A babosa (Aloe vera (L.) Burm. f.), família Asphodelaceae, reconhecida e explorada mundialmente pela indústria farmacêutica e cosmética devido aos princípios medicinais de seus compostos fenólicos e principalmente ao gel de polissacarídeos específicos, foi submetida a dois experimentos interligados. O primeiro, refere-se a micropropagação no qual foram avaliados tratamentos de desinfestação de ápices caulinares, multiplicação in vitro e condições de aclimatação ex vitro. O segundo experimento refere-se ao cultivo das plantas em areia lavada e irrigada com solução nutritiva, em condições controladas de casa de vegetação, onde foram testados os efeitos de doses (105; 210 e 315 ppm) de nitrogênio avaliados aos 90; 180 e 270 dias de cultivo. Os efeitos foram avaliados em função dos teores foliares dos macronutrientes e dos micronutrientes boro, cobre, ferro manganês e zinco, de proteínas totais solúveis (PTS), de açúcares redutores (AR) e açúcares totais solúveis (ATS) e sobre o crescimento por meio do índice de área foliar (IAF), da taxa de assimilação líquida (TAL), taxa de crescimento relativo (TCR), taxa de crescimento absoluto (TCA) e incrementos de massas de matérias fresca (IMMF) e seca (IMMS). Todos os dados foram analisados estatisticamente. Em relação a micropropagação, a eficiência de desinfestação foi aumentada em torno de 40% na obtenção de ápices caulinares verdes em início de brotação quando as plantas colhidas a campo foram previamente desinfestadas por lavagem com solução de hipoclorito de sódio com 0,5% de cloro ativo ou com solução de dicloroisocianurato de sódio (Sumaveg®) 0,66%. p.v-1 e os ápices caulinares submetidos a imersões alternadas nas soluções dos dois produtos utilizados. A fase multiplicativa da microproagação em meio MS apresentou um rendimento de 1:5,3 a cada intervalo de 30 dias de multiplicação. A partir de 136 ápices caulinares desinfestados, verdes, em início de brotação, foram obtidas 40.495 microplantas. Classificadas em pequenas, médias e grandes, foram submetidas a condições de aclimatação observando-se que bandejas de 64 células com 40 cm3 de substrato apresentaram economia em torno de 50% de substrato e em espaço físico na casa-de-vegetação com micro-aspersão e exaustão de ar em sistema \"pad-house\", e durante o processo de aclimatação e transporte das microplantas aclimatadas. Em relação ao cultivo das plantas em doses de nitrogênio, apesar de algumas variáveis responderem melhor à dose de 105 ppm e outras à dose de 315 ppm, a dose de 210 ppm de nitrogênio favoreceu as melhores respostas para os teores de açúcares totais solúveis (504,21 mgATS.g-1 de MMS), que são diretamente relacionados ao conteúdo de polissacarídeos específicos, de interesse comercial da cultura de Aloe vera. Esses teores, por sua vez, foram propiciados pelos melhores valores de IAF, TCA, IMMF e IMMS, todos observados aos 270 dias de cultivo, ratificando a significância do fator tempo e da dose de 210 ppm de nitrogênio no cultivo dessa espécie vegetal. / Aloe vera (L.) Burm. f., family Asphodelaceae, worldwide renowned and explored by pharmaceutics and cosmetics industries due to its phenolics bearing medicinal principles and mainly to the specific polysaccharides present in the gel, was submitted to two interlinked experiments. The first one refers to apical shoot micropropagation evaluating different disinfection treatments of the explants, the in vitro bud multiplication and ex vitro acclimatization of the microplants. The second one refers to cultivation in greenhouse of the micropropagated plants in washed sand and irrigated with nutritive solution, in the presence of three nitrogen rates (105, 210 and 315 ppm); the plant material was harvested at 90-, 180- and 270-day. All data were statistically analyzed. The effects of nitrogen were evaluated on the content of the macronutrients, the following micronutrients: B, Cu, Fe, Mn and Zn and total soluble proteins, reducing sugars, total soluble sugars; the growth of the Aloe vera plants was measured through the foliar area index, the rate of liquid assimilation, rates of relative and absolute growth and increases in the fresh and dry weights. In regards to micropropagtion, the efficiency of the disinfection process was increased by 40% when the plants harvested in the field were previously washed either with sodium hypochloride (0.5% active chlorine) solution or sodium dichloroisocyanurate (Sumaveg®) 0.66% w.v-1 solution and the apical shoots explants were afterwards alternatively treated with the two disinfectants. The multiplication phase in MS medium showed a rate of 1:5.3 of microplant production at each 30-day interval with a production of 40.495 microplants out of the 136 initial disinfected apical shoots. The microplants were classified as small, medium and large plants and acclimatized in polyethylene trays bearing 64 cells with 40 cm3 of substrate each cell, a 50% saving in terms of substrate amount and free space in the greenhouse equipped with micro-aspersion irrigation, pad-house and air exhaustion systems and also in the transport of the acclimatized microplants. In regards to the effect of nitrogen rates on the development of Aloe vera plants, besides the fact that the best responses were observed either to 105 ppm or 315 ppm nitrogen by some variables, at 210 ppm nitrogen rates the best result was obtained for total soluble sugars (504.21 mg.g-1DW); the sugars are directly related to specific polysaccharides of Aloe vera and are of great importance for the industries. On the other hand, these values were favored by the best values reached by the physiological variables studied in this work at 270-day validate the significance of the time factor and the 210 ppm N rates in the Aloe vera production system.

Viguiera arenaria Baker é uma Asteraceae de Cerrado de porte herbáceo, filotaxia alterna, inflorescência em capítulo e que apresenta formação de raízes tuberosas. Apesar de análises fitoquímicas terem encontrado substâncias com atividades biológicas de interesse terapêutico, sabe-se pouco sobre a biologia da planta. Neste trabalho, buscou-se contribuir para o conhecimento de aspectos relacionados ao desenvolvimento de V. arenaria, visando atingir três objetivos específicos: verificar a taxa de germinação em condições in vitro; estabelecer um protocolo de regeneração in vitro; verificar modificações epigenéticas (metilação de citosina) no DNA de células cambiais de raízes tuberizadas e não-tuberizadas que possam estar associadas ao processo de tuberização. As sementes e raízes foram coletadas em área de Cerrado no Estado de São Paulo, Brasil, em duas épocas diferentes: em maio de 2008 (apenas sementes) e março de 2009 (sementes e raízes). Sementes e embriões de V. arenaria foram colocados para germinar, respectivamente, em papel filtro embebido com solução de nistatina e em meio de cultura sólido (MS com metade da concentração de macronutrientes), sendo mantidos em sala de crescimento (24°C e 16 horas/ luz) para avaliação do tempo e da porcentagem de germinação e embriões viáveis. No experimento de regeneração in vitro, folhas de plântulas, sete semanas após a germinação e segmentos hipocotiledonares, uma semana após a germinação, foram inoculados no mesmo meio, porém acrescido de diferentes concentrações de NAA (0,0; 0,01 e 0,05 mg.L-1), BAP (0,0; 0,2; 0,4 e 0,8 mg.L-1) e Zeatina (0,0; 0,2; 0,4 e 0,8 mg.L-1). Os explantes foram mantidos sob condições idênticas ao experimento de germinação. No estudo sobre imunolocalização de 5-metilcitosina, lâminas permanentes contendo cortes transversais de raízes tuberizadas e não-tuberizadas foram coradas com anticorpos fluorescentes contra 5-metilcitosina e contracoradas com DAPI. Foi observado um efeito de época de coleta de sementes, sendo aquela realizada em março de 2009 a que apresentou maiores porcentuais de embriões viáveis (72%) e de germinação de sementes e embriões (> 62% e 87%, respectivamente), embora o tempo de germinação tenha sido maior (~7 dias), comparativamente à coleta feita em maio de 2008 (~3 dias). Os experimentos de regeneração demonstraram certa recalcitrância da espécie na regeneração adventícia de brotos, pois os porcentuais de explantes com brotos foram inferiores a 25% na maioria dos tratamentos. Porém, houve 100% de formação de calos em diversos tratamentos. Por fim, verificaram-se mudanças no padrão de metilação e aumento de três vezes no conteúdo de DNA nas raízes tuberizadas relativamente às raízes não-tuberizadas. / Viguiera arenaria Baker is an herbaceous Asteraceae from Cerrado presenting alternate phyllotaxis, capitulum inflorescence and tuberized roots. Although phytochemical analyses have found substances with biological activities of therapeutic interest, little is known about the biology of the plant. In this study, we sought to contribute to the knowledge of aspects related to the development of V. arenaria, aiming to achieve three specific goals: to determine the germination rate under in vitro conditions; to establish a protocol for in vitro regeneration; to check epigenetic modifications (cytosine methylation) in DNA of cambial cells in tuberized and non-tuberized roots, which may be associated with the tuberization process. The seeds and roots were collected in a Cerrado area in the State of Sao Paulo, Brazil, in two different times: in May 2008 (seeds only) and March 2009 (seeds and roots). Seeds and embryos of V. arenaria were placed to germinate, respectively, on filter paper soaked with a solution of nystatin and solid medium (MS with half-strength macronutrients), and maintained in a growth chamber (24 ° C and 16 hours/ light) to evaluate time for germination and percentages of germination and viable embryos. In the experiment of in vitro regeneration, leaves of seedlings, seven weeks after germination and hypocotyl segments, one week after germination were inoculated in the same medium supplemented with different concentrations of NAA (0, 0.01 and 0.05 mg.L-1), BAP (0.0, 0.2, 0.4 and 0.8 mg.L-1) and Zeatin (0.0, 0.2, 0.4 and 0.8 mg.L-1). Explants were kept under the same conditions of the germination experiment. In the study of immunolocalization of 5- methylcytosine, permanent slides containing transverse sections of tuberized and non-tuberized roots were stained with fluorescent antibodies against 5-methylcytosine and counterstained with DAPI. We observed an effect of harvest time, as the one held in March 2009 presented the highest percentage of viable embryos (72%) and germination of seeds and embryos (> 62% and 87% respectively), although the germination rate was higher (~7 days) compared to the harvest made in 2008 (~3 days). The in vitro assays showed some recalcitrance of the species in the regeneration of adventitious buds, as the percentage of explants with shoots were less than 25% in most treatments. However, there was 100% callus formation in different treatments. Finally, changes in the methylation pattern were observed as well as three-fold increase in DNA content in tuberized roots relatively to non-tuberized roots.

Eucalyptus benthamii tem se mostrado especialmente vantajoso como alternativa ao cultivo em regiões frias, justificando esforços para o estabelecimento de protocolos para sua micropropagação. Porém, as matrizes são preferencialmente selecionadas quando adultas (material apresenta menor competência morfogênica), tornando a micropropagação dependente de maior número de subcultivos e maior tempo para se reverter o material ao rejuvenescimento. Assim, a redução das perdas in vitro tem merecido atenção, como por exemplo, as manifestações endofíticas, que exigem maximização da eficiência da cultura e adequações no protocolo, visando minimizá-las, possibilitando melhorar o entendimento das relações estabelecidas e mantidas entre os endófitos e seu hospedeiro durante a micropropagação. Dessa maneira, foram utilizadas minicepas provenientes de duas fontes de miniestacas coletadas a partir do brotamento de gemas epicórmicas de megaestacas da base da copa e de brotamentos do anelamento da base do tronco, de uma matriz de E. benthamii com 13 anos de idade, estabelecidas em minijardim clonal sob condição de casa de vegetação, com o objetivo de avaliar como se dá a multiplicação, sob diferentes condições de cultivo, das duas fontes de explantes (minicepas); analisar se a frequência e intensidade das manifestações endofíticas são afetadas pelas diferentes condições de cultivo; investigar a ocorrência de alterações na comunidade bacteriana endofítica devido à alteração das condições de cultivo e fase da micropropagação (in vivo = minicepas, e in vitro = microcepas, material alongado e enraizado). Visando atender estes objetivos, a pesquisa se dividiu em duas partes. Na primeira (capitulo 3) o desenvolvimento, os aspectos morfofisiológicos, histoquímicos e a manifestação endofítica foram avaliados na multiplicação das duas fontes de explante sob diferentes meios e condições de cultivo. Na segunda (capítulo 4) as comunidades bacterianas endofíticas foram analisadas por meio de PCR-DGGE, baseada na região V6 do gene 16S DNAr. Os resultados mostraram que as microcepas provenientes de megaestaca tiveram melhor desenvolvimento independentemente do tratamento e maior frequência de manifestações endofíticas, comparando-se com as de anelamento. As comunidades bacterinas endofíticas foram distintas entre as amostras in vivo e in vitro, e se alteraram ao longo dos subcultivos e nas amostras alongadas e enraizadas. As diferenças existentes no desenvolvimento das microcepas podem ser inerentes à totipotencialidade do material, mas também podem ser afetadas, tanto pela ocorrência de manifestação, quanto pela comunidade bacteriana endofítica mais ou menos sensível ao processo de micropropagação, auxiliando ou prejudicando o desenvolvimento in vitro de seus hospedeiros. Cabe destacar, ainda, que mesmo em um sistema asséptico e ambientalmente controlado, os microrganismos endofíticos que resistiram a todo processo de desinfestação e cultivo, não estão \"adormecidos\", muito pelo contrário podem se alterar em quantidade à medida que seu hospedeiro é submetido a um novo sistema de cultivo (introdução) ou uma nova fase dentro da micropropagação (multiplicação → alongamento e enraizamnento) ou, ainda, ao longo dos subcultivos. Sendo assim, a complexa rede de relações das plantas com seus endófitos não cessa durante o cultivo in vitro, ao contrário mantém-se dinâmica. / Eucalyptus benthamii has proven to be especially advantageous as an alternative culture in cold regions, justifying efforts to establish protocols for micropropagation. However, the matrices are preferably selected when adults (material with lower morphogenic efficiency), making micropropagation more dependent of subcultures and too longer to reverse the material to rejuvenation. Thus, reduction of losses in vitro has deserved attention, such for example the endophytic manifestations that require the maximization of efficiency culture and adjustments to the Protocol, in order to minimize them, enabling better understanding of the relations established and maintained between endophytes and its host along micropropagation. For this, mini-stumps were used from two sources of mini-cuttings collected from the epicormic shoots of mega-cuttings from the treetop base and shoots from girdling from the trunk base, both of one E. benthamii matrix with 13 years of age established in clonal mini garden under greenhouse condition, aimed to evaluate how is the multiplication of two sources of explants (mini-stumps) under different growing conditions; analyze how the endophytic manifestations frequency and intensity are affected by different conditions; investigate the changes to occurrence in the endophytic bacterial community due to the variation of culture conditions and micropropagation phase (in vivo = mini-stumps, and in vitro = micro-stumps, elongated and rooted materials). In order to meet these objectives, the research was divided in two parts. In the first (chapter 3) the development, morphophysiological aspects, histochemical and endophytic manifestation were evaluated in the multiplication of the two explants sources from different media and culture conditions. In the second (chapter 4) endophytic bacterial communities were analyzed by PCR-DGGE based on the V6 region of 16S rDNA gene. The results showed that micro-stumps from mega-cuttings had better development regardless of treatment and increased frequency of endophytic events, comparing with the girdling. Endophytic bacterial communities were different between samples in vivo and in vitro, and have changed over the subcultures and the elongated and rooted samples. The differences in the development of micro-stumps can be explained by the totipotentiality inherent to the material, but may also be affected by both the manifestation occurrence and the endophytic bacterial community more or less sensitive to the micropropagation, helping or harming the in vitro development of their hosts. We also highlight that even in an aseptic and environmentally controlled system, the endophytic microorganisms that resisted the whole process of disinfection and cultivation, are not \"asleep\", quite the opposite may change in quantity when your host is subjected to a new cultivation system (in vitro establishment) and a new phase within the micropropagation (multiplication → stretching and enraizamnento), or even along the subcultures. This way, the complex network of relationships of the plant with their endophyte does not cease during the in vitro culture, unlike remains dynamic.

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No. of bitstreams: 1 cristianoferraraderesende.pdf: 2182147 bytes, checksum: a1f62e02cb7c97296c57ea6461357835 (MD5) Previous issue date: 2012-03-05 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Bromeliaceae é uma família essencialmente neotropical, cujos representantes são muito utilizados para fins paisagísticos. Uma das principais fontes de abastecimento do mercado consumidor de bromélias é o extrativismo o que, associado à destruição do ambiente natural, tem levado a perdas irreparáveis na biodiversidade da família, especialmente na Mata Atlântica, onde cerca de 40% das espécies encontram-se sob alguma categoria de ameaça. Pitcairnia encholirioides L. B. Sm. é uma espécie “criticamente em perigo” de extinção, sendo conhecida somente uma população dessa espécie, com cerca de 900 indivíduos, encontrada em 2004 em um afloramento rochoso muito degradado e sujeito ao fogo e ao pisoteio de animais, no município de Santa Maria Madalena, RJ. A utilização das técnicas de micropropagação pode reverter os riscos de extinção garantindo taxas elevadas de multiplicação, fornecendo material necessário ao mercado consumidor, evitando, dessa forma, o extrativismo das plantas nos seus locais de origem. A instalação e a conservação in vitro de bancos de germoplasma possuem especial importância, garantindo a sobrevivência de espécies raras e/ou endêmicas e fornecendo plantas para iniciativas de reintrodução. A etapa final da micropropagação é a aclimatização ex vitro, realizada após os procedimentos de multiplicação e enraizamento in vitro. A aclimatização é um período crítico para as plantas devido à perda de água, o que causa estresse hídrico e, como consequência, estresse oxidativo, podendo provocar problemas metabólicos e perdas elevadas. No presente trabalho, Pitcairnia encholirioides foi cultivada in vitro por 150 dias em meio de cultura adicionado de dois reguladores de crescimento (GA3 ou ANA), além de duas concentrações de sacarose (15 ou 30 g L-1) e sob dois tipos de vedação dos tubos de ensaio (vedação hermética com tampas e filme de PVC ou vedação com tampas que permitiam trocas gasosas), totalizando 8 tratamentos, período após o qual as plantas foram transferidas para condições ex vitro, em casa de vegetação, permanecendo por mais 180 dias. Dois desses tratamentos foram selecionados para as análises de desidratação, quando suas plantas foram submetidas a 30, 42 ou 54 dias sem irrigação, além do controle irrigado periodicamente, sendo posteriormente reidratadas durante 90 dias. Após os períodos de cultivo in vitro e permanência das plantas em casa de vegetação, foram realizadas análises dos conteúdos de prolina, proteínas totais, atividades das enzimas do metabolismo antioxidativo SOD, CAT, POD e PPO, além 2 dos teores de pigmentos fotossintetizantes. Além desses parâmetros, após desidratação e reidratação foram também avaliados os teores de carboidratos. De maneira geral, o cultivo in vitro em meio adicionado da menor concentração de sacarose e em tubos vedados hermeticamente se mostrou prejudicial, o que foi evidenciado pelo menor acúmulo de prolina, aumentos nas atividades das enzimas antioxidativas e menor acúmulo de pigmentos fotossintéticos. Após o período de aclimatização, não foram encontradas diferenças entre os tratamentos para a maioria dos parâmetros analisados, ou os dados oscilaram de maneira a não permitir uma generalização quanto aos efeitos residuais da sacarose, do tipo de tampa e dos reguladores de crescimento utilizados durante o cultivo in vitro. No período em que as plantas foram submetidas à desidratação progressiva, houve maior acúmulo de prolina e proteínas solúveis totais, além de aumento nos teores de pigmentos fotossintéticos nos tecidos provenientes de plantas cultivadas in vitro em meio contendo 30 g L-1 de sacarose e GA3. Houve também, em geral, queda mais acentuada nas atividades das enzimas em meio suplementado com a menor concentração de sacarose e ANA, além de oscilações nos teores de pigmentos. As relações entre os pigmentos sofreram leve redução em ambos os tratamentos, e os teores de carboidratos solúveis totais, sacarose, açúcares redutores e amido aumentaram com o prolongamento do estresse. Após a reidratação, todas as plantas demonstraram elevada capacidade de recuperação, apresentando em todas as análises realizadas valores muito similares aos das plantas do controle, não submetidas à desidratação. Os resultados obtidos no trabalho permitem concluir que o cultivo in vitro em meio adicionado de 30 g L-1 de sacarose e em tubos de ensaio que permitem trocas gasosas é o mais apropriado para plantas de P. encholirioides. Ademais, a concentração de sacarose adicionada ao meio de cultura também influencia o desenvolvimento das plantas após aclimatização, sendo encontrados melhores resultados em plantas cultivadas nos meios de cultura suplementados com a maior concentração desse carboidrato. Acredita-se que as plantas cultivadas nessas condições apresentariam maior capacidade de sobrevivência ao transplantio e maior resistência a períodos prolongados de estresse hídrico, aos quais, frequentemente, estão submetidas no ambiente natural. / Bromeliaceae is essentially a neotropical family, whose representatives are widely used for landscaping. One major source of supply for the consumer market is the extraction, which coupled with the destruction of the natural environment, has led to irreparable losses in biodiversity of the family, especially in the Atlantic Forest, where about 40% of bromeliad species are under some category of threat. Pitcairnia encholirioides L. B. Sm. is a critically endangered species. In 2004, a unique population of this species was found, with about 900 individuals in a very degraded rocky outcrop, subject to fire and trampling by animals, located in Santa Maria Madalena, RJ. The use of micropropagation can guarantee high multiplication rates, providing necessary material for the consumer market, effectively obviating the extraction of plants in their places of origin. In addition, installation and in vitro conservation of germplasm banks have special importance, ensuring the survival of rare species and/or endemic and providing micropropagated plants for reintroduction initiatives. Following the procedures of in vitro multiplication and rooting, the final stage of micropropagation is the ex vitro acclimatization, a critical period for the plants due to water loss, which causes water stress and, consequently, oxidative stress, which can cause metabolic problems and high losses. In this study, Pitcairnia encholirioides was grown for 150 days in vitro in a culture medium supplemented with two growth regulators (GA3 or NAA), and two concentrations of sucrose (15 or 30 g L-1) in two types of sealing of test tubes (hermetic seal with lids and PVC film and seal with lids that allowed gas exchange), totaling eight treatments, after which the plants were transferred to ex vitro conditions in a greenhouse, staying for more than 180 days. Two of these treatments were selected for analysis of dehydration when their plants were subjected to 30, 42 or 54 days without irrigation, apart from control irrigated periodically, being subsequently rehydrated for 90 days. After periods of in vitro cultivation and maintenance of the plants in the greenhouse, they were analyzed for proline content, total protein, activities of antioxidant metabolism enzymes SOD, CAT, POD and PPO, besides the content of photosynthetic pigments. Apart from these parameters, after dehydration and rehydration, levels of carbohydrates were also assessed. In general, the in vitro culture in medium containing the lowest concentration of sucrose and hermetically sealed tubes proved to be harmful, which was evidenced by lower levels of proline, increased 4 activity of antioxidant enzymes and lower accumulation of photosynthetic pigments. After the acclimatization period, no differences were found between treatments for most parameters, or data varied so as to not allow a generalization about the residual effects of sucrose, the type of cover and of the growth regulators used in the in vitro cultivation. During the period in which the plants were subjected to water stress, higher accumulation of proline and total soluble proteins occurred, and also increased levels of photosynthetic pigments in tissues from plants grown in vitro in medium containing 30 g L-1 sucrose and GA3. There was also, in general, sharper decrease in enzyme activity in medium with the lowest concentration of sucrose and NAA, as well as fluctuations in pigment. Relations between pigments suffered slight reduction in both treatments, and total soluble carbohydrates, sucrose, reducing sugars and starch increased with increasing stress. After rehydration, all plants showed high resilience, presenting for all analyzes values very similar to those of control plants not subjected to dehydration. The results indicate that the in vitro culture in medium supplemented with 30 g L-1 sucrose and tubes that allow gas exchange are the most appropriate. Moreover, the concentration of sucrose added to the culture medium also influences the development of plants after acclimatization, with best results found in plants grown in media supplemented with higher amount of this carbohydrate. It is believed that plants grown under these conditions would have higher capacity of resistance to transplanting and could survive for prolonged periods of water stress, which are often subjected in the natural environment.