Les virophages sont des petits virus à ADN possédant une capside icosaédrique de 50-60 nm et un génome de 17 à 26 Kb codant potentiellement pour une vingtaine de gènes. Ils ont été découverts associés à des grands virus à ADN appartenant à l’ordre des Megavirales, pour lesquels leur présence serait délétère.Le premier projet du travail de thèse a été de faire le bilan des propriétés connues des virophages au travers d’une revue. La deuxième partie correspond à un bilan des avancées en matière d’isolement de virus géants dans les amibes – hôtes naturels des Mimiviridae –, pouvant être associés aux virophages. La troisième section se focalise sur la réplication des virophages Sputnik avec différents virus parmi les Mimiviridae, ainsi que sur l’isolement d’une nouvelle souche de Sputnik sans son hôte natif par l’utilisation d’un Mimiviridae en tant que virus rapporteur. La dernière partie est enfin basée sur l’identification d’un nouveau virophage – Zamilon – isolé en association avec un Mimiviridae du groupe C, et présentant une spécificité d'hôtes restreinte. Celle-ci est d'ailleurs étudiée.Les résultats présentés dans cette thèse démontrent une certaine complexité des interactions entre les virophages et leurs hôtes. Au sein d’une même famille d’hôtes, certains virophages possèdent un large spectre de spécificité, alors que d’autres ne peuvent se multiplier qu’avec certains d’entre eux, comme cela a déjà été observé chez les bactériophages. Compte-tenu de leur impact potentiel sur les virus géants, ces résultats soutiennent l’hypothèse d’une régulation des populations virales environnementales par les virophages. / Virophages are small DNA viruses with a 50-60 nm width icosahedral capsid encompassing a 17 to 26 Kb genome, putatively coding approximately 20 genes. They have been discovered in association with large DNA virus belonging to the order of the Megavirales, for which they are noxious.The first project of this thesis work was to recapitulate in a review the known features of the virophages. The second part corresponds to a summary of the advances in the field of giant viruses isolation in amoebas – the common hosts of Mimiviridae –. The third section is focused on the replication of the Sputnik virophages with viruses belonging to the Mimiviridae, and on the isolation of a new Sputnik strain with a Mimiviridae reporter instead of with its natural viral host. Finally, the last part is based on the identification of a new virophage – Zamilon – isolated in combination with a group C Mimiviridae, and exhibiting a restricted spectrum of specificity. The latter is herein studied.The results described herein show the complexity of the interactions between virophages and their giant hosts viruses. Within the same host family, some virophages have a broad-range host spectrum whereas others are limited to some viruses, a feature already described for bacteriophages. Regarding the potential impact of the virophages over their host viruses, these results support the hypothesis of a virophages’ major role in a regulation of viral populations in environment.

Mimivirus est le 1er virus géant découvert. Quelques années plus tard une nouvelle entité́ biologique a été décrite, les virophages. Si leurs principales caractéristiques sont maintenant bien définies et acceptées, leur position dans le monde viral ainsi que les interactions qu’ils pourraient avoir avec leur virus-hôte sont encore discutées. La famille des virophages s’élargit. Dans cette optique, le premier objectif de thèse a été de faire un bilan des propriétés connues des virophages au travers d’une revue de la littérature scientifique. La deuxième section repose sur l’analyse des bases de données métagénomiques à la recherche de séquences de virophages et de Megavirales. En criblant le métagénome Bioreactor, nous avons détecté des séquences étroitement liées au virophage Zamilon. Le génome de ce dernier a été décrit et partiellement assemblé. La troisième partie du travail est basée sur l’étude des interactions entre les Mimiviridae et les virophages. Nous avons observé́ qu’un groupe de mimivirus a développé́ une résistance contre l’infection par le virophage Zamilon. C’est en essayant de comprendre ce mécanisme de résistance jusque-là inconnu dans le monde viral que nous avons décrit pour la première fois un système de défense appelé MIMIVIRE. Enfin, la dernière partie est centrée sur l’étude d’une protéine impliquée dans la traduction chez les mimivirus. Les résultats de ce travail suggèrent que cette protéine régule l'expression d’autres protéines virales. Les éléments inédits présentés dans cette thèse contribuent à soutenir l’idée de l’existence d’une quatrième branche du vivant, distincte des 3 domaines connus. / Mimivirus is the first largest virus described. Some years later, virophage, a new biological entity has been discovered. Virophage is a small virus able to infect other giant viruses for which the presence can be deleterious. If their main features have been widely accepted, their position in the viral world and their interactions with host’s viruses are still discussed. The family of virophages is expanding. The first objective of this thesis work was to summarize the known proprieties and features of virophages through a review paper. The second part refers to the analysis of metagenomic databases in search of virophage and Megavirales sequences. By screening the Bioreactor metagenome, we detected sequences closely related to Zamilon virophage.The genome has been described and partially assembled. The third part was based on the study of the interactions between giant viruses and virophages. We observed that some mimiviruses have developed a resistance against the infection by Zamilon virophage. To understand this mechanism of resistance, we described for the first time a viral defense system called MIMIVIRE. Finally, the last part was focused on the study of a protein involved in the translation apparatus of mimivirus. The results of this study suggest for the first time that a translational protein in mimivirus regulates the expression of their proteins.The results described herein show the potential impact of virophages on their viral hosts and also the complexity of the genetic content of giant viruses. Considering all these elements, we can support the hypothesis that giant viruses belong to a new domain of life, in complement to eukaryotes, bacteria and algae.

L’objectif de cette thèse était d’isoler de nouveaux Mimiviridae dans l’environnement marin à l’aide d’amibes, hôtes potentiels de ces derniers et surtout organismes ubiquistes phagocytaires et connus pour être parasités par des microorganismes pathogènes. Après la mise en place et la validation de protocoles d’échantillonnages et de mise en culture de prélèvements environnementaux, plusieurs échantillons ont été analysés. Un nouveau membre de la famille des Mimiviridae a été isolé à partir d’un échantillon marin côtier provenant du Chili, stocké dans un milieu enrichi en amidon (milieu riz, propice à la conservation voire à la production de virus) puis mis en coculture dans une souche d’amibe Acanthamoeba griffini. Le séquençage de son génome révèle 1260 kb, codant pour 1120 protéines putatives, ce qui en fait le plus grand génome viral connu. Nommé megavirus chiliensis, sa capside est icosaédrique et possède également des fibrilles comme Acanthamoeba polyphaga mimivirus tout en étant plus grande (diamètre apparent 520 nm vs 450 nm). Bien que les morphologies des deux virus soient similaires et que de nombreuses particularités de mimivirus soient conservées chez megavirus (stargate), 23 % des protéines de megavirus n’ont pas d’homologues chez mimivirus, et les 594 gènes orthologues partagés présentent une identité résiduelle moyenne de 50 %. De plus, megavirus présente 3 amino-acyl-ARNt-synthètases supplémentaires (IleRS, TrpRS et AsnRS) à celles de mimivirus. Ces résultats suggèrent que ces deux virus sont issus d’un génome cellulaire ancestral qui a évolué par réduction génomique. Un parasite intracellulaire obligatoire a également été isolé à partir d’échantillons de sédiments marins de la côte chilienne. Des observations au microscope électronique à transmission indiquent une forme ressemblant à une endospore, de taille très variable (de 400 nm jusqu’à 1 μm), avec une paroi multicouche épaisse (~60 nm) et un pore apical. Cependant, aucune évidence de division n’a encore été observée, laissant penser que cette entité capable de multiplication pourrait être un virus, sans ressembler aux morphologies connues à ce jour. / In order to isolate new Mimiviridae from the marine environment, we used amoeba -ubiquitous phagotrophic protozoa - as potential host for these viruses. Different sampling protocols were tested and validated before carrying out co-cultures with amoeba and environmentals samples. A new Mimiviridae giant virus was isolated from Chilean coastal seawater completed with rice media (enriched incubation). Produced in Acanthamoeba griffini, its genome sequence has 1,260 Mbp and encodes for 1120 putative proteins, making it the largest known viral genome and thus named Megavirus chiliensis. Its icosaedral capsid is covered with fibrils and its size is bigger than that of Acanthamoeba polyphaga mimivirus (520 nm vs 450 nm). Although both virions are very similar and most of the mimivirus idiosyncrasies are conserved in megavirus (stargate), 23 % of megavirus putative proteins have no mimivirus homologs. Both viruses share 594 orthologous proteins exhibiting an average identity of 50 %. Moreover, megavirus contains 3 additional amino-acyl tRNA synthetases (IleRS, TrpRS and AsnRS) compare to mimivirus. These results suggest that these viruses have evolved from an ancestral cellular genome by reductive evolution. In addition, an amoeba obligatory intracellular parasite was isolated from marine sediments from Chilean coast. Transmission electron microscopic images show a particule like endospore with variable size (from 400 nm to 1 µm), a multilayered outer wall (~60 nm) and an apical pore. No evidence of division was observed, suggesting that the multiplication of this endoparasite occurs without division, suggesting that it could be a virus without any similarity to those described today.

Les membres des familles Mimiviridae et Marseilleviridae, qui infectent et se répliquent dans Acanthamoeba spp. et d’autres protistes phagocytaires, ont été découverts au cours de la dernière décennie et rattachés à un groupe monophylétique de virus nommés les grands virus à ADN nucléocytoplasmiques (NCLDVs), qui infectent un large éventail d’eukaryotes y compris différents organismes unicellulaires. Récemment, il a été proposé de reclasser les NCLDVs dans un nouvel ordre viral nommé les Megavirales. Plusieurs dizaines de virus géants des amibes ont été isolés, mais le génome de peu d’entre eux a été étudié de façon approfondie. Nous avons étudié les génomes de ces virus géants d'amibe afin d’acquérir une meilleure compréhension de leur répertoire de gènes et leur importance évolutionnaire. L'analyse phylogénétique des virus géants d'amibe distingue clairement trois lignées, nommées A, B et C. Nous avons étudié en détail le génome de Acanthamoeba polyphaga moumouvirus, le membre fondateur de la lignée B et avons déchiffré son contenu en gènes et sa relation évolutive avec d'autres organismes. Nous avons également étudié les génomes de Terra1 virus et Terra2 virus, qui appartiennent respectivement aux lignées C et A, et ont été isolés à partir d'échantillons de sol alors que les mimivirus décrits aupravant ont été isolés à partir d'eau douce ou de mer. En outre, nous avons décrit le génome du virus Courdo11, qui appartient à la lignée C, et est étroitement lié au premier Mimivirus isolé d'un humain, qui présentait une pneumonie inexpliquée. / The members of families Mimiviridae and Marseilleviridae, which infect and replicate in Acanthamoeba spp. and other phagocytic protists, were discovered during the past decade and linked to a monophyletic group of viruses named the Nucleocytoplasmic Large DNA viruses (NCLDVs), which infect a broad variety of eukaryotes including diverse unicellular organisms. Recently, it has been proposed to reclassify the NCLDVs into a new viral order named the Megavirales. Several dozens of giant viruses of amoeba have been isolated but the genome of very few has been extensively studied. We studied the genomes of these giant viruses of amoeba to gain a better understanding of their gene repertoire and evolutionary importance. The phylogenetic analysis of giant viruses of amoeba clearly distinguished three lineages, named lineages A, B and C. We studied in detail the genome of Acanthamoeba polyphaga moumouvirus, the leader member of lineage B to decipher its gene content and its evolutionary relationship with other organisms. We further studied the genomes of Terra1 virus and Terra2 virus, which belong to lineages C and A, respectively, and were isolated from soil samples whereas previously described mimiviruses of amoeba were isolated from fresh or marine water. Furthermore, we described the genome of Courdo11 virus, which belongs to lineage C, and is closely related to the first mimivirus isolated from a human, who exhibited unexplained pneumonia.

The sujet de cette these portait sur la caractérisation de la machinerie originale utilisée par les Mimiviridae pour glycosyler les fibrilles entourant leurs capsides en travaillant sur les prototypes des 3 lignées connues, Mimivirus (A), Megavirus chilensis (B) et Moumouvirus australensis (C). Les fibrilles de Mimivirus sont décorées par 2 polysaccharides différents :l’un est caractérisé par la répétition d’un disaccaride linéaire fait de 3)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→, avec un pyruvate branché en position 4,6 du GlcNAc ; l’autre présente une unité répétée branchée de séquence 2)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ pour le squelette linéaire et du rhamnose branché en position 3 par de 2OMeVioNAc. Nous avons suggéré que les fibrilles de Megavirus sont décorées par plus d'une espèce de polysaccharides/oligosaccharides, donc l’un ayant présentant un trisaccharide de RhaNAc:α-L-4OMe-RhaNAc-(1→3)-α-L-RhaNAc-(1→3)-α-L-RhaNAc-(1→. Les fibrilles de Moumouvirus sont décorées de glucosamine, quinovosamine et bacillosamine. A partir de ces données expérimentales il devenait possible de rechercher de nouveaux gènes responsables de ces glycosylations spécifiques. Le cluster de 9 gènes déjà publié de Mimivirus a pu être étendu à 13 gènes. Un cluster de 14 gènes a été d’autre part identifié dans le génome de Moumouvirus, le premier cluster de gènes de la glycosylation identifié dans la lignée B. Parmi les gènes de glycosylation, l’analyse fonctionnelle in vitro de la protéine L142 a permis de démontrer qu’il s’agit d’une N-acétyltransferase. En conclusion, les fibrilles des Mimiviridae sont lourdement glycosylées and le type de sucres et leur organisation dépend de la lignée considérée. / The aim of this thesis is the study of the innovative glycosylation machinery used by the Mimiviridae family for the glycosylation of the fibrils sourrounding their capsid, using Mimivirus, Moumouvirus australensis and Megavirus chilensis as prototypes of lineages A, B and C, respectively. Mimivirus fibrils are decorated with two distinct polysaccharide: one is characterized by a linear disaccharide repeating unit made of 3)-α-L-Rha-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→, with a pyruvic acid branched at position 4,6 of GlcNAc.; the other has a branched repeating unit with the sequence 2)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ in the linear backbone and rhamnose further branched at position 3 by viosamine methylated at position 2 and acetylated at position 4. We suggested that Megavirus chiliensis fibrils are decorated by more than one polysaccharides/oligosaccharide species, one having this trisaccharide: α-L-4OMe-RhaNAc-(1→3)-α-L-RhaNAc-(1→3)-α-L-RhaNAc-(1→. Moumouvirus australensis fibrils are decorated with glucosamine and quinovosamine in addition to the rare sugar, bacillosamine. Starting from this experimental data, it was possible to identify new genes involved in glycosylation. As a result, the published nine-gene cluster of Mimivirus was extended to thirteen genes. A different cluster of fourteen genes was identified in Moumouvirus australensis, representing the first glycosylation gene cluster identified for the B lineage.Among the glycosylation genes, the function of L142 was investigated in vitro, demonstrating that it is an N-acetyltransferase. To conclude, the fibrils of Mimiviridae are heavily glycosylated and the type of sugars and their organization depends on their lineage.

Namao virus (NV) was associated with mortality in lake sturgeon Acipenser fulvescens reared as part of a conservation stocking program for this endangered species in Manitoba, Canada. The virus itself was large, doubly encapsidated and icosahedral-shaped. Phylogenetic analyses using the major capsid protein showed that NV and other epitheliotropic sturgeon nucleo-cytoplasmic large DNA viruses shared a common evolutionary past and formed a distinct evolutionary lineage within Megavirales. Three PCR tests were developed and their analytical performance was validated for detection of these viruses. Testing of wild sturgeon revealed that NV is endemic in the Nelson River water basin in Manitoba. Bath exposure resulted in transmission of NV to healthy sturgeon. The gills appeared to be the initial site of infection with virus persisting in the head skin tissue for up to 62 days. The molecular tests will be useful tools for disease management in sturgeon conservation stocking programs. / October 2015

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(理学) / 甲第24083号 / 理博第4850号 / 新制||理||1694(附属図書館) / 京都大学大学院理学研究科生物科学専攻 / (主査)教授 緒方 博之, 教授 高田 彰二, 教授 望月 敦史 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Science / Kyoto University / DFAM