipsychotics (olanzapine, quetiapine, clozapine, haloperidol, and chlorpromazine) in combination with seven antidepressants (mirtazapine, paroxetine, citalopram, sertraline, imipramine, clomipramine, fluoxetine), two anticonvulsants (carbamazepine and lamotrigine), and two anxiolytics (diazepam and clonazepam) in plasma samples from schizophrenic patients, which should be valuable for TDM purposes.

Esta tese apresenta o desenvolvimento de procedimentos analíticos em sistemas de análises em fluxo com multicomutação para a determinação de anti-hipertensivos. A determinação de captopril foi baseada na redução de Cu(II) na presença do fármaco, seguida da reação de Cu(I) com sal dissódico de 4,4-dicarboxi-2,2-biquinolina (BQA). O procedimento apresentou frequência de amostragem de 47 determinações/h, com coeficiente de variação de 2,2% (n=20) e consumo de 290 &#181;g de BQA por determinação. Os resultados das análises das amostras foram concordantes com os obtidos por titulação iodométrica. O procedimento foi aplicado à construção de curvas de dissolução de medicamentos utilizando-se um aparato alternativo, sendo os resultados concordantes com a literatura. A determinação de diltiazem foi realizada pela reação entre o fármaco e ClO-, seguida da reação de N,N-dietil-p-fenilenodiamina (DPD) com o ClO- remanescente. A metodologia apresentou limite de detecção de 7,0 &#181;mol/L, frequência de amostragem de 34 determinações/h e coeficiente de variação de 0,9% (n=10), porém a aplicação foi dificultada por efeitos de matriz. Um procedimento baseado na microextração líquido-líquido do par iônico formado entre diltiazem e azul de bromotimol em meio ácido foi então desenvolvido. Foram obtidos limite de detecção de 0,9 &#181;mol/L, frequência de amostragem de 78 determinações/h e eficiência de extração de 60%. O consumo de CHCl3 foi de apenas 50 &|#181;L, gerando 383 &#181;L de resíduo por determinação. Resultados da análise das amostras foram concordantes com o procedimento de referência. Microextração líquido-líquido do par iônico formado entre losartana e alaranjado-II em meio ácido foi empregada para a determinação do fármaco. A frequência de amostragem foi de 77 determinações/h, com coeficiente de variação de 0,9% (n=10) e consumo de CHCl3 de 150 &#181;L por determinação. Porém, diferentemente do observado no procedimento análogo em batelada, foram observados problemas relacionados à seletividade do procedimento. / This thesis focused the development of flow-based analytical procedures exploiting multicommutation for the determination of anti-hypertensive drugs. The reduction of Cu(II) in the presence of captopril, followed by the reaction of Cu(I) with 4,4-dicarboxy-2,2-bichinoline disodium salt (BCA) was employed for captopril determination. The procedure showed a sampling rate of 47 determinations per hour, coefficient of 2.2% (n = 20) and consumption of 290 &#181;g BCA per determination. The results for pharmaceutical samples agreed with those obtained by iodometric titration. The procedure was applied to dissolution studies of pharmaceutical preparations using an alternative apparatus, yielding results in agreement with the literature. One of the analytical procedures for diltiazem determination was based on the reaction between the drug and ClO-, followed by the reaction between N,N-diethyl-p-phenylenediamine (DPD) and the remaining ClO-. The methodology showed a detection limit of 7.0 &#181;mol/L, sampling rate of 34 determinations per hour and coefficient of variation of 0.9% (n = 10), but application was hindered by matrix effects. Thus, on-line liquid-liquid microextraction was evaluated, based on the ion pair formation between diltiazem and bromothymol blue in acidic medium. Detection limit of 0.9 &#181;mol/L, sampling rate of 78 determinations per hour and extraction efficiency of 60% were attained. The CHCl3 consumption was only 50 &#181;L, with waste generation of 383 &#181;L per determination. The results for diltiazem determination in commercial pharmaceutical preparations agreed with the reference procedure. Finally, a procedure for losartan determination was developed based on flow injection liquid-liquid microextraction of the ion pair formed between the drug and orange-II in acidic medium. Sampling rate of 77 determinations per hour and coefficient of variation of 0.9% (n = 10) were achieved, consuming 150 &#181;L of CHCl3 per determination. However, selectivity was poor, differently that observed in the analogous batch procedure.

Este trabalho apresenta o desenvolvimento de diferentes métodos para a determinação de fluoxetina, norfluoxetina e bisfosfonatos, utilizando técnicas modernas de preparo de amostras. Dentre eles, um método simples e sensível, empregando microextração em fase sólida (SPME) e cromatografia líquida foi desenvolvido para a análise de fluoxetina e norfluoxetina em plasma. As condições de SPME foram otimizadas empregando planejamento fatorial. A extração foi realizada utilizando fibras com PDMS-DVB, e a etapa de dessorção foi realizada em uma nova interface homemade com sistema de aquecimento. Extração com sorção em barra de agitação (SBSE) com derivatização in-situ, combinada com dessorção com solventes ou dessorção térmica, acoplada à cromatografia gasosa e espectrometria de massas (GC-MS), foi também empregada para a determinação de fluoxetina em plasma. Avaliou-se a derivatização dos analitos in situ com cloroformato de etila, bem como os parâmetros tempo de extração, solvente e tempo de dessorção. A combinação de SBSE e LC-MS foi também avaliada. As amostras de plasma foram submetidas à precipitação de proteínas com ácido tricloroacético, extraídas com SBSE, e analizadas por LC-MS. Os métodos SPME-LC, SBSE-GC e SBSE-LC desenvolvidos foram completamente validados, demonstrando serem adequados para analisar fluoxetina em amostras de plasma. Métodos rápidos para a determinação de etidronato, clodronato, pamidronato e alendronato, baseados em cromatografia de troca iônica com detecção indireta no ultravioleta, foram também desenvolvidos. Os métodos são simples e demonstraram precisão, exatidão e especificidade. Além disso, os métodos validados empregam colunas de sílica, mais baratas e de mais disponibilidade do que as colunas poliméricas, frequentemente utilizadas em métodos descritos na literatura para o mesmo propósito. / This study describes different methods to analyze fluoxetine, norfluoxetine and bisphosphonates, employing modern sample preparation techniques. A simple and sensitive procedure using solid-phase microextraction (SPME) coupled with liquid chromatography was developed for the analysis of fluoxetine and norfluoxetine in plasma samples. SPME conditions were optimized employing a factorial design. The sampling step was performed using a PDMS-DVB fiber and desorption was carried out in a novel homemade heated interface. Stir bar sorptive extraction (SBSE) with in situ derivatization, in combination with either thermal or liquid desorption on-line coupled to gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), was employed for the analysis of fluoxetine. In situ derivatization using ethylchloroformate was evaluated as well as parameters such as solvent polarity, time for analytes desorption, and extraction time. SBSE combined with liquid chromatography and mass spectrometry was also used to analyze fluoxetine in plasma. Plasma samples were first submitted to protein precipitation with trichloroacetic acid, subjected to SBSE, and thereafter analyzed by LC-MS. SPME-LC, SBSE-GC, and SBSE-LC methods were completely validated showing to be adequate to assess fluoxetine in plasma samples. Rapid methods for etidronate, clodronate, pamidronate and alendronate assay were also developed. The methods were based on ion chromatography with indirect ultraviolet detection, which avoids the need for chemical derivatization procedures. The methods were simple, rapid, and demonstrated precision, accuracy, and specificity. Furthermore, they employed silica-based columns, cheaper and more readily available than polymeric columns, frequently used in previous reported methods.

Três procedimentos analíticos envolvendo microextração líquido-líquido (MELL) em fluxo foram desenvolvidos para as determinações de formaldeído em leite, detergentes aniônicos em águas de rios e bisfenol A (BPA) em águas de torneira. Microextração líquido-líquido dispersiva (MELLD) foi empregada no primeiro e no segundo procedimentos. O primeiro procedimento foi conduzido em um sistema fluxo-batelada no qual a quantificação espectrofotométrica era realizada diretamente na câmara de mistura/reação, através do acoplamento de fibras ópticas. No segundo, foi explorada a estratégia lab-in-syringe, em que a formação do par iônico entre os detergentes aniônicos e corante catiônico azul de metileno, bem como MELLD ocorriam no interior da seringa, sendo os analitos quantificados na fase orgânica por espectrofotometria. O terceiro procedimento envolveu MELL em sistema de análises por injeção sequencial (SIA), baseada na formação de um filme de 1-octanol na parede da bobina de extração. O extrato foi eluído com etanol e a quantificação de BPA foi realizada por espectrofluorimetria. As linearidades das curvas analíticas, os limites de detecção e os limites de quantificação ao nível de 95% de confiança foram: 0,5-5,0 mg L-1, 100 e 300 ?g L-1 para formaldeído, 0,03-0,5 mg L-1, 9,0 e 29,0 ?g L-1 para detergentes, e 5,0 - 100 ?g L-1, 1,8 ?g L-1 e 5,4 ?g L-1 para BPA. Os procedimentos desenvolvidos não apresentaram efeitos de matriz, e as recuperações se situaram entre 91 e 112%. A precisão e exatidão do procedimento foram concordantes com os procedimentos de referência, ao nível de 95% de confiança. Todos os procedimentos apresentaram coeficientes de variação menores do que 3,5% (n=10), frequência de amostragem de 10-17 h-1, consumiram apenas 30-40 µL de solventes orgânicos e geraram 2,7-6,7 mL de resíduos por determinação / Three analytical procedures involving flow-based liquid-liquid microextraction (LLME) were developed for the determinations of formaldehyde in milk, anionic detergents in river waters, and bisphenol A (BPA) in tap waters. The first and second procedures involved dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) and spectrophotometric detection. The first one was carried out in a flow-batch system, in which the spectrophotometric quantification was performed directly in the mixing/reaction chamber by coupling optical fibers. The second one exploited the lab-in-syringe strategy, in which the ion-pair formation between the anionic detergents and the methylene blue cationic dye, as well as DLLME, were carried out inside the syringe. The third procedure involved LLME in a sequential injection system based on the formation of a 1-octanol film on the inner wall of the extraction coil. The extract was eluted with ethanol and BPA was quantified by spectrofluorimetry. Linear response ranges, detection and quantification limits estimated at the 95% confidence level were: 0.5-5.0 mg L-1, 100 and 300 ?g L-1 for formaldehyde; 0.03-0.5 mg L-1, 9.0 and 29.0 ?g L-1 for detergents, and 5.0-100 ?g L-1, 1.8 and 5.4 ?g L-1 for BPA. Matrix effects were not observed for the assayed samples and recoveries ranged from 91 to 112%. Accuracy and precision of the results agreed with those attained by reference procedures at the 95% confidence level. All procedures yielded coefficients of variation lower than 3.5% (n = 10), sampling rates within 10 and 17 h-1, consumed only 30-40 ?L of organic solvents, and generated 2.7-6.7 mL of waste by determination

Made available in DSpace on 2016-08-19T12:56:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DARLAN FERREIRA DA SILVA.pdf: 808482 bytes, checksum: cec93c6177a364a96efd7df7673d26a0 (MD5) Previous issue date: 2010-10-11 / Organophosphate insecticides, especially those based on the active ingredient methyl parathion, have been extensively used in crop protection of rice in the State of Maranhão. In this work, an optimized chromatographic method for determination of the methyl parathion insecticide by using solid phase microextraction in a confined environment (headspace) followed by analysis employing gas chromatography with mass spectrometric detection (HS-SPME-GC/MS). Electroanalytical methods using amperometric biosensors were also developed and used to analyze the composite samples of fresh rice. The optimized method using SPME resulted in satisfactory results for sensitivity (limit of detection: 0.026 mg/L-1), precision (coefficients of variation between 6.1 and 22.4%, 8.8% and 32.5 and 19.7 and 24.6%, for milled rice samples, rice with shells and full rice, respectively) and accuracy (recoveries ranging from 73.2 to 90% for milled rice samples, from 88.7 to 89.5%, for paddy rice samples and from 59.5 to 60.6% for full rice samples). In the case of biosensors, these have been built based on acetylcholinesterase enzyme (AChE), commercially obtained or genetically modified, having the sensors prepared with carbon paste modified with TCNQ (tetracyanoquinodimethane) mediator. Better sensitivities were observed with sensors based on AChE enzymes extracted from Drosophila melanogaster. Detection limits of 10.0, 0.05 and 0.001 μg.L-1 were found for the sensors based on AChE (ee), AChE (eb) and mutant enzymes (AChE (Dros) B08 e B12), respectively. The efficiency of the detection method of the methyl parathion insecticide in rice samples without any previous treatment was evidenced by an average recovery of 103.9%, 101%, 102.3% and 105.6%, for the sensors prepared with AChE (ee), AChE (eb), AChE (Dros) B08 and B12 enzymes, respectively. In general, the chromatographic technique used was practical and efficient for direct detection of insecticide residues in rice samples in a wider range of concentration (0.1 a 1 mg.Kg-1). Since the biosensor was more sensitive and effective in smaller amounts (0.0005 a 0.01 mg.Kg-1) of such insecticide in rice, considering the additional advantage of speed and decreasing cost of the analytical technology. / Os inseticidas organofosforados, em especial aqueles à base do princípio ativo paration metílico, têm sido extensivamente usados na proteção de cultivos de arroz no Estado do Maranhão. Neste trabalho, foi otimizado um método cromatográfico para determinação do inseticida paration metílico usando microextração em fase sólida em ambiente confinado (headspace), seguido de análise empregando cromatografia a gás com detecção por espectrometira de massas (HS-SPME-GC/MS). Métodos eletroanalíticos empregando biossensores amperométricos também foram desenvolvidos, tendo sido empregados para análise do composto em amostras de arroz in natura. O método otimizado empregando SPME resultou em resultados satisfatórios quanto à sensibilidade (limite de detecção: 0,026 mg/L-1), precisão (coeficientes de variação entre 6,1 e 22,4%; 8,8 e 32,5% e 19,7 a 24,6%, para as amostras de arroz polido, arroz com casca e arroz integral respectivamente) e exatidão (recuperações na faixa de 73,2 a 90%, para as amostras de arroz polido; de 88,7 a 89,5 %, para as amostras de arroz com casca e de 59,5 a 60,6%, para as amostras de arroz integral). No caso dos biossensores, estes foram construídos à base de enzimas acetilcolinesterase (AChE), comerciais e geneticamente modificadas, tendo sido os sensores preparados com pasta de carbono modificada com o mediador TCNQ (tetracianoquinodimetano). Melhores sensibilidades foram verificadas com sensores preparados à base de enzimas AChE extraídas da Drosophila Melanogaster. Limites de detecção de 10; 0,05 e 0,001μg.L-1 foram encontrados para os sensores preparados com as enzimas AChE (ee), AChE (eb) e mutantes (AChE (Dros) B08 e B12), respectivamente. A eficiência do método de detecção do inseticida paration metílico em amostras de arroz sem nenhum prévio tratamento foi comprovada pelas recuperações médias de 103,9%; 101 %; 102,3% e 105,6 % para os sensores preparados com as enzimas AChE (ee), AChE (eb), AChE (Dros) B08 e B12 respectivamente. De modo geral, a técnica cromatográfica empregada foi prática e eficiente para detecção direta de resíduos do inseticida em amostras de arroz, em uma faixa maior de concentração (0,1 a 1 mg.Kg-1). Já os biossensores foram mais sensíveis e eficientes em teores menores (0,0005 a 0,01 mg.Kg-1) do inseticida no arroz, considerando ainda a vantagem adicional da rapidez e menor custo da técnica analítica.

Estudos de metabolismo in vitro possuem o intuito de caracterizar e quantificar possíveis metabólitos, elucidar as vias metabólicas e sugerir modelos a serem seguidos para a realização de estudos in vivo. Com o intuito de estudar o metabolismo in vitro não estereosseletivo da rosiglitazona (RSG) empregando fração microssomal de fígado de ratos,foi desenvolvida uma metodologia por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção UV em 245 nm, para analisar a RSG e seus principais metabólitos, p-hidroxi rosiglitazona (?-OH-R) e N-desmetil rosiglitazona (N-Dm-R). Os analitos foram separados em fase reversa, utilizando uma coluna X-Terra MS C-18 (partículas de 3,5 ?m) e fase móvel composta por água:acetonitrila:ácido acético (85:15:0,5, v/v/v), na vazão de 1 mL min-1. Matrizes biológicas contém um grande excesso de proteínas, lipídeos e outros materiais endógenos que interferem na análise de fármacos e metabólitos, tornando necessário um procedimento adequado de preparação das amostras antes da análise cromatográfica. A microextração em fase líquida com membrana cilíndrica oca (HF-LPME) é uma técnica promissora para a preparação de amostras em estudos de metabolismo in vitro, pois, além de promover o clean-up, promove também o enriquecimento dos analitos na amostra. A HF-LPME foi aplicada pela primeira vez para a extração simultânea desse fármaco e seus metabólitos. O sistema de três fases foi escolhido como o mais apropriado, empregando uma solução de ácido clorídrico como fase aceptora e 1-octanol como solvente orgânico. A otimização dos demais parâmetros foi realizada através de planejamento fatorial fracionário. O método foi validado e foi linear no intervalo de 50-6000 ng mL-1, apresentando limites de quantificação de 50 ng mL-1 e recuperações acima de 47 % para a RSG e seus metabólitos (?-OH-R e N-Dm-R). O método validado foi empregado em um estudo de metabolismo in vitro com fração microssomal de fígado de ratos. Nesse estudo, foi possível estimar as constantes de Michaelis-Menten (Km) e a velocidade inicial máxima (Vmax). N-Dm-R e ?-OH-R apresentaram valores de Vmax de 87,30 ± 8,04 e 51,64 ± 12,25 ?mol min-1 mg proteína-1, respectivamente, enquanto que os valores de Km foram de 58,14 ± 11,85 e 77,84 ± 36,77 mmol L-1, respectivamente. Outros metabólitos foram observados nos cromatogramas e a identificação foi feita por espectrometria de massas: ?rto-hidroxi-rosiglitazona e N-desmetil-hidroxi-rosiglitazona. A RSG é comercializada como uma mistura racêmica, apesar de possuir sua atividade antidiabética relacionada essencialmente com o enantiômero (S). O centro quiral desse fármaco possui um grupo carbonila, por isso, o enantiômero (R) pode se converter no enantiômero (S) ou vice-versa, via tautomerismo cetoenólico. Dados da literatura indicavam que essa racemização poderia ser lenta o suficiente para possibilitar o estudo dos enantiômeros isoladamente. Entretanto, até o momento não há dados sobre a disposição cinética ii e metabolismo enantiosseletivos desse fármaco. Sendo assim, propôs-se o desenvolvimento de metodologias analíticas para estudar a racemização da RSG e seus metabólitos e avaliar a possibilidade de estudar seu metabolismo in vitro de forma estereosseletiva. O método foi desenvolvido empregando HPLC com detecção em 245 nm. A separação dos enantiômeros do fármaco e metabólitos, também quirais, foi obtida empregando uma coluna Chiralcel OJ-H e fase móvel constituída por metanol:etanol (90:10; v/v), na vazão de 0,3 mL min-1. O estudo de racemização mostrou que o fármaco e seus metabólitos são racemizados nas condições em que o estudo de metabolismo é conduzido. Finalmente, para estudar o metabolismo in vitro da pioglitazona (PGZ), foi desenvolvido um método para análise desse fármaco e de seus principais metabólitos, a hidroxi-pioglitazona (M-IV) e a ceto-pioglitazona (M-III) empregando a eletroforese capilar (CE). As análises foram realizadas em capilar de sílica de 50 ?m de diâmetro interno e com comprimento efetivo de 40 cm, utilizando tampão fosfato de sódio 50 mmol L-1, pH 2,5, detecção em 190 nm, tensão de 30 kV e temperatura do capilar de 35 °C. A HF-LPME também foi empregada para a preparação das amostras. O sistema de três fases foi escolhido, empregando solução de ácido clorídrico como fase aceptora e o 1-octanol como solvente orgânico. A otimização dos demais parâmetros foi realizada através de planejamento fatorial fracionário. O método validado foi linear no intervalo de 200 - 25000 ng mL-1 para PGZ e 200 - 2000 ng mL-1 para os metabólitos, apresentando limites de quantificação de 200 ng mL-1 e recuperações acima de 19 % para a RSG e seus metabólitos M-IV e M-III. O método validado foi empregado em um estudo de metabolismo in vitro contendo fração microssomal de fígado de ratos, mas nesse estudo, não foi possível observar a formação dos metabólitos. Entretanto, esse método pode ser usado em outros modelos de metabolismo in vitro (microssomas humanos), nos quais se observa a formação desses metabólitos em concentrações maiores. / In vitro metabolism studies have been used to characterize and to quantify possible metabolites, to elucidate metabolic pathways and to suggest models to perform in vivo studies. So the purpose of this study was to evaluate the in vitro rosiglitazone (RSG) metabolism employing microsomal fraction obtained from rat livers. A high- performance liquid chromatography (HPLC) method with UV detection at 245 nm was developed to analyze RSG and the main metabolites, p-hydroxy rosiglitazone (?-OH-R) e N-desmethyl rosiglitazone (N-Dm-R). The analytes were separated under reversed phase conditions, using a X-Terra MS C-18 column (3.5 ?m particle size) and a mobile phase consisting of water:acetonitrile:acetic acid (85:15:0.5, v/v/v), at a flow rate of 1 mL min-1. Biological matrices contain a large excess of proteins, lipids and other endogenous compounds that interfere in the analysis of drugs and metabolites. So, a suitable sample preparation technique is required. Hollow-fiber liquid phase microextraction (HF-LPME) is a promising technique for the preparation of biological samples. Besides the clean-up, analytes enrichment is also achieved. HF-LPME for the simultaneous analysis of RSG and its main metabolites is described for the first time. The three-phase extraction was performed using hydrochloride acid solution as acceptor phase and 1-octanol as organic solvent. The other parameters were optimized by fractional factorial design. The method was validated and it was linear over the concentration range of 50-6000 ng mL-1, with quantification limits of 50 ng mL-1 and recoveries above 47 %. The validated method was used to estimate Michaelis-Menten (Km) constant and maximum initial velocity (Vmax). N-Dm-R e ?-OH-R showed Vmax values of 87.30 ± 8.04 and 51.64 ± 12.25 ?mol min-1 mg protein-1, respectively, while the Kmvalues were 58.14 ± 11.85 e 77.84 ± 36.77 mmol L-1, respectively. Other possible metabolites were observed in the chromatograms and they were identified by mass spectrometry: ?rtho-hydroxy-rosiglitazone e N-desmethyl-hydroxy-rosiglitazone. RSG is marketed as a racemic mixture although the antidiabetic activity is related essentially to the (S)-enantiomer. The chiral center has a carbonyl group, therefore the (R)-enantiomer could be transformed to the (S)-enantiomer or vice-versa by keto-enolic tautomerism. The literature indicates that this racemization is slow enough to allow the evaluation of the properties of the isolated enantiomers. However, there is no information in the literature about enantioselective RSG kinetic disposition and metabolism. Considering this facts, an analytical procedure was developed to study the racemization of RSG and its metabolites under different conditions and to determine if the enantioselective metabolism would be performed. The method was developed by HPLC with detection at 245 nm. The chiral separation of RSG and metabolites was achieved on a Chiralcel OJ-H column, with the mobile phase consisting of methanol:ethanol (90:10,v/v). The results obtained showed that the racemization occurs under the conditions used in in vitro iv metabolism studies. Finally, to study the in vitro metabolism of pioglitazone (PGZ), another method was developed by capillary electrophoresis (CE) to determine this drug and its main metabolites, hydroxy-pioglitazone (M-IV) and keto-pioglitazone (M-III). The analyses were conducted using a fused silica capillary (50 ?m inner diameter and 40 cm effective length), sodium phosphate buffer 50 mmol L-1, pH 2.5, detection at 190 nm, voltage of 30 kV and capillary temperature of 35°C. HF-LPME was also used for sample preparation with hydrochloride acid solution as acceptor phase and 1-octanol as organic solvent. The other parameters were optimized by fractional factorial design. The method was validated showing to be linear in the concentration range of 200 - 25000 ng mL-1 for PGZ and 200 - 2000 ng mL-1 for the metabolites. Quantification limits were 200 ng mL-1 for all analytes and the recoveries were higher than 19%. The validated method was used to study the in vitro metabolism of PGZ by rat liver microsomal fraction, but it was not possible to observe the formation of the metabolites in this study. However this method could be used in other in vitro metabolism models (human microssomes), in which higher concentrations of these metabolites are observed. Keywords:

Orientadores: Helena Teixeira Godoy, Fabio Augusto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-12T13:02:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kowalski_ClaudiaHoffmann_D.pdf: 1521730 bytes, checksum: 5077a83f5292bcd2dd1b651ce2fc229c (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Um estudo sobre a contaminação do leite materno com bifenilas policloradas (PCB) foi desenvolvido objetivando um conhecimento mais amplo dessa problemática no nosso país. Para isso, amostras de leite foram coletadas em nove estados brasileiros e questionários contendo perguntas sobre hábitos alimentares, condições sócio-econômicas, locais de habitação entre outras foram aplicados às mães doadoras. A determinação dos PCB foi feita por Microextração em Fase Sólida no modo headspace (HS-SPME) combinada com Cromatografia Gasosa e Detector de Captura de Elétrons (GC-ECD). As etapas da SPME foram otimizadas univariadamente e através de planejamento experimental Doehlert. A análise de variância mostrou que a temperatura de extração e a força iônica do meio (estudada através da adição de NaCl) foram as variáveis que mais influenciaram nas quantidades de PCB extraídas. Em seguida, refinaram-se as condições experimentais através de uma abordagem neuro-genética (rede neural Bayesiana aliada a algoritmos genéticos) que identificou como o ponto experimental ótimo a seguinte condição: concentração de NaCl de 0,36 g mL-1, temperatura de extração de 95,0 °C, tempo de extração de 60 minutos e adição de 210 µL de metanol. Após a otimização, o método foi validado através do estudo das figuras de mérito e apresentou-se linear na faixa estudada (1 a 16 µg L-1) com r > 0,9884, além de boa precisão (RSD < 12 %, n = 5), recuperação aceitável (71 a 127 %) e limites de quantificação entre 0,45 µg L-1 e 2,42 µg L-1. A fim de estabelecer correlações entre os resultados das amostras (expressos na forma de áreas cromatográficas) e os resultados obtidos nos questionários, fez-se uso da rede neural de Kohonen. Assim, foi possível verificar que nas cidades metropolitanas o acúmulo de PCB no leite é mais expressivo que em outras regiões. Por exemplo, em São Paulo 58 % das amostras estavam contaminadas com algum PCB, principalmente os congêneres 180 e 153. Outro resultado gerado pela rede foi que, em geral, as amostras de leite maduro (maior porcentagem de gordura) estavam mais contaminadas com PCB. O número de gestações também foi um fator importante a ser considerado, pois o estudo mostrou que o primeiro filho normalmente recebe uma dose maior de PCB do que os demais. Ainda, maior contaminação foi encontrada no leite de mães que moram nas proximidades de indústrias e/ou rios poluídos, corroborando com o fato de que esses compostos chegam facilmente ao meio ambiente e em seguida aos seres humanos / Abstract: A study about the contamination of the breast milk with polychlorinated biphenyls (PCB) was developed aiming a wider knowledge of this problematic in our country. For that, breast milk samples were collected in nine Brazilian states and questionnaires with questions regarding to food habits, social and economic conditions, places of dwelling between others were applied to the donors. The determination of the PCB was done by headspace Solid-Phase Microextraction (HS-SPME) combined with Gas Chromatography and Electron Capture Detector (GC-ECD). The SPME steps were optimized through univariated procedures and Doehlert experimental design. The analysis of variance showed that the temperature of extraction and the ionic strength of the media (studied by the addition of NaCl) were the most significant variables in the quantities of extracted PCB. After that, the experimental conditions were refined considering a neurogenetic approach (Bayesian neural network and genetic algorithms) and it was identified as the optimum experimental point the following condition: concentration of NaCl of 0.36 g mL-1, temperature of extraction of 95.0 °C, time of extraction of 60 minutes and addition of 210 µL of methanol. After the optimization, the method was validated through the study of the figures of merit. It showed linear in the studied range (1 to 16 µg L-1) with r > 0.9884, besides good precision (RSD < 12 %, n = 5), acceptable recuperation (71 to 127 %) and limits of quantization between 0.45 µg L-1 and 2.42 µg L-1. In order to establish correlations between the results of the samples (expressed as chromatographic areas) and the results obtained in the questionnaires, Kohonen neural network had been used. Thus, it was possible to check that in the metropolitan cities the accumulation of PCB in the milk is more expressive than in other regions. For example, in Sao Paulo state, 58 % of the samples were contaminated by some PCB, mainly the congener 180 and 153. Another result produced by the net was that the samples of hindmilk (higher fat percentage) were the most contaminated. The number of gestations also was an important factor to be considered, since the study showed that the first son normally receives a higher dosage of PCB compared to the others. Also higher levels of contamination was found in the milk of mothers who lived in the proximities of industries and/or polluted rivers, corroborating with the fact that these compounds are easily spread in the environment and consequently in the human beings / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The emerging pollutants are substances that enter continuously in the environment and are being more recognize due to the advancement of instrumental and sample preparation techniques. These contaminants include several chemical classes, such as pharmaceuticals, hormones, personal care products, flame retardants and others. Water is one of the most susceptible matrix since the sewage discharge is one of the main routes of environmental pollution. Bar adsorptive microextration (BAμE) has shown great analytical capacity for the analysis of organic compounds in residual level and has become a well-established analytical tool in sample preparation. In this work, a simple and low cost method was validated for the analysis of 13 emerging contaminants in water using BAμE with polymeric sorbent followed by ultra high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS). The preparation, stability tests and development of BAμE devices are also discussed. Eleven different coating phases were evaluated. In order to select the best combination of experimental conditions for extraction and back extraction, central composite design (CCD) with four variables was applied. Validation results were satisfactory, since the method presented recoveries between 74% and 118% with relative standard deviations (RSD) < 19%. The analytical performance presented detection and quantification limits of 0.012 to 0.6 and 0.04 to 2 μg L-1, respectively. The proposed method combines a simple and effective sample preparation for the determination of emerging contaminants in water using a microextraction technique (BAμE) followed by UHPLC-MS/MS analysis. The method applicability was evaluated using real samples of surface, drinking and tap water and 6 positive samples were found indicating the presence of bisphenol A (0.08-0.665 μg L-1) and paracetamol (0.104-4.2 μg L-1). / Os contaminantes emergentes são substâncias que entram continuamente no meio ambiente e que estão sendo reconhecidas com maior profundidade devido ao avanço de técnicas instrumentais e de preparo de amostra. Estes compostos englobam diversas classes químicas, como por exemplo, fármacos, hormônios, produtos de higiene e cuidado pessoal, retardantes de chama, dentre outros. Uma das matrizes mais suscetíveis à contaminação é a água tendo em vista que a descarga de esgoto é uma das principais vias de poluição ambiental. A microextração adsortiva em barra (BAμE) tem demonstrado grande capacidade analítica para a análise de compostos orgânicos em nível residual e vem se tornando uma ferramenta analítica bem estabelecida no âmbito de preparo de amostras. Neste estudo foi desenvolvido e validado um método simples e de baixo custo para a determinação de 13 contaminantes emergentes em água utilizando BAμE e empregando sorvente polimérico com posterior análise por cromatografia liquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas em série (UHPLC-MS/MS). O preparo das barras bem como os testes de estabilidade foram avaliados. Onze sorventes foram testados para revestir os dispositivos. A fim de avaliar a melhor combinação de parâmetros para a extração e dessorção dos analitos, utilizou-se um planejamento do composto central (CCD) com 4 variáveis. Os resultados da validação foram satisfatórios uma vez que as recuperações obtidas ficaram entre 74% e 118% com desvio padrão relativo RSD < 19%. Os limites de detecção e quantificação foram de 0,012 a 0,6 e 0,04 a 2,0 μg L-1, respectivamente. O método proposto combina uma etapa de preparo de amostra simples e eficaz para a determinação de contaminantes emergentes em água. A aplicabilidade do método foi avaliada utilizando amostras reais de água de superfície, de torneira e mineral e destas, 6 amostras apresentaram bisfenol A (0,08-0,665 μg L-1) e paracetamol (0,104-4,2 μg L-1).

Orientadores: Marco Aurelio Zezzi Arruda, Fabio Augusto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-14T14:05:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lopes_AlineSoriano_D.pdf: 1700718 bytes, checksum: f6955b16e49880b14a0e1ec26e824561 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Este trabalho de Tese visa acoplar a fibra, empregada em microextração em fase sólida (SPME, do inglês solid phase microextraction), ao espectrômetro de absorção atômica com forno de grafite (GF AAS, do inglês graphite furnace atomic absorption spectrometer), visando reter espécies organometálicas volatilizadas nas etapas de secagem e pirólise do GF AAS. O elemento escolhido para avaliar o acoplamento SPME-GF AAS foi o Sn. Primeiramente, a concentração total de Sn foi determinada, utilizando a amostragem em suspensão como estratégia, uma vez que na avaliação da distribuição dos compostos organoestânicos por SPME-GF AAS, a concentração total de Sn seria efetuada a partir de uma suspensão. Para a otimização do método foram avaliados os seguintes parâmetros: solução de preparo da suspensão, e efeito da temperatura de pirólise e atomização. A mistura contendo HF 10 % (v/v) e HNO3 1 % (v/v) foi escolhida para preparar a suspensão, a composição Mg(NO3)2 + NH4H2PO4 apresentou resultados apropriados para ser utilizada como modificador químico convencional, e 1000 e 2200 °C foram as temperaturas ótimas para a pirólise e a atomização, respectivamente. Devido ao efeito de matriz, foi utilizada a técnica de adição de analito para a quantificação de Sn em suspensões de sedimento marinho e de rio, em que os limites de detecção e quantificação calculados foram de 1,5-2,6 e 4,5- 7,6 µg g, respectivamente. Para avaliar o acoplamento SPME-GF AAS, visando à retenção das espécies organoestânicas (butiltricloroestanho, dibutildicloroestanho e tributilcloroestanho) foi utilizada, primeiramente, uma suspensão de sedimento. A suspensão foi sonicada e, em seguida, uma alíquota foi injetada no forno de grafite do GF AAS juntamente com o reagente de derivação (tetraetilborato de sódio - NaBEt4). A programação do forno de grafite foi aplicada e a fibra de SPME foi introduzida no atomizador. Após a retenção das espécies de interesse na fibra, a mesma foi conduzida ao cromatógrafo a gás (CG) para a separação e detecção dos analitos. Os parâmetros instrumentais do CG foram previamente estudados, visando a melhor separação das espécies de interesse. Esses estudos foram realizados utilizando o modo de extração por headspace e SPME (HS-SPME, do inglês headspace-solid phase microextraction). Em relação aos estudos envolvendo suspensões de sedimento no acoplamento proposto SPME-GF AAS, alguns parâmetros foram avaliados frente à retenção das espécies de interesse; entre eles pode-se citar o tipo de fibra, a concentração do reagente de derivação e o pH da reação. Melhores resultados foram observados para a fibra PDMS/DVB, utilizando uma concentração de 0,2 % (m/v) de NaBEt4 para a etilação das espécies de interesse, sendo a reação realizada em pH 5,0. Entretanto, baixa eficiência de retenção (< 20 %) das espécies de interesse em suspensão de sedimento, foi obtida utilizando-se o acoplamento SPME-GF AAS, quando comparada à extração por HS-SPME. Dessa forma, foi realizada uma extração das espécies de interesse das amostras de sedimento, utilizando a energia ultrassônica, anteriormente à sua aplicação no acoplamento proposto SPME-GF AAS. Nesta etapa do trabalho, a temperatura do forno de grafite e o tempo de exposição da fibra de SPME no forno de grafite foram otimizados, visando à máxima eficiência de retenção das espécies de interesse no acoplamento SPME-GF AAS. Os melhores resultados foram observados para temperaturas do forno de grafite de 90 °C, com 986 s de tempo de exposição da fibra no atomizador. Por fim, foram realizados experimentos visando determinar a concentração total de Sn, e reter suas espécies organometálicas simultaneamente, na fibra de SPME, utilizando o acoplamento SPME-GF AAS. / Abstract: The goal of this Thesis was coupling the solid phase microextraction (SPME) to graphite furnace atomic absorption spectrometer (GF AAS) for extracting the organometallic species volatilized in the drying and pyrolysis steps of the GF AAS. For evaluating the SPME-GF AAS coupling, Sn was then chosen. Firstly, the total Sn concentration using the slurry sampling strategy was determined, once in the evaluation of the organotin compounds by SPME-GF AAS, the total Sn concentration would be obtained from a slurry solution. Some parameters were evaluated, such as the nature of the solution to prepare the slurry, and pyrolysis and atomization temperatures effects. The mixture of 10 % (v/v) HF plus 1 % (v/v) HNO3 was chosen to prepare the sediment slurries, the Mg(NO3)2 plus NH4H2PO4 was appropriated as conventional chemical modifier, and the values of 1000 and 2000 °C was used as pyrolysis and atomization temperatures, respectively. The analyte addition was used in the Sn determination in sediment (marine and river) samples by slurry sampling due to matrix effects. The detection and quantification limits were calculated as 1.5-2.6 and 4.5-7.6 µg g, respectively. For evaluating the SPME-GF AAS coupling in the extraction of organotin species (butyltrichloride, dibutyldichloride, and tributylchloride), a sediment slurry was firstly used. For this task, the slurry was sonicated and an aliquot of this solution plus the derivatization reagent (sodium tetraethylborate ¿ NaBEt4) were introducted consecutively into the graphite furnace of the GF AAS. Then, the graphite furnace program was applied, and the SPME fiber was exposed into the furnace. After the extraction of organotin species by SPME-GF AAS, the analytes were separated and detected by gas chromatography (GC). Before this procedure, instrumental parameters of the GC were studied. For this task, it was used the conventional extraction by HSSPME (headspace-solid phase microextraction). Related to studies of SPME-GF AAS coupling, employing slurry sampling, some parameters, such as fiber coating, derivatization reagent concentration, pH of the reaction, among others, were evaluated. Satisfactory results were obtained using the PDMS/DVB fiber in the presence of 0.2 % (m/v) NaBEt4 and pH 5.0. However, low extraction efficiency (< 20 %) was obtained, using the SPME-GF AAS coupling for organotin species extraction from sediment slurries, when comparing to HS-SPME extractions. Then, the extraction of organotin species from sediment samples, using the ultrasonic energy was carried out, before the sample introduction into the SPME-GF AAS coupling. In this step, the graphite furnace temperature and the fiber exposure time in the atomizer were optimized. The better results were noted when 90 °C as the graphite furnace temperature was used, and 986 s was attributed as the fiber exposure time into the atomizer. Additionally, the determination of total Sn concentration, and the extraction of organotin species in the SPME fiber, using the SPME-GF AAS coupling, was simultaneously carried out. / Doutorado / Quimica Analitica / Doutor em Ciências