Iron-sulfur clusters, an important class of redox active cofactors, are ligated by protein-based Cys ligands in a variety of nuclearities. Traditionally, these clusters serve as one-electron transfer units, though many clusters are capable of catalytic activity and sensing functions. Recently, a greater number of iron-sulfur clusters with non-Cys ligation have been identified, wherein one or more of the Cys ligands are replaced by an alternative amino acid residue such as His or Asp. In most cases the role of this ligand substitution is unknown. Some hypotheses are that non-Cys ligation may modify reduction potential, allow for proton-coupled electron transfer, or modulate cluster stability. The human mitoNEET protein contains a 1-His, 3-Cys ligated [2Fe-2S] cluster, identified by the presence of a CDGSH peptide motif. MitoNEET is a binding target for the type II-diabetes drug, pioglitazone, and is implicated in controlling mitochondrial iron levels. How exactly mitoNEET functions in the cell is unknown, as is the role its uniquely ligated FeS cluster may play. This thesis uses mitoNEET as a model for the study of non-Cys ligated FeS clusters and their biological function. Protein film voltammetry was used to examine the pH-dependent electrochemical properties of the mitoNEET cluster, indicating that multiple as yet unidentified protonations control redox potential and that drug binding impacts cluster reduction and protonation. Additionally, the effect of reduction and protonation on cluster and protein structure instability was examined through absorbance and circular dichroism measurements, suggesting an important role for cluster lability in protein function. The CDGSH-motif family of [2Fe-2S] cluster-binding proteins was examined using protein similarity networks. This technique highlights the evolutionary relationship among these proteins, and has led to further work examining the DUF1271 domain containing proteins E. coli YjdI and A. vinosum Alvin0680 (a CDGSH-DUF1271 fusion). This work furthers the scientific knowledge of non-Cys ligated Fe-S clusters by improving our understanding of how the mitoNEET His-ligand contributes to proton-coupled electron transfer and cluster instability, and how the broader class of CDGSH-motif proteins is organized.

Présente chez les mammifères, mitoNEET (mNT) est une protéine à centre Fe-S ancrée à la membrane externe de la mitochondrie. Cette protéine dimérique possède un centre [2Fe-2S] par monomère lié de façon atypique à la protéine par trois cystéines et une histidine. Notre équipe a auparavant montré l’implication de mNT dans une nouvelle voie de réparation du centre [4Fe-4S] de l’Iron Regulatory Protein-1 (IRP-1), régulateur majeur de l’homéostasie du fer intracellulaire, par transfert du centre Fe-S de mNT à l’IRP-1 à réparer. Au cours de ma thèse, je me suis focalisée sur la caractérisation in vitro de la réaction de transfert de centre Fe-S de mNT vers une protéine réceptrice modèle, l’apo-ferrédoxine d’E. coli. En combinant des approches de biochimie et biophysique (réalisées en collaboration) à l’aide de protéines purifiées, cette étude a permis de démontrer que mNT agit comme un interrupteur moléculaire : lorsque son centre Fe-S est réduit, la protéine est extrêmement stable et le centre ne peut être ni perdu ni transféré; une fois oxydé, il peut alors être transféré à une protéine réceptrice. La présence d’oxygène n’affecte pas cette réaction même s’il s’agit d’un déterminant majeur de la stabilité de la protéine. De plus, la vitesse de transfert du centre est très sensible au pH, ce qui fait de mNT un senseur de pH. Ces études ont aussi montré que mNT est extrêmement résistante à H2O2 en comparaison à d’autres protéines de transfert de centre Fe-S. J’ai également étudié l’interaction d’une molécule anti-oxydante, le resvératrol-3 sulfate, avec mNT. Pour finir, je me suis intéressée à l’effet du glutathion sur mNT. Acteur majeur de la régulation de l’homéostasie rédox, le glutathion existe sous deux formes: oxydée (GSSG) et réduite (GSH). J’ai alors constaté que le GSH déstabilise fortement mNT à certains pH et peut même se lier à cette protéine. La fonction thiol du GSH et la formation de radicaux sur cette dernière sont clairement impliquées dans la déstabilisation de mNT. / Present in mammals, mitoNEET (mNT) is an Fe-S protein anchored to the outer mitochondrial membrane. This dimeric protein contains a [2Fe-2S] per monomer with an atypical ligation involving three cysteines and one histidine. Previously, our team proposed that mNT is involved in a new pathway dedicated to the reparation of the oxidatively damaged [4Fe-4S] cluster of human iron-regulatory protein-1 (IRP-1)/cytosolic aconitase, a key player of the regulation of cellular iron homeostasis. This reparation occurs via Fe-S cluster transfer from mNT to IRP-1 to repair. In the course of my thesis, I focused on the characterization of cluster transfer reaction from mNT to a model receptor protein, the E. coli apo-ferredoxin. Using purified proteins and combining biochemical approaches with biophysical ones performed in colaboration, this study showed that mNT acts as a redox switch: when the Fe-S cluster is reduced, the protein is extremely stable and it cannot be lost or transferred; when it is oxidized, it can be transferred to a receptor protein. Dioxygen does not affect this transfer reaction whereas this is a major determinant of protein stability. The transfer speed is highly sensitive to pH. Thus, mNT seems to act also as a pH sensor. Moreover, this study shows that mNT is extremely resistant to H2O2 compared to other Fe-S cluster transfer proteins. I also looked at the interaction of an antioxidant molecule, the resveratrol-3-sulfate, with mNT. Finally, I studied the effects of glutathione on mNT. Major player of the regulation of redox homeostasis, glutathione exists under two states: a reduced state (GSH) and an oxidized one (GSSG). I observed that GSH strongly destabilizes mNT at specific pHs and can even directly interact with the protein. The thiol function of GSH and the radical formation on this function are clearly involved in the mNT Fe-S destabilization.

Mitochondrial dysfunction is a phenomenon observed in models of Traumatic Brain Injury (TBI). Loss of mitochondrial bioenergetics can result in diminished cellular homeostasis leading to cellular dysfunction and possible cellular death. Consequently, the resultant tissue damage can manifest as functional deficits and/or disease states. Therapeutic strategies to target this mitochondrial dysfunction have been investigated for models TBI and have shown promising effects. For this project, we tested the hypothesis that mitoNEET, a novel mitochondrial membrane protein, is a target for pioglitazone mediated neuroprotection. To test this, we used a severe Controlled Cortical Impact (CCI) injury model in mitoNEET null and wild-type mice. We then dosed these animals with pioglitazone or NL-1, which is a compound that has a similar structure to pioglitazone allowing us to hone in one the importance of mitoNEET binding. Wild-type animals treated with the mitoNEET ligands, both pioglitazone and NL-1, had improved mitochondrial function, tissue sparing and functional recovery, compared to mitoNEET null animals. In addition to this specific hypothesis tested, our experiments provided insight casting doubt on the central dogma that mitochondrial dysfunction following TBI is the result of vast oxidative damage and consequential irreversible mitochondrial loss. The data from these studies show that when mitoNEET is targeted with pioglitazone at 12 hours’ post-injury, mitochondrial dysfunction can be reversed. Additionally, when bypassing proteins upstream of Complex I with an alternative biofuel, such as beta-hydroxybuterate (BHB), TBI related mitochondrial dysfunction is once again reversed. This leads to novel hypothesis for future work which posits mitoNEET as a redox sensitive switch; when mitoNEET senses changes in redox, as seen in TBI, it inhibits mitochondrial respiration. When targeted with an agonist/ligand or bypassed with a biofuel TBI mitochondrial dysfunction can be reversed. These studies support the role of mitoNEET in the neuropathological sequelae of brain injury, supporting mitoNEET as a crucial target for pioglitazone mediated neuroprotection following TBI. Lastly, these studies propose a mechanism of TBI related mitochondrial dysfunction which can reversed with pharmacological agents.

Das mitochondriale Protein MitoNEET (mNT) wurde erstmals im Zusammenhang mit dem Antidiabetikum Pioglitazon beschrieben, dessen insulinsensitivierenden Effekte teilweise über mNT vermittelt werden. In einem mNT-transgenen Mausmodell zeigte sich unter Hochfettdiät, dass die gesteigerte Expression von mNT im Fettgewebe zu einer extremen Umverteilung der Fettmasse hin zu einer vollständig subkutanen Adipositas führte und die Tiere vor Adipositas-assoziierten Insulinresistenz geschützt blieben. In der vorliegenden Arbeit wurde die mNT-Expression in humanem Fettgewebe im Zusammenhang mit Adipositas und assoziierten Stoffwechselerkrankungen näher untersucht. In einer Kohorte von 234 Patienten wurde die mNT-Expression auf RNA-Ebene in gepaarten (subkutanen und viszeralen) Fettproben mittels RT-PCR quantifiziert. In der anschließenden statistischen Analyse wurde evaluiert, ob die mNT-Expression mit bestimmten Phänotypen oder metabolischen Erkrankungen assoziiert ist, ob Korrelationen mit metabolischen Markern bestehen und ob mNT als Prädiktor für Parameter der Adipositas oder assoziierter Erkrankungen dienen kann. Ergänzend wurde in molekularbiologischen Experimenten der Nachweis der mNT-Expression auf Proteinebene in humanen und murinen Gewebeprobenetabliert. Weiterhin wurde mNT mit Hilfe immunhistochemischer Färbungen von histologischen Schnitten von humanen und murinen Fettgewebeproben sichtbar gemacht. Die Ergebnisse zeigten signifikante negative Korrelationen von subkutaner mNT-RNA mit Parametern wie Gewicht, Bauchumfang, Hüftumfang, subkutaner Fettmasse und freien Fettsäuren. Spezifisch für normalgewichtige Patienten wurde eine signifikante positive Korrelation von subkutaner mNT-Expression und Insulinsensitivität und dem insulinsensitivierenden Fettgewebshormon Adiponektin gefunden. Weiterhin konnte die subkutane mNT-Expression als alters- und geschlechtsunabhängiger Prädiktor für die subkutane Fettmasse, den Bauchumfang und Hüftumfang identifiziert werden. Auf der anderen Seite ist zu erwähnen, dass keine signifikanten Unterschiede bei der mNT-Expression zwischen den untersuchten Subgruppen festgestellt werden konnten. Anders als bei früheren Studien konnte lediglich eine tendenziell höhere subkutane Expression von mNT bei normalgewichtigen Patienten und eine tendenziell höhere viszerale Expression bei adipösen Patienten beobachtet werden. Dies stand im Gegensatz zu den Ergebnissen von Moreno-Navarrete et al., welche bei adipösen Patienten eine signifikante Verringerung der viszeralen mNT-Expression feststellten. Außerdem zeigte sich bei Patienten mit NGT eine erhöhte subkutane sowie viszerale mNT-RNA- und Proteinexpression im Vergleich zu Diabetes-Patienten. Am stärksten ausgeprägt war dieser Unterschied bei vorliegender Adipositas. Die sogenannten „healthy obese“ Patienten hatten eine deutlich höhere viszerale mNT-Expression als adipöse Patienten mit metabolischen Erkrankungen, was ein Hinweis auf den positiven Effekt von mNT bei vorliegender Adipositas sein könnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen auf eine protektive Rolle von mNT in der Entstehung von Adipositas-assoziierten Stoffwechselerkrankungen im humanen Fettgewebe hin. Auf der anderen Seite zeigten die teilweise gegensätzlichen Ergebnisse in Bezug auf andere Studien jedoch auch, dass dieser Zusammenhang vermutlich komplexer ist, als bisher beschrieben. MitoNEET ist aufgrund seiner Rolle bei der Energie-Homöostase und der beschriebenen Effekte auf den Metabolismus weiterhin ein interessanter Angriffspunkt für die Behandlung von metabolischen Erkrankungen. Dennoch sind die Funktion von mNT und die Effekte, die es vermittelt, noch nicht hinreichend geklärt. Gerade wegen seiner zentralen Funktion im mitochondrialen Stoffwechsel ist es notwendig, potentielle Auswirkungen einer Beeinflussung von mNT weiter zu untersuchen und so den Weg für eine therapeutische Nutzung zu ebnen.:Inhaltsverzeichnis Abbildungen Tabellen Abkürzungen 1 Einleitung 1.1 Adipositas 1.1.1 Definition 1.1.2 Folgen der Adipositas 1.1.3 Finanzielle Belastung 1.2 Assoziierte Stoffwechselerkrankungen 1.2.1 metabolisches Syndrom (Prä-Diabetes) 1.2.2 Diabetes Mellitus 1.2.3 Bekämpfung der Ursachen und Folgen von Adipositas 1.3 Fettgewebe 1.3.1 Stoffwechselaktivität 1.3.2 Fettverteilungsformen 1.4 mitoNEET 1.4.1 CISD1 und mitoNEET 1.4.2 Struktur und Funktion von mitoNEET 1.4.3 mitoNEET und Übergewicht 2 Aufgabenstellung 3 Methoden 3.1 Teil 1: Auswahl der Patienten für die Messung der Genexpression von mNT im subkutanen und viszeralen Fettgewebe 3.1.2 Quantifizierung humaner mNT-Genexpression in gepaarten Fettgewebeproben 3.2 Teil 2: Proteinnachweis von mitoNEET 3.2.1 Aufschluss des Gewebes 3.2.2 SDS-PAGE 3.2.3 Western Blot 3.3 Teil 2: Histologie 3.3.1 Anfertigung der histologischen Schnitte 3.3.2 Immunhistologische Färbungen 3.4 WeiterfÜhrende Versuche 3.5 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse 4.1 Zusammenhang zwischen mNT-Genexpression und klinischen Parametern 4.1.1 Vergleich der mNT-Genexpression in Subgruppen 4.1.2 Korrelationsanalyse 4.1.3 Multivariate lineare Regressionsanalyse 4.2 Etablierung der Verfahren zum Nachweis von mitoNEET 4.2.1 Nachweis von mitoNEET in Zell- und Gewebeproben 4.2.2 mitoNEET-Nachweis mittels Immunhistochemie 4.3 Ergebnisse des Nachweises von mitoNEET 4.3.1 MitoNEET-Expression im Fettgewebe verschiedener Adipositasmausmodelle 4.3.2 MitoNEET-Expression in humanem Gewebe verschiedener BMI-Subgruppen 4.4 Immunhistologische Untersuchungen der mNT-Lokalisation 4.4.1 Immunhistologie in humanem Fettgewebe 4.4.2 Immunhistologie im murinen Fettgewebe 5 Diskussion 5.1 Korrelationsnalyse und Lineare Regression 5.2 Mitoneet und Adipositas 5.3 mitoneet und Glukosestoffwechsel. 6 Zusammenfassung der arbeit 7 Literaturverzeichnisis 8 Selbstständigkeitserklärung 9 Curriculum Vitae 10 Danksagung

Les études d'interaction protéine-ligand aident à mieux comprendre la structure et la fonction des protéines. Dans la première partie de la thèse, la cyt bd oxydase a été étudiée. La protéine d'E. coli a été immobilisée avec succès sur des électrodes modifiées par des nanoparticules d'or. Ainsi, un biocapteur électrochimique a été créé, permettant de tester certains inhibiteurs potentiels de cyt bd provenant d’E. coli. Le cyt bd issue de G. thermodenitrificans thermophile a également été étudié. En faisant appel aux spectroscopies IR et Raman ainsi que l’électrochimie, il a été démontré que la protéine est distincte du cyt bd d’E. coli. Une influence mutuelle du pH et de la température sur la catalyse a été aussi démontrée. La deuxième partie de la thèse portait sur la protéine mitochondriale mitoNEET. L'influence du pH et de divers ligands (pioglitazone, resvératrol, ions phosphates) a été examinée. / Protein-ligand interaction studies help to better understand the structure and function of proteins. In the first part of the thesis cyt bd oxidase was studied. The protein from E. coli was successfully immobilised at gold nanoparticles modified electrodes. Thus, an electrochemical biosensor was created allowing testing some potential inhibitors of cyt bd from E. coli. The cyt bd from thermophilic G. thermodenitrificans was also studied. By means of IR, Raman spectroscopy and electrochemistry the protein was shown to be distinct from cyt bd from E. coli. A mutual influence of pH and temperature was demonstrated on the electrochemical and catalytical properties. The second part of the thesis focused on mitochondrial mitoNEET protein. The influence of the pH and various ligands was studied.

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