Made available in DSpace on 2014-08-20T13:59:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_clarissa_borges.pdf: 436353 bytes, checksum: cba9f3b4393e08d9df227be30ebf2887 (MD5) Previous issue date: 2010-11-23 / The carqueja-gaucha is an endemic species of Rio Grande do Sul, poorly explored and needs further research in micropropagation. In recent years, increased interest in using the technique of micropropagation of medicinal and aromatic plants, which provides a large-scale production. The objective was to evaluate the effect of different concentrations of sucrose, salts of MS medium, nitrogen and different growth regulators on in vitro cultivation of gorse. The explants were nodal segments with two axillary buds from plants already established in vitro. In the 1st experiment were tested with different concentrations of sucrose in MS medium (1% 3% 5% and 7%). In the 2nd experiment tested whether variations in concentrations of salts (macro and micronutrients) of the MS (MS / 3, MS / 2, MS; 2MS). In the 3rd experiment tested changes in the concentrations of nitrogen (N, N / 2 N / 3 N / 4) in MS medium. In the 4th experiment evaluated different concentrations (BAP): M1 (MS), M2 (MS +0 +0.05 GA3 BAP), M3 (MS +0.10 +0.05 GA3 BAP), M4 (MS + BAP +0.30 GA3 0.05 mg L-1). The pH was adjusted to 5.8 before adding agar at a concentration of 8 g L-1 and subsequently autoclaved at 121 º C for 20 minutes. The experimental design was completely randomized design with four replicates of five explants per flask. We evaluated the numbers of leaves, shoots and roots and callus formed at 15 and 30 days of cultivation. In a second experiment, one can observe a greater number of leaves in a medium containing 5% sucrose and within 30 days. But the basic MS medium with normal concentration of sucrose 3% showed a lower number of leaves at 30 days of cultivation. The highest number of shoots was observed in medium with 1% sucrose for 30 days. With increasing concentration decrease in the production of shoots. In the 2nd experiment, it was found that the number of leaves was stimulated by increasing the salt concentration of MS medium, media containing 100% and 200% of the MS culture medium, can also be observed an increase in root presence over time and not for the variations of salts in MS medium. In the 3rd experiment leaf number was greater in medium containing the lowest concentration of nitrogen and over time there was an increase in their number, the number of shoots was lower in the usual concentration of nitrogen and 30 days was an increase of shoots. In the 4th experiment all doses tested BAP promoted an increase in shoots of carqueja-gaucha and 30 days showed a higher number of shoots. In the medium with growth regulators had an increase in the production of callus at the base of the explant with increasing time in culture. / A carqueja-gaúcha é uma espécie endêmica do Rio Grande do Sul pouco explorada e carece de pesquisas na área de micropropagação. Nos últimos anos, aumentou o interesse da utilização da técnica de micropropagação em plantas aromáticas e medicinais, o que proporciona uma produção em larga escala. O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de: sacarose, sais do meio MS, nitrogênio e diferentes reguladores de crescimento no cultivo in vitro de carqueja. Como explantes foram utilizados segmentos nodais com duas gemas axilares, oriundos de plantas já estabelecidas in vitro. No 1º experimento foram testadas as diferentes concentrações de sacarose no meio MS (1%, 3% 5% e 7%). No 2º experimento testou-se as variações das concentrações de sais (macro e micronutrientes) do meio MS (MS/3; MS/2; MS; 2MS). No 3º experimento foram testadas variações nas concentrações de nitrogênio (N, N/2, N/3, N/4) no meio MS. No 4ª experimento foram avaliadas diferentes concentrações de BAP (Benzilaminopurina): M1 (MS); M2 (MS+0BAP+0,05GA3);M3(MS+0,10BAP+0,05GA3); M4 (MS+0,30BAP+0,05GA3 mg L-1). O pH foi ajustado para 5,8 antes da adição do ágar na concentração de 8 g L-1 e posteriormente autoclavado a 121 ºC por 20 minutos. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro repetições de cinco explantes por frasco. Foram avaliados os números de folhas, brotos e calos e raízes formadas aos 15 e 30 dias de cultivo. No 1º experimento, pode-se observar um maior número de folhas no meio contendo 5% de sacarose, no período de 30 dias. Já o meio MS básico com concentração usual de sacarose 3% apresentou um menor número de folhas aos 30 dias de cultivo. O maior número de brotos foi observado no meio com 1% de sacarose aos 30 dias. Com o aumento da concentração houve decréscimo na produção de brotos. No 2º experimento, verificou-se que o número de folhas foi estimulado pelo aumento da concentração de sais do meio MS, nos meios contendo 100% e 200% dos sais do meio MS; também pode-se observar um aumento da presença de raízes com o passar do tempo e não em relação às variações de sais no meio MS. No 3º experimento, o número de folhas foi maior no meio contendo a menor concentração de nitrogênio e, com o passar do tempo, houve um aumento de número das mesmas, o número de brotações foi menor na concentração usual de nitrogênio e aos 30 dias observou-se aumento de brotações. No 4º experimento, todas as doses de BAP testadas promoveram um aumento de brotações de carqueja-gaúcha e aos 30 dias apresentou um maior número de brotações. Nos meios com presença de reguladores de crescimento houve um aumento na produção de calos na base do explante com o aumento do tempo em cultivo.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:22:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Georgea_Soares_Figueiredo.pdf: 728913 bytes, checksum: b001e52b25d78faa26942f0b6de87631 (MD5) Previous issue date: 2009-03-06 / The Japanese quince (Chaenomeles sinensis Koehne) can be used as rootstocks for quince, pear, loquat trees and as cultivar canopy. The use of quince by seeds, as rootstocks for other quince species and cultivars, has been shown viable. However, the inconvenient in the sexual reproduction is obtaining of not uniform seedlings, since it is not desired in the commercial plantations establishment due gene segregation. The seedlings production technology for Japanese quince by vegetative propagation is not defined, due low percentage of rooting. Thus, the tissue culture presents as a viable alternative in the clonal orchards development or seedlings commercial production. Experiments were performed to determine a protocol of in vitro establishment this specie, where was tested the disinfectant with chlorine appropriate for vegetal material, as well as cytokinin, flask cover, salt concentration of culture medium, culture medium, BAP cytokinin concentration and light quality. It could be conclude that calcium hypochlorite disinfectant is effective in the explants disinfestations, and the BAP provides better results in the establishment than 2iP and Zea cytokinins. Sealed flasks with cotton instead aluminum, reduce the explant oxidation and the original salt concentration of MS medium promotes better explant establishment. The WPM medium showed higher results than MS medium and BAP at 1mg.L-1 or 2mg.L-1 concentration promotes an increase in the number and length of sprouting, as well as the use of red light instead white and green light. / O marmeleiro japonês Chaenomeles sinensis Koehne pode ser utilizado como porta-enxerto para marmeleiros, pereiras, nespereiras e também como cultivar copa. O uso deste marmeleiro via seminífera, como porta-enxerto para outras espécies e cultivares de marmelo, tem se mostrado viável, o inconveniente na reprodução sexual é a obtenção de plântulas desuniformes, o que não é desejado no estabelecimento de plantios comerciais, devido à segregação gênica. A tecnologia de produção de mudas para o marmeleiro Japonês por propagação vegetativa não está ainda definida, devido a baixa porcentagem de enraizamento, sendo assim a cultura de tecidos apresenta-se como uma alternativa viável na formação de pomares clonais ou produção comercial de mudas. Foram realizados experimentos a fim de determinar um protocolo de estabelecimento in vitro desta espécie, onde foi testado o desinfestante a base de cloro adequado a desinfestação do material vegetal, bem como o a citocinina, tipo de vedação dos frascos, concentração salina do meio de cultura, meio de cultura, concentração da citocinina BAP e qualidade de luz. A partir dos resultados obtidos pode-se concluir que o desinfestante hipoclorito de cálcio é eficiente na desinfestação dos explantes, e a citocinina BAP promove melhores resultados no estabelecimento, comparada as citocininas 2iP e Zea. Frascos vedados com algodão, ao invés de alumínio, reduzem a oxidação dos explantes e o meio MS na sua concentração salina original promoveu melhor estabelecimento dos explantes. O meio WPM demonstrou resultados superiores ao meio MS e a citocinina BAP na concentração de 1mg.L-1 ou 2mg.L-1 promove aumento no número e comprimento das brotações, assim como a utilização de luz vermelha quando comparada a luz branca e a luz verde.

Petróleo Brasileiro S/A / Heart of palm (Euterpe edulis Martius) is a characteristic species of Atlantic Forest. Presently, natural populations are being drastically reduced due to human action. This system of exploitation resulted in substantial genetic erosion in the populations and did not permitted the maintenance of the demographic structure through natural regeneration. The only way of heart of palm propagation was through seeds that do not tolerate storage for a long time. Then, the development of strategies for germplasm conservation has become necessary. Heart of palm does not present a natural system of vegetative propagation, then the technique of culture of tissues showed to be adequated for the conservation and multiplication of germplasm in large scale. The information of geographic distribution of genetic resources is fundamental in the formulation of strategies of in situ conservation and also to help in the collection of vegetal material and to establish ex situ germplasm banks. The main goal of this study was to elucidate some aspects of somatic embryogenesis and analyze the in vitro germination of immature zygotic embryos of heart of palm, aiming the ex situ conservation of germplasm of this species. In the first study, zygotic embryos and leaf sheaths were the explant sources. Zygotic embryos were inoculated in MS culture medium (MURASHIGE and SKOOG, 1962) supplemented with Morel vitamins (MOREL and WETMORE, 1951) 2,4-D (0, 30, 35, 40 mg.L-1), 3 mg.L-1 of 2iP, 0.5 g.L-1 of glutamine, 0.5 g.L-1 of activated charcoal, 30 g.L-1 of glucose and 5 mg.L-1. The delineate used in this study was in Random Blocks, in that the treatments consisted of four concentrations of 2,4-D, combined with two sources of carbohydrate in factorial scheme (4x2), in six repetitions. Each parcel was constituted by two test tubes, each one with one embryo. Leaf sheaths extracted of in vitro germinated plants were inoculated in MS medium supplemented with Picloram (72.3 mg.L-1) or 2,4-D (66.3 mg.L-1), 3 mg.L-1 of 2iP, glutamine (0; 0.29; 0.58; 1.17 g.L-1), 1.5 g.L-1 de activated charcoal and 2.5 g.L-1 of Phytagel. The delineate was in Random Blocks with eight treatments and three repetitions. Each parcel was constituted by three Petri plates in ten transversal sections of leaf sheaths. Indirect somatic embryos were induced from zygotic embryos in a medium supplemented with 40 mg.L-1 of 2,4-D and 30 g.L-1 of sucrose. It was verified a high formation of leaf sheaths by using MS medium supplemented with 1.17 g.L-1 of glutamine and 66.3 mg.L-1 of 2,4-D. In the second study, the objective was to elucidate the influence of saline concentration and of sucrose in the culture medium during the germination of zygotic embryos and to study the influence of the addition of different concentration of Calcium chloride to the MS medium of culture in the induction of somatic embryogenesis from immature zygotic embryos of E. edulis. The evaluation of germination in vitro of zygotic embryos of E. edulis occurred through the inoculation in medium of culture added by Morel vitamins, 7 g.L-1 of agar and 1.5 g.L-1 of activated charcoal. The treatments were different concentrations of the mediums MS (MS and MS/2) combined with different concentrations of sucrose (20, 30 and 40 g.L-1). It was used the Random Blocks Delineate, with six repetitions, each one constituted by five test tubes with one embryo per tube. For the induction of somatic embryogenesis, immature zygotic embryos were extracted and inoculated in a culture medium MS supplemented with Morel Vitamins, 7 g.L-1 of agar, 0.5 g.L-1 of glutamine, 3 mg.L-1 of 2iP, 100 mg.L-1 of 2,4-D and 1.5 g.L-1 of activated charcoal and different concentrations of calcium chloride (0, 2, 4, 8, 12 mM). It was used the statistical delineate in Random Blocks with six repetitions. Each parcel was constituted by one flask containing four immature zygotic embryos. For the conversion of the somatic embryos in seedlings it was used the complete medium of culture MS and the medium with the half of original saline concentration (MS/2). It was verified that the concentration was not affected by the saline concentration of the medium culture and of sucrose. But the growing in height and the production of fresh mass of the seedlings were affected by the treatments. The increasing of concentration of sucrose of 20 to 40 g.L-1 in the medium culture resulted in an increasing in the fresh mass of the seedlings. The composition of the different mediums of culture did not influence the mean number of roots per seedling of heart of palm. The induction of somatic embryogenesis in immature zygotic embryos was not significantly influenced by the addition of different concentrations of calcium chloride to the medium, after 60 days. But, they were observed significant differences among the concentrations of Calcium chloride for the number of somatic embryos formed, after 150 days. The increasing on the concentration of Calcium chloride in the medium of culture resulted in a decrease in the mean number of somatic embryos produced per experimental unit. Both medium MS and MS/2 did not differ significantly in the capacity of germination of the somatic embryos. The process of induction of somatic embryogenesis in the immature zygotic embryos of E. edulis occurred directly from the cotyledonary node of the embryo. The present study evidenced that the supplementation of the medium of culture (MS or MS/2) with sucrose (30 or 40 g.L-1) was necessary for the growing of the seedlings of heart of palm originated from immature zygotic embryos. The results confirmed the possibility to propagate the palm E. edulis through direct somatic embryogenesis, because they were produced complete seedlings, and the importance of supplementation of the medium of culture with a source of organic nitrogen in the in vitro morphogenesis of leaf sheaths of heart of palm. / O palmiteiro (Euterpe edulis Mart.), uma espécie característica da Mata Atlântica, foi drasticamente reduzido, devido à ação antrópica em diversas populações. A exploração indiscriminada resultou em erosão genética nas populações, não permitindo mais a manutenção da estrutura demográfica, através da regeneração natural. A única forma de propagação do palmiteiro é através de produção de sementes, as quais não toleraram armazenamento por longos períodos. Desta maneira, o desenvolvimento de estratégias para a conservação de germoplasma tornou-se necessário. Como o palmiteiro não apresenta um sistema de propagação vegetativa natural, a técnica de cultura de tecidos mostrou-se adequada tanto para a conservação, quanto para a multiplicação em larga escala de germoplasma. A informação da distribuição geográfica dos recursos genéticos tem sido fundamental na formulação de estratégias de conservação in situ, bem como no auxílio para a coleta de material vegetal e estabelecimento de bancos de germoplasma ex situ. O objetivo geral do presente estudo foi elucidar alguns aspectos da embriogênese somática, e analisar a germinação in vitro de embriões zigóticos imaturos de palmiteiro, visando à conservação ex situ de germoplasma de palmiteiro. No primeiro estudo, embriões zigóticos e bainhas foliares serviram como fonte de explantes. Embriões zigóticos foram inoculados em meio MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962), suplementado com as vitaminas de Morel (MOREL e WETMORE, 1951), 2,4-D (0, 30, 35, 40 mg.L-1), 3 mg.L-1 de 2iP, 0,5 g.L-1 de glutamina, 0,5 g.L-1 de carvão ativado, 30 g.L-1 de glicose ou sacarose e, geleificado com 5 g.L-1 de ágar. O delineamento experimental foi em Blocos ao acaso, em que os tratamentos constaram de quatro concentrações de 2,4-D, combinados com duas fontes de carboidrato em esquema fatorial (4x2), em 6 repetições. Cada parcela foi constituída por dois tubos de ensaio, com um embrião cada. Bainhas foliares, extraídas de plântulas germinadas in vitro, foram inoculadas em meio MS, suplementado com Picloram (72,3 mg.L-1) ou 2,4-D (66,3 mg.L-1), 3 mg.L-1 de 2iP, glutamina (0; 0,29; 0,58; 1,17 g.L-1), 1,5 g.L-1 de carvão ativado, sendo geleificado com 2,5 g.L-1 de Phytagel. O delineamento foi em Blocos ao acaso, com 8 tratamentos, em 3 repetições. Cada parcela foi constituída por três placas de Petri, com 10 secções transversais das bainhas foliares. Embriões somáticos indiretos foram induzidos a partir de embriões zigóticos, em meio suplementado com 40 mg.L-1 de 2,4-D e 30 g.L-1 de sacarose. Verificou-se elevada formação de calos em bainhas foliares, utilizando o meio MS suplementado com 1,17 g.L-1 de glutamina e 66,3 mg.L-1 de 2,4-D. No segundo estudo, o objetivo foi elucidar a influência da concentração salina e da sacarose no meio de cultura, durante a germinação de embriões zigóticos, e estudar a influência da adição de diferentes concentrações de Cloreto de cálcio ao meio de cultura MS, na indução de embriogênese somática, em embriões zigóticos imaturos de E. edulis. A avaliação da germinação in vitro de embriões zigóticos de E. edulis ocorreu através da inoculação, em meio de cultura adicionado das vitaminas de Morel, 7 g.L-1 de ágar e 1,5 g.L-1 de carvão ativado. Os tratamentos foram diferentes concentrações do meio MS (MS e MS/2), combinados com diferentes concentrações de sacarose (20, 30 e 40 g.L-1). Foi utilizado o delineamento em Blocos ao acaso, em 6 repetições, cada repetição foi constituída por cinco tubos de ensaio, contendo um embrião cada. Para a indução de embriogênese somática, embriões zigóticos imaturos foram extraídos e inoculados em meio de cultura MS, suplementado com as vitaminas de Morel, 7 g.L-1 de ágar, 0,5 g.L-1 de glutamina, 3 mg.L-1 de 2iP, 100 mg.L-1 de 2,4-D e 1,5 g.L-1 de carvão ativado, além de diferentes concentrações de Cloreto de cálcio (0, 2, 4, 8, 12 mM). Utilizou-se o delineamento estatístico em Blocos ao acaso, em 6 repetições. Cada parcela foi constituída por um frasco, contendo quatro embriões zigóticos imaturos. Para a conversão dos embriões somáticos em plântulas, foram empregados o meio de cultura MS completo, e o com a metade da concentração salina original (MS/2). Verificou-se que a germinação de embriões zigóticos de palmiteiro não foi afetada pela concentração salina do meio de cultura e de sacarose. Entretanto, o crescimento em altura e a produção de massa fresca das plântulas foram afetados pelos tratamentos. O aumento da concentração de sacarose, de 20 para 40 g.L-1, no meio de cultura, resultou em acréscimo na massa fresca das plântulas. A composição dos diferentes meios de cultura não influenciou o número médio de raízes por plântula de palmiteiro. A indução de embriogênese somática em embriões zigóticos imaturos de E. edulis não foi influenciada significativamente pela adição de diferentes concentrações de Cloreto de cálcio ao meio de cultura, aos 60 dias. Entretanto, foram observadas diferenças significativas entre as diversas concentrações de Cloreto de cálcio, quanto ao número de embriões somáticos formados, aos 150 dias. O aumento na concentração de Cloreto de cálcio, no meio de cultura, resultou em decréscimo no número médio de embriões somáticos de palmiteiro produzidos. Os meios de cultura MS e MS/2 não diferiram significativamente, quanto à capacidade de germinação dos embriões somáticos. O processo de indução de embriogênese somática, em embriões zigóticos imaturos de E. edulis, ocorreu diretamente a partir do nó cotiledonar. O presente estudo evidenciou que a suplementação do meio de cultura (MS ou MS/2) com sacarose (30 ou 40 g.L-1) foi necessária para o desenvolvimento das plântulas de palmiteiro, oriundas de embriões zigóticos imaturos. Resultados confirmaram a possibilidade de propagar a palmeira E. edulis através da embriogênese somática direta, pois foram produzidas plântulas completas, além de demonstrarem a importância da suplementação do meio de cultura com uma fonte de nitrogênio orgânico, na morfogênese in vitro de bainhas foliares de palmiteiro.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-12-21T12:08:18Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1034429 bytes, checksum: c649dc0d520356bc851d2a030e314910 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-21T12:08:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1034429 bytes, checksum: c649dc0d520356bc851d2a030e314910 (MD5) Previous issue date: 2003-06-09 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O presente trabalho objetivou avaliar o desempenho silvicultural de clones de Eucalyptus spp., propagados pela estaquia, miniestaquia, microestaquia e micropropagação quanto às características de crescimento em altura e diâmetro a altura do peito (dap), bem como a biomassa da parte aérea em condições de campo, em locais distintos, avaliados aos 4, 8, 16 e 24 meses de idade. Os estudos realizados na região do Vale do Rio Doce (Cenibra), de forma geral, para os 4 clones de Eucalyptus grandis avaliados, permitiram concluir que na fase inicial do teste clonal, houve um melhor desempenho das técnicas de micropropagação e microestaquia em relação a miniestaquia e estaquia para as características avaliadas. No entanto, para alguns clones, a miniestaquia mostrou resultados similares a micropropagação e microestaquia e com ligeira superioridade à estaquia. Por outro lado, de modo geral, evidenciou-se a uniformização dos resultados entre as técnicas de propagação clonal para as características avaliadas aos 24 meses de idade do teste clonal. Com relação aos estudos realizados no Norte de Minas Gerais (V & M Florestal), em dois locais distintos, os resultados obtidos permitiram concluir que os efeitos das técnicas de propagação não resultaram em diferenças significativas em altura e dap, nas idades avaliadas, para os clones estudados. Em relação à biomassa da parte aérea, para ambos os locais avaliados, os resultados obtidos não indicaram uma tendência sobre possíveis efeitos das técnicas de propagação em relação ao comportamento silvicultural dos clones. / The objective of the present study was to evaluate the Eucalyptus spp. clones silvicultural performance, propagated by the cutting, minicutting, microcutting and micropropagation techniques concerning the height and diameter growth characteristics, as well as the aerial biomass in field conditions, in distinct places, evaluated at 4, 8, 16 and 24 months old. The studies carried out in the Vale do Rio Doce region (Cenibra), in a general way, for the four Eucalyptus grandis clones evaluated, permitted to conclude that in the initial phase of the cloning test, there was a better performance of the micropropagation and microcutting techniques in relation to the minicutting and cutting for the evaluated characteristics. However, for some clones, the minicutting showed similar results to the micropropagation and microcutting techniques, and with a slight superiority to the cutting. On the other hand, in a general way, the uniformity of the results among the cloning propagation techniques for the evaluated characteristics at 24 months old was evidenced. Concerning the studies carried out in the North of Minas Gerais State (V & M Florestal), in two distinct places, the obtained results permitted conclude that the propagation techniques effects did not result in significant differences in height and diameter growth, in the evaluated ages, for the studied clones. In relation to the aerial biomass, the obtained results did not indicate a tendency about possible effects of the propagation techniques in relation to the clones silvicultural performance. / Não foi localizado o cpf do autor.

A cultura de tecidos tem sido uma importante ferramenta amplamente utilizada para diversas finalidades, dentre elas a micropropagação tem merecido destaque devido à rápida produção de mudas saudáveis num espaço físico reduzido. Dentro deste contexto, o termo, plantas axênicas, tem sido difundido como um ideal a ser atingido nesta técnica, havendo a busca cada vez maior de métodos que eliminem de forma eficaz toda e qualquer contaminação que possa, eventualmente, crescer no meio de cultura. No entanto, cada vez mais se observa que a concepção de contaminação dentro da cultura de tecidos deve ser revista, assim como a de planta axênica, pois inúmeros trabalhos têm mostrado, que mesmo em microplantas assintomáticas consideradas axênicas, existe uma comunidade endofítica onipresente e que na sua grande maioria desempenha papel fundamental no estabelecimento, desenvolvimento e aclimatização das culturas, sendo, portanto, microrganismos benéficos que devem ser conservados no cultivo in vitro. Dessa forma, o presente trabalho teve como principal objetivo investigar a microbiota endofítica presente em diversas espécies de microplantas assintomáticas consideradas axênicas, independente de seu protocolo de cultivo in vitro, local, método de micropropagação e manipulação. Para tal, foram utilizadas microplantas assintomáticas, em fase de multiplicação por mais de um ano, provenientes de três laboratórios diferentes, submetidas à caracterização por meio de testes histoquímicos, à análises ultraestruturais, a isolamento em diferentes meios de cultura por dois métodos (trituração e fragmentação), à análises moleculares utilizando a extração do DNA genômico total e PCR-DGGE, além da extração e sequenciamento do DNA dos isolados obtidos. Os resultados obtidos pelo isolamento, testes moleculares e análises ultraestruturais, evidenciaram a presença de uma comunidade endofítica, colonizando os tecidos de diferentes espécies de microplantas, provenientes de três laboratórios distintos. Dessa forma, conclui-se que a inexistência de plantas axênicas deve ser considerada, futuramente, como um aspecto positivo dentro da cultura de tecidos, uma vez que, essa comunidade endofítica pode atribuir características de interesse agronômico às diferentes espécies vegetais. / Tissue culture has been an important tool widely used for various purposes, among them the micropropagation has been highlighted due to the rapid production of healthy seedlings in a small space. Within this context, the term axenic plant has been distributed as an ideal to be achieved in this technique, which the search based on numerous methods that effectively eliminate any contamination that may eventually grow into the culture medium. However, it is seen that the conception of contamination in tissue culture should be reviewed as well as axenic plants, because several studies have shown that even in asymptomatic microplants considered axenic, there is an ubiquitous and that the endophytic community mostly plays a fundamental role in the establishment, development and acclimatization of cultures, therefore, beneficial microorganisms that should be preserved in vitro. Thus, this study aimed to investigate the endophytic microbiota present in several species of micro asymptomatic considered \"axenic\" regardless of their protocol for in vitro culture, location, method of micropropagation and manipulation. For this purpose, were used asymptomatic microplants in multiplication stage by more than one year, from three different laboratories, and were submitted to characterization by histochemistry tests, ultrastructural analysis, isolation in different culture medium by two methods (grinding and fragmentation), molecular analyses using the extraction of total genomic DNA and PCR-DGGE, in addition to extracting and sequencing the DNA of the isolates obtained. The results obtained by the isolation, molecular and ultrastructural analysis, showed the presence of an endophytic community colonizing the tissues of different species of microplants, from three different laboratories. Thus, it was concluded that the inexistence of axenic plants should be considered in future as a positive aspect in the tissue culture, since this endophytic community can give agronomical traits to different crop species.

O cultivo in vitro de plantas possibilita o controle de fatores ambientais e nutricionais, facilitando o estudo da interação planta-bactéria e a interpretação de eventuais alterações morfofisiológicas nas microplantas, decorrentes dessa interação. Entretanto, a presença de bactérias endofíticas na micropropagação é quase sempre caracterizada como contaminação microbiana prejudicial, sendo prontamente eliminada com o uso de quimioterápicos. Essa abordagem desconsidera os efeitos benéficos que bactérias endofíticas podem trazer ao desenvolvimento vegetal, aniquilando a possibilidade de se explorar esse potencial no ambiente in vitro. Em geral, devido a sua baixa culturabilidade, as comunidades bacterianas endofíticas requerem o uso de técnicas independentes de cultivo para seu estudo. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo principal comprovar a presença de uma comunidade bacteriana endofítica em microplantas de abacaxizeiro (Ananas comosus (L.) Merrill) cv. IAC Gomo-de-mel consideradas axênicas e os efeitos dessa comunidade na morfofisiologia vegetal após antibioticoterapia. Para tanto, técnicas de PCR-DGGE, PCR-ARISA, clonagem, sequenciamento, análises estruturais e ultraestruturais foram utilizadas. Os resultados evidenciaram que existe uma comunidade bacteriana endofítica composta por membros de Alfa, Beta, gama -proteobactérias, actinobactérias e cianobactérias, que coloniza as microplantas. Os resultados convergentes de PCR-DGGE e PCR-ARISA mostraram que essa comunidade apresentou alteração na sua estrutura e diversidade de acordo com seu nicho de colonização e com o período de cultivo da planta hospedeira, sem renovação de meio de cultura. A ação da antibioticoterapia influenciou a estrutura da comunidade bacteriana, promovendo impactos diferenciados em cada grupo bacteriano avaliado. A antibioticoterapia não promoveu a total eliminação das bactérias endofíticas. Contudo, os tratamentos ocasionaram alterações na comunidade bacteriana, resultando na redução do crescimento de raízes e outras alterações histológicas no sistema radicular das microplantas. As análises ultraestruturais comprovaram a presença de bactérias endofíticas colonizando intracelularmente o mesofilo foliar e o córtex de raízes, mesmo após a antibioticoterapia. Dessa forma, conclui-se que em microplantas de abacaxizeiro assintomáticas existe uma comunidade bacteriana endofítica intracelular, rompendo o principal paradigma da cultura de tecidos vegetais, no qual microplantas são obrigatoriamente axênicas. / The in vitro culture of plants by the control of environmental and nutritional factors, allows the study of the plant-bacteria interaction and the interpretation of possible morphophysiological changes in the microplants, from such interaction. However, the presence of endophytic bacteria in micropropagation is often characterized as harmful microbial contamination, which is promptly eliminated by the use of chemotherapeutics. This approach does not take into account the beneficial effects that endophytic bacteria can bring to the plant development, and annihilates the possibility of exploiting this potential in the in vitro environment. In general, due to its low culturability, endophytic bacterial communities require the use of culture-independent techniques for their study. In this context, this work aimed to prove the presence of bacterial endophytes in pineapple (Ananas comosus (L.) Merrill) cv. IAC Gomo-de-mel microplants considered axenics, and the effects of these in plant morphophysiology after antibiotictherapy. For this, PCR-DGGE, ARISA-PCR, cloning, sequencing, structural and ultrastructural analysis were used. The results showed that there is an endophytic bacterial community, composed of members of , , -proteobacteria, actinobacteria and cyanobacteria, which colonizes the microplants. The converging results of PCR-DGGE and ARISA-PCR showed that this community changed in its structure and diversity according to its niche of colonization and the period of cultivation of the host plant, without renewal of culture medium. The action of antibiotics influenced the bacterial community structure, promoting differential impacts on each bacterial group evaluated. Antibiotictherapy did not promote the total elimination of endophytic bacteria. However, the treatments caused changes in bacterial community, resulting in reduced growth of roots and other histological changes in the root system of the microplants. The ultrastructural analysis confirmed the presence of endophytic bacteria colonizing the intracellularly the leaf mesophyll and the cortex of roots, even after antibiotictherapy. Thus, it is concluded that in asymptomatic pineapple microplants there is an intracellular endophytic bacterial community, breaking the main paradigm of plant tissue culture, in which axenic microplants are mandatory.

O trabalho realizado constitui uma estratégia em Biotecnologia de Plantas para a investigação dos esquemas bioquímicos controladores da diferenciação celular no processo de enraizamento. Através da técnica da cultura de tecidos \"in vitro\" foram micropropagados clones de Eucalyptus grandis HILL ex MAIDEN (GO 250, GO 682 e GO 669) selecionadas no CEBTEC/USP. Em uma pesquisa preliminar foram estabelecidas e multiplicadas gemas, seguida de testes da composição de meios de cultura para elongação e enraizamento. Foram estudadas diversas possibilidades de balanceamento das substâncias reguladoras de crescimento - ácido indolilbutírico (AIB)/ benzilaminopurina (BAP). Os clones apresentaram comportamentos anatômico-fisiológicos (massa fresca e seca; teor protéico; taxas de multiplicação das brotações epicórmicas, elongação e enraizamento) diferenciados entre si. As frequências de enraizamento mostraram-se superiores às já observadas por outros autores. Foram estabelecidas, ainda, algumas alterações na composição dos meios de cultura empregados. Através de experimentos cinéticos foram determinados os padrões de indução e/ou inibição das enzimas fenilalanina amônia-liase (PAL) e glucose 6-fosfato-desidrogenase (G-6P-DH) importantes para a biossíntese de compostos flavonóides, considerados como os principais cofatores das auxinas endógenas no complexo iniciador do enraizamento. Verificou-se que embora o suprimento exógeno crescente de AIB tenha resultado em maiores taxas de enraizamento, as atividades da PAL e G-6P-DH não se mostraram significativamente alteradas. Contudo, foi observado também que as gemas que enraizaram apresentaram atividade da PAL significativamente superior, evidenciando maior fluxo do Metabolismo do Fenilpropano durante o enraizamento. / This study constitutes a strategy in Plant Biotechnology with the purpose to investigate the regulating biochemical development of the cellular differentiation in the rooting process. Through plant tissue culture \"in vitro\" technique, clones of Eucalyptus grandis Hill ex Maiden (GO 250, GO 682 e GO 669) selected at CEBTEC/USP, were micropropagated. In a preliminary study shoots were multiplied, followed by tests of media culture composition for shoot elongation and root initiation. Several possibilities and rates of plant growth regulators, indolilbutyric acid (IBA)/benzylaminopurine (BAP) were studied. The clones showed different anatomic-physiological behaviours (fresh and oven-dry weight; proteic content; epicormic shoots multiplication rates, elongation and rooting). The frequences of rooting were higher than those described by other authors. Some modifications in the composition of used cuIture media were also defined. Through kinetic experiments, induction and inhibition patterns of phenylalanine ammonia-lyase (PAL) and glucose 6- phosphate-dehydrogenase (G-6P-DH) important to the biossyntesis of flavonoid compounds were determined. They were considered as the main cofactors of endogenous auxins in the root stimulating complex. Although, the increasing exogenous supply of AIB resulted in higher rooting rates, the activities of PAl and G-6P-DH enzyme did not present alterations. However, it was also observed that shoots wich rooted, in the treatments, showed higher PAL activity. resulting in higher flux of phenylpropanoid metabolism during the rooting.

A presença de bactérias na base de microplantas estabelecidas in vitro, acarreta o descarte da cultura, tornando a técnica onerosa. Entretanto, há de se considerar que nem sempre a presença dos microrganismos afeta o desenvolvimento das plantas em diferentes fases da micropropagação, inferindo que essas colônias são resultantes de exsudações de endófitos da espécie cultivada. Neste contexto, o presente trabalho visou verificar as possíveis influências da manifestação bacteriana endofítica no desenvolvimento in vitro de clones de Eucalyptus benthamii. Para tanto, foram útilizados quatro clones (BP101; BP115, BP118 e BP120), em duas etapas de desenvolvimento: multiplicação e alongamento e, embora o processo in vitro fosse o principal foco da pesquisa, as análises estenderam-se para a fase de aclimatização, ou seja, desenvolvimento ex vitro. As microcepas foram mantidas in vitro sob dois tipos de manifestações bacterianas, as quais por sua vez, foram distintas quanto à coloração em: manifestação de colônias amarelas e manifestação de colônias brancas e, o controle, sem manifestação. Para compreender o desenvolvimento das microplantas na presença dos microrganismos, foram avaliados os parâmetros referentes ao incremento em massa seca, número de brotações, brotações alongadas e enraizamento, bem como características anatômicas e bioquímicas (produção de malondealdeído e teor de nitrogênio) das mesmas. Por meio da identificação molecular por BOX-PCR os isolados bacterianos foram agrupados e posteriormente identificados por sequenciamento parcial do gene 16S rRNA. As linhagens bacterianas identificadas foram analisadas quanto à produção de AIA e fixação de nitrogênio, sendo as linhagens com os melhores resultados utilizadas na bacterização de microcepas de duas diferentes espécies de eucalipto (E. benthamii e E. cloeziana). Os resultados evidenciaram que nem toda presença microbiana in vitro é prejudicial às plantas micropropagadas, pelo contrário, observou-se que na maioria dos casos em E. benthamii, as manifestações possuem efeito neutro ou benéfico, promovendo o desenvolvimento das microplantas. As manifestações brancas e/ou amarelas constituíam uma associação de bactérias, com alta especificidade na interação endófito/microplanta. As análises moleculares identificaram similaridade com seis gêneros bacterianos: Curtobacterium (Actinobacteria), Bacillus e Aneurinibacillus (Firmicutes), Delftia (Betaproteobacteria), Bradyrhizobium, e Novosphingobium (Alphaproteobacteria), onde alguns deles mostraram-se comuns nos diferentes clones, sendo a Curtobacterium presente em todas as manifestações de todos os clones de E. benthamii analisados. Os resultados obtidos com a bacterização de diferentes espécies de eucalipto reforçam a especificidade da microbiota endofítica manifestada com seu hospedeiro, uma vez que a introdução de um isolado (inóculo) pode ocasionar alteração no equilíbrio do sistema de interação estabelecido, acarretando na redução ou simplesmente mantendo estável a taxa de crescimento das microplantas. Dessa forma, diante do atual panorama das biofábricas, as quais descartam inúmeras microplantas cultivadas in vitro em decorrência das manifestações bacterianas, evitar o descarte das microcepas e controlar sua manifestação, representa minimizar consideravelmente os prejuízos para as empresas e setores de pesquisas. / The occurrence of bacteria growing together with microplants in vitro conditions frequently lead to discard of the material, increasing the costs on the micropropagation techniques. However, the microorganisms presence on the bacterial cultures do not always affect the plant development during the different phases of micropropagation because the bacteria colony probability are originated from self microplants as endophytic manifestations. This study evaluated the possible influences of the endophytic bacterian manifestation in the development of Eucalyptus benthamii growing on in vitro conditions. To access the evaluations were used four clones (BP101, BP115, BP118 e BP120) in two phases of microplants in vitro development: multiplication and elongation. The microstumps were grown under two different kinds of bacterial manifestations, distinguishable by colors in: white colony manifestations, yellow colony manifestations and no manifestations (control). To elucidate the microstumps development under the microorganisms presence, were evaluated referent parameters to the dry mass increasing, number of shoots, elongated shoots and rooting, as well as anatomical and biochemical characteristics alterations (malondialdehyde and nitrogen content). After bacterial isolation, they were grouped and identified by BOX-PCR, using partial sequencing of 16S rRNA gene. On the sets of the identified bacteria were analyzed for the AIA production and the nitrogen fixation, and those with better results were used to bacterizate another microstumps of two different Eucalyptus species (E. benthamii and E. cloeziana). The results indicate that the presence of in vitro microrganisms and microstumps together not always affect negatively the plant development. In opposite, bacterial manifestations brought benefits, stimulating the microstumps growth or do not affecting the growth of E. benthamii in vitro conditions. Actually, the white and yellow manifestations represents clusters of different bacteria, with high specificity in the interaction microstumps and endophytic. Molecular approaches identified through similarity analysis, six bacterial genus: Curtobacterium (Actinobacteria), Bacillus and Aneurinibacillus (Firmicutes); Delftia (Betaproteobacteria), Bradyrhizobium and Novosphingobium (Alphaproteobacteria). The occurrences of several of the bacteria were common among some clones, and Curtobacterium was present in all clones of E. benthamii analyzed. The results obtained by bacterization of two different Eucalyptus species confirmed that there is a high specificity between endophytic microorganisms\" manifestations and its host plants, because the artificial bacteria introduction can causes alterations on the equilibrium of the establishment system of plant-microorganism interactions, reducing or stabilizing growth rates on microstumps. Considering the current situation about the biofactories, which usually discard great amount of cultivate microplants in vitro because of the bacterial manifestation, it´s possible avoid these plant discard and make a control of their manifestations, with the intention to minimize substantially the losses in biofactories and also in research laboratories.

Embora desfrute de inegável importância econômica, os citros estão sujeitos a muitos problemas sanitários sendo alguns, limitantes para o cultivo como é o caso das doenças causadas por vírus. A morte súbita dos citros é uma doença relacionada à combinação copa/ porta-enxerto e manifesta sintomas na região da enxertia sobre porta-enxertos intolerantes. Embora sua etiologia não tenha sido determinada, há indicações que a causa da MSC esteja relacionada a uma estirpe do vírus da tristeza dos citros (CTV), a um vírus do gênero Marafivirus, ou a uma associação entre eles. Uma vez que a transformação genética têm sido considerada como uma ferramenta auxiliar a programas de melhoramento de citros, o objetivo deste trabalho foi obter plantas transgênicas de limão \'Cravo\' e laranja \'Valência\' contendo o gene da replicase do Marafivirus e estudar a regeneração e obtenção de plantas in vitro de laranja azeda, via organogênese, visando futuros trabalhos de transformação genética. Experimentos para indução da organogênese in vitro foram realizados avaliando-se citocininas (BAP, TDZ e CIN), em diferentes concentrações, isoladamente ou em combinação com ANA, condições de luminosidade (fotoperíodo de 16 h e escuro por 30 dias), meios de cultivo e explantes (provenientes de plantas germinadas in vitro e de plantas mantidas em estufa). Além disso, avaliou-se o enraizamento dos brotos regenerados. Para a transformação genética, explantes de limão \'Cravo\' e laranja \'Valência\' foram inoculados e co-cultivados com a estirpe EHA 105 de Agrobacterium tumefaciens contendo o gene da replicase do Marafivirus (em seqüência sense e antisense interligadas por um íntron). A construção gênica foi elaborada a partir do plasmídeo pCAMBIA 2201, dirigidas pelo promotor 35S e terminador NOS, contendo ainda o gene de seleção nptII. A transformação foi confirmada por análises de PCR e \'Southern blot\'. A transcrição do gene foi avaliada por RT-PCR e \'northern blot\'. A adição de BAP, combinada ou não com ANA, e em combinações com CIN ao meio de cultivo, assegurou maior formação de gemas adventícias em segmentos de epicótilo de laranja azeda. Entretanto, TDZ não se mostrou favorável a essa resposta, que também é afetada pela ausência de luz. Os explantes provenientes do cultivo in vitro mostraram-se mais favoráveis à resposta organogênica. O enraizamento das brotações de laranja azeda regeneradas foi obtido no meio MT com metade da concentração de sais, sem ou com auxinas. Foi possível obter plantas transgênicas de limão \'Cravo\' e de laranja \'Valência\' contendo o gene da replicase do Marafivirus utilizando-se segmentos internodais como explantes. A análise de \'Southern blot\' confirmou a integração de um a quatro eventos de inserção do transgene no genoma das plantas. A transcrição do gene da replicase do Marafivirus e do gene nptII foi observada por RT-PCR. / In spite of great economic importance, the citrus industry is affected by many phytopathological problems some, limiting its cultivation such as virus-caused diseases. The citrus sudden death disease is related to scion/rootstock combinations and manifests symptoms in the grafting area of intolerant rootstocks. Although its etiology has not been determined, there are indications that the cause of MSC might be related to a strain of the Citrus tristeza virus (CTV), to a virus of the Marafivirus group, or to an association of both viruses. Since the genetic transformation has been considered as an auxiliary tool to programs of citrus improvement, the objectives of this work were to obtain transgenic plants of the Rangpur lime and Valencia sweet orange containing the Marafivirus replicase gene and study the in vitro regeneration of sour orange plants through organogenesis, aiming for future work in genetic transformation. Experiments for induction of in vitro organogenesis were carried out evaluating citocinins (BAP, TDZ and KIN), in different concentrations, separately or in combination with NAA, lighting conditions (photoperiod of 16 hours and darkness for 30 days), cultivation media and explants (coming from in vitro germinated plants and from green house cultivated plants). Besides this, rooting of the regenerated shoots was evaluated. For the genetic transformation, Rangpur lime and Valencia sweet orange explants were inoculated and co-cultivated with the EHA-105 Agrobacterium tumefaciens strain containing the Marafivirus replicase gene (in sense and antisense sequence linked by an intron). The genetic construct used derived from the pCAMBIA 2201 plasmid, driven by the 35S promoter and NOS terminator, containing the selection nptII gene. The genetic transformation was confirmed by PCR and Southern blot analysis. The gene transcription was evaluated by RT-PCR and northern blot. The addition of BAP to the culture medium, combined or not with NAA, and in combinations with KIN, assured a greater formation of adventitious buds in sour orange epicotyl segments. However, TDZ was not favorable to this response, that is also affected by the absence of light. Explants coming from in vitro cultivation were more favorable to the organogenic response. Rooting of sour orange regenerated shoots was obtained in MT medium with half the salt concentration, with or without auxin. It was possible to obtain transgenic Rangpur lime and Valencia sweet orange plants containing the Marafivirus replicase gene using internodal segments as explants. The Southern blot analysis confirmed the integration of one to four copies of the transgene in the plant genome. The transcription of the Marafivirus replicase gene and the nptII gene was observed by RT-PCR.

Pelas qualidades silviculturais e da madeira, o Eucalyptus citriodora apresenta-se como uma excelente espécie para usos múltiplos, destacando-se a extração de óleo essencial para indústria de perfumaria e desinfetantes. Entre as espécies de eucalipto é a que apresenta madeira de alta densidade, dependendo das condições edafoclimáticas e procedência. Porém, as limitações referentes à disponibilidade de sementes e dificuldades de enraizamento de estacas e miniestacas inviabilizam sua multiplicação comercial. Sendo assim, a utilização da micropropagação objetiva acelerar os métodos convencionais de clonagem, de genótipos selecionados. Brotações com uma a três gemas de aproximadamente 1,5cm, foram transferidas para três diferentes meios básicos de cultura, MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), WPM (LLOYD; MCCOWN, 1980) e JADS (CORREIA et al., 1995), suplementados a cada subcultivo com concentrações combinadas e crescentes de benzilaminopurina (BAP- 0,025; 0,05 e 0,50mg L-1) e ácido naftalenoacético (ANA) (0,0025; 0,005 e 0,050mg L-1), sendo que para a maior concentração de ambos os fitorreguladores foram realizados 4 subcultivos, totalizando 6 subcultivos. Vinte repetições de cada tratamento foram separadas para avaliação dos parâmetros fisiológicos (peso da matéria fresca, peso da matéria seca e número de brotos por cepa), avaliação da aparência por nota e análise química do teor nutricional. O experimento foi conduzido no delineamento inteiramente casualizado em arranjo fatorial (3x3x3x3), testando-se três clones, três meios de cultura, três concentrações de BAP combinadas com três concentrações de ANA. Os resultados inferiram que as respostas aos diferentes meios de cultura são genótipo-dependentes em relação às concentrações salinas, relacionando as exigências nutricionais do material genético e a relação auxina/citocinina à produção de matéria seca. A multiplicação das microcepas é influenciada por fatores epigenéticos, que atuam no aumento do vigor, tamanho das folhas, número e homogeneidade das brotações / By its silvicultural qualities, Eucalyptus citriodora presents itself as an excellent species for multiple uses, especially the essential oil extraction for fragrance and disinfectants industry. Among Eucalyptus species, this has high wood density, depending on environmental conditions and provenance. However, limitations related to seed available and difficulties with cuttings rooting make unfeasible its commercial multiplication. Thus, the use of micropropagation aims to accelerate conventional methods of selected genotypes cloning. Shoots with one to three buds with about 1.5 cm length were transferred to three different basic culture media, MS (Murashige and Skoog, 1962), WPM (Lloyd and McCown 1980) and JADS (Correia et al. 1995), supplemented to each subculture with combined increasing concentrations of benzylaminopurine (BAP- 0, 025, 0.05, and 0.50 mg L-1) and naphthaleneacetic acid (NAA) (0.0025, 0.005 and 0.050 mg L-1), and the highest concentration of both regulators were performed during four subcultures, totaling 6 subcultures. Twenty replicates of each treatment were separated for assessment of physiological parameters (fresh weight, dry oven weight and number of shoots per microstumps), appearance evaluation by note and chemical analysis of mineral nutrient content. The experiment was conducted in a completely randomized factorial design (3x3x3x3), testing three clones, three culture media, three concentrations of BAP combined with three concentrations of NAA. The results inferred that the response to the different culture media are genotype-dependent to salt concentrations, relating the nutritional requirements of the genetic material and the relationship auxin/cytokinin production of dry matter. The multiplication of microstumps is influenced by epigenetic factors, which act to increase the strength, size of leaves, number and homogeneity of shoots.